BMSCs調節TGF-β1/Smad通路對肝硬化大鼠免疫調節功能的作用研究

盧斯霞 胡旭東 高 欣 程 聰 陳 思 （華中科技大學同濟醫學院附屬武漢金銀潭醫院肝病科，湖北省傳染病臨床醫學研究中心，中國醫學科學院武漢傳染性疾病診治研究中心，中國科學院武漢病毒研究所&武漢市金銀潭醫院感染性疾病與健康聯合實驗室，武漢 430010）

TGF-β1 是引起纖維化的關鍵因子，TGF-β1 可激活Smad，從而誘導纖維化相關基因轉錄和翻譯，導致膠原蛋白（collagen，Col）大量表達，參與纖維化過程［1］。近年研究顯示，機體免疫也參與肝纖維化過程，肝纖維化患者體內存在T淋巴細胞亞群改變，具有抗炎作用的T 輔助細胞17（T helper cells 17，Th17）比例提高，而具有抗炎作用的調節性T 細胞（regulatory T cells，Treg）水平則降低［2］。研究顯示，Th17/Treg 平衡受TGF-β/Smad 通路調控［3］。骨髓間充質肝細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）可輕易從骨髓中收集并在體外擴增，并分化為多種細胞類型，且具有免疫耐受優勢，在多種疾病治療中發揮作用［4］。一項臨床研究顯示，通過門靜脈給予BMSCs 可緩解乙型肝炎病毒相關慢性肝衰竭，并保護肝功能［5］。最新研究發現BMSCs可緩解由四氯化碳誘導的肝損傷和纖維化［6］。研究顯示，BMSCs 可誘導Th17/Treg 平衡［7］。但BMSCs 對肝纖維化的影響及作用機制尚不明確。本文主要分析BMSCs 通過TGF-β1/Smad 通路對肝纖維化和免疫情況的影響，為臨床更好地治療肝纖維化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SD 大鼠（SPF 級，雄性，6 周齡，體質量210～230 g，北京維通利華動物公司）；四氯化碳、TRIzol（美國Sigma 公司）；DMEM 培養基和牛血清（美國Gibco-BRL 公司）；Ficoll 密度梯度培養基（德國Biochrom 公司）；FITC 偶聯的抗大鼠CD29 抗體、PE偶聯的抗大鼠CD34抗體以及CYTOMICS FC 500流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）；ELISA 試劑盒、HE染色、Masson染色和TUNEL染色試劑盒（碧云天公司）；Model 680酶標儀、PVDF膜（美國Bio-Rad）；流式細胞儀及小鼠Treg/Th17 表型抗體試劑（美國Becton Dickinson 公司）；免疫磁珠（美國Invitrogen 公司）；組織勻漿機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；PrimeScript-RT 和SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；RIPA 裂解緩沖液（北京Beyotime）；BCA 試劑盒（武漢博斯特生物技術有限公司）；抗體（美國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 分離、純化和鑒定 采用含10%牛血清的DMEM 沖洗大鼠整脛骨和股骨骨髓，根據Ficoll 密度梯度培養基說明書將沖洗的細胞重懸于完全培養基，37 ℃、5%CO2孵育14 d。細胞80%融合時，磷酸鹽緩沖鹽水洗滌2次并消化，為第一代細胞。當細胞傳代到第4代時，分別采用CD29抗體和CD34抗體染色，暗中孵育30 min，流式細胞術鑒定。

1.2.2 大鼠分組、建模和干預 36 只大鼠隨機分為對照組、模型組和BMSCs 組，每組12 只。模型組和BMSCs 組大鼠根據文獻［8］構建肝纖維化模型：將四氯化碳溶于橄欖油，濃度為10%，腹腔注射，1 ml/（kg·次），2 次/周，連續8 周，對照組注射等量生理鹽水。最后1次注射四氯化碳后尾靜脈注射BMSCs（3×106個），移植后第4周處死大鼠進行檢測［9］。

1.2.3 ELISA 檢測肝功能 取大鼠尾靜脈血5 ml，300 r/min離心15 min收集上清，根據試劑盒說明書加入抗體和顯色劑，終止顯色后15 min 內酶標儀檢測450 nm處吸光度，根據標準曲線計算AST和ALT濃度。

1.2.4 HE 染色檢測肝組織損傷 斷頭處死大鼠，收集肝動脈血管組織，多聚甲醛固定48 h，不同濃度乙醇脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，切片（4 μm）。切片水化后制成玻片標本，加入蘇木精孵育5 min，加入0.5%伊紅染色5 min，洗滌后透化，固定，顯微鏡下觀察。

1.2.5 Masson 染色檢測纖維化 將1.2.4 的玻片標本加入Masson 三色染料染色，根據試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察并拍照，IPP 6.0 圖像分析系統計算膠原蛋白體積分數（collagen volume fraction，CVF）=膠原蛋白陽性藍色面積/組織總面積×100%。

1.2.6 流式細胞術檢測Th17和Treg水平 將外周血經過密度梯度離心后抽吸淋巴細胞層，獲得單個淋巴細胞懸浮液。細胞用20 μl預冷的1×BD Mouse Foxp3 緩沖液4 ℃暗室固定30 min，洗滌固定劑并收集細胞，加入200 μl 通透緩沖液37 ℃避光孵育30 min，透化2 次后洗滌細胞，與20 μl 小鼠Treg/Th17 表型抗體試劑或對照抗體室溫孵育30 min，洗掉抗體，重懸，FACSCalibur 流式細胞儀檢測Th17 細胞和Treg占比。

1.2.7 RT-qPCR 檢測mRNA 水平 密度梯度離心法分離單個核細胞，免疫磁珠分離淋巴細胞，TRIzol獲得肝組織及淋巴細胞中總RNA，逆轉錄1 μg RNA為cDNA（42 ℃60 min，70 ℃5 min，4 ℃保存）。采用SYBR Green PCR Master Mix 和PCR 檢 測 系 統 進 行qPCR 實驗（95 ℃10 min，40 個循環，94 ℃15 s，60 ℃1 min，60 ℃1 min，4 ℃保存）。以GAPDH為內參，通過比較循環閾值分析mRNA表達。

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1.2.8 Western blot 檢測蛋白表達 勻漿機均勻研磨肝組織及淋巴細胞萃取總蛋白，BCA 試劑盒測量濃度。分別取40 μg 總蛋白采用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳（PAGE，80～120 V，90 min）。100 mV 恒定電壓下濕轉至PVDF 膜，5%牛血清白蛋白（BSA）中室溫孵育1 h，加入一抗（1∶500 稀釋）4 ℃孵育過夜，洗滌，添加二抗室溫孵育1 h，化學發光試劑顯影，以GAPDH 為內參，Image J 軟件分析目標條帶灰度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，數據以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs 鑒定結果 流式細胞術結果顯示，CD29 和CD90 呈陽性，CD34 呈陰性，提示BMSCs 分離成功（圖1）。

圖1 流式細胞術鑒定BMSCsFig.1 Identification of BMSCs by flow cytometry

2.2 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠肝功能指標的影響 模型組大鼠ALT 和AST 水平顯著高于對照組（P<0.05），BMSCs 組大鼠ALT 和AST 水平顯著低于模型組（P<0.05，表1）。

表1 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠肝功能指標的影響（±s，n=12，U/L）Tab.1 Effect of BMSCs on liver function indexes of liver fibrosis model mice（±s，n=12，U/L）

表1 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠肝功能指標的影響（±s，n=12，U/L）Tab.1 Effect of BMSCs on liver function indexes of liver fibrosis model mice（±s，n=12，U/L）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

AST 109.43±10.64 252.67±25.491）174.82±21.902）86.315 0.000 Groups Control Model BMSCs F P ALT 38.62±421.00 142.35±17.181）85.18±10.442）136.743 0.000

2.3 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠肝組織損傷的影響 對照組大鼠肝組織染色均勻，細胞核呈圓形，排列有序，肝小葉結構清晰；模型組大鼠肝細胞膨大，肝小葉結構損傷，并出現嚴重出血和炎癥浸潤；BMSCs 組大鼠可觀察到肝小葉結構，炎癥浸潤情況較模型組減輕（圖2）。

圖2 HE 染色檢測BMSCs 對肝纖維化模型大鼠肝組織損傷的影響（×200）Fig.2 HE staining to detect effects of BMSCs on liver tissue damage in mice with liver fibrosis（×200）

2.4 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠肝纖維化的影響 紅色為細胞，藍色為被染色的Col 等纖維化組織。模型組大鼠CVF 水平顯著高于對照組（P<0.05），BMSCs 組大鼠CVF 水平顯著低于模型組（P<0.05，圖3、表2）。

表2 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠肝纖維化的影響（±s，n=12）Tab.2 Effects of BMSCs on liver fibrosis in mice with liver fibrosis（±s，n=12）

表2 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠肝纖維化的影響（±s，n=12）Tab.2 Effects of BMSCs on liver fibrosis in mice with liver fibrosis（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

CVF/%0.91±0.12 11.47±1.451）4.82±0.792）159.431 0.000 Groups Control Model BMSCs FP

圖3 Masson染色觀察BMSCs對肝纖維化模型大鼠肝纖維化的影響（×200）Fig.3 Effect of BMSCs on liver fibrosis in mice with liver fibrosis detected by Masson staining（×200）

2.5 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠Col Ⅰ和Col ⅢmRNA 表達的影響 模型組大鼠Col Ⅰ和Col ⅢmRNA 表達平顯著高于對照組（P<0.05），BMSCs 組Col Ⅰ和Col ⅢmRNA 表達顯著低于模型組（P<0.05，表3）。

表3 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠Col Ⅰ和Col ⅢmRNA表達的影響（±s，n=12）Tab.3 Effects of BMSCs on expressions of Col Ⅰand ColⅢmRNA in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

表3 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠Col Ⅰ和Col ⅢmRNA表達的影響（±s，n=12）Tab.3 Effects of BMSCs on expressions of Col Ⅰand ColⅢmRNA in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Col ⅢmRNA 1.22±0.12 5.84±0.551）3.09±0.282）162.799 0.000 Groups Control Model BMSCs FP Col ⅠmRNA 1.43±0.13 6.27±0.451）3.56±0.312）197.357 0.000

2.6 BMSCs對肝纖維化模型大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表達的影響 模型組大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ表達顯著高于對照組（P<0.05），BMSCs 組Col Ⅰ和Col Ⅲ表達顯著低于模型組（P<0.05，圖4、表4）。

表4 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ表達的影響（±s，n=12）Tab.4 Effects of BMSCs on expressions of Col Ⅰand Col Ⅲin liver fibrosis model rats（±s，n=12）

表4 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ表達的影響（±s，n=12）Tab.4 Effects of BMSCs on expressions of Col Ⅰand Col Ⅲin liver fibrosis model rats（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Col Ⅲ0.93±0.09 3.84±0.351）1.89±0.202）162.799 0.000 Groups Control Model BMSCs FP Col Ⅰ0.96±0.09 4.57±0.371）2.04±0.192）197.357 0.000

圖4 Western blot檢測BMSCs對肝纖維化模型大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ表達的影響Fig.4 Western blot detection of effect of BMSCs on expressions of Col Ⅰand Col Ⅲin liver fibrosis model rats

表5 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠TGF-β1 和Smad mRNA表達的影響（±s，n=12）Tab.5 Effect of BMSCs on expressions of TGF-β1 and Smad mRNA in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

表5 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠TGF-β1 和Smad mRNA表達的影響（±s，n=12）Tab.5 Effect of BMSCs on expressions of TGF-β1 and Smad mRNA in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Smad mRNA 1.47±0.13 5.72±0.561）3.01±0.292）165.488 0.000 Groups Control Model BMSCs FP TGF-β1 mRNA 1.51±0.13 5.84±0.541）3.23±0.302）172.148 0.000

2.8 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠TGF-β1/Smad 通路中蛋白表達的影響 模型組大鼠TGF-β1和Smad蛋白表達顯著高于對照組（P<0.05），BMSCs 組TGF-β1和Smad蛋白表達顯著低于模型組（P<0.05，圖5、表6）。

表6 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠TGF-β1/Smad 通路中蛋白表達的影響（±s，n=12）Tab.6 Effect of BMSCs on protein expressions of TGF-β1/Smad pathway in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

表6 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠TGF-β1/Smad 通路中蛋白表達的影響（±s，n=12）Tab.6 Effect of BMSCs on protein expressions of TGF-β1/Smad pathway in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Smad 0.91±0.09 3.06±0.281）1.67±0.162）113.994 0.000 Groups Control Model BMSCs FP TGF-β1 0.86±0.08 3.45±0.331）1.62±0.152）124.715 0.000

圖5 Western blot檢測BMSCs對肝纖維化模型大鼠TGF-β1/Smad通路中蛋白表達的影響Fig.5 Western blot detection of effect of BMSCs on pro?tein expressions of TGF-β1/Smad pathway in liver fibrosis model rats

2.9 BMSCs對肝纖維化模型大鼠Th17/Treg水平的影響 模型組大鼠Th17 水平和Th17/Treg 顯著高于對照組，Treg水平顯著低于對照組（P<0.05）。BMSCs組Th17水平和Th17/Treg顯著低于模型組，Treg水平顯著高于模型組（P<0.05，圖6、表7）。

表7 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠Th17 細胞、Treg 水平的影響（±s，n=12）Tab.7 Effect of BMSCs on Th17 cells and Treg levels in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

表7 BMSCs 對肝纖維化模型大鼠Th17 細胞、Treg 水平的影響（±s，n=12）Tab.7 Effect of BMSCs on Th17 cells and Treg levels in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Th17/Treg 0.19±0.02 1.50±0.101）0.39±0.032）97.390 0.000 Groups Control Model BMSCs FP Th17/%0.95±0.07 3.84±0.271）1.66±0.112）74.785 0.000 Treg/%5.12±0.40 2.56±0.191）4.21±0.352）62.637 0.000

圖6 流式細胞術檢測BMSCs 對肝纖維化模型大鼠Th17細胞、Treg水平的影響Fig.6 Flow cytometry to detect effect of BMSCs on Th17 cells and Treg levels in liver fibrosis model rats

2.10 BMSCs對外周血淋巴細胞TGF-β1/Smad通路的影響 模型組大鼠單個核細胞中TGF-β1和Smad蛋白水平顯著高于對照組（P<0.05），BMSCs 組單個核細胞中TGF-β1 和Smad 蛋白顯著低于模型組（P<0.05，圖7、表8）。

表8 BMSCs 對外周血淋巴細胞中TGF-β1/Smad 通路的影響（±s，n=12）Tab.8 Effect of BMSCs on TGF-β1/Smad pathway in pe?ripheral blood lymphocytes（±s，n=12）

表8 BMSCs 對外周血淋巴細胞中TGF-β1/Smad 通路的影響（±s，n=12）Tab.8 Effect of BMSCs on TGF-β1/Smad pathway in pe?ripheral blood lymphocytes（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Smad 0.87±0.09 3.04±0.281）1.75±0.162）158.406 0.000 Groups Control Model BMSCs F P TGF-β1 0.53±0.06 2.79±0.251）1.27±0.112）163.786 0.000

圖7 Western blot 檢測BMSCs 對外周血淋巴細胞TGF-β1/Smad通路的影響Fig.7 Western blot detection of effect of BMSCs on TGF-β1/Smad pathway in peripheral blood lymphocytes

3 討論

肝纖維化是持續性和慢性肝損傷的結果，肝纖維化過程中，肝細胞凋亡，內皮屏障受損，炎癥細胞被募集，肝星狀細胞被激活，從而導致細胞外基質合成和降解失調，最終導致肝功能衰竭［10-11］。肝纖維化發病機制尚不清楚，研究認為病毒性肝炎、酒精、藥物、代謝性疾病和自身免疫性疾病均可能引起慢性肝損傷導致肝纖維化，肝纖維化若得不到控制會發展為肝硬化甚至肝衰竭，嚴重影響患者生活質量和生命健康，但目前尚無可用于治療肝纖維化的特異性有效療法［12］。尋找可有效緩解肝纖維化的方法具有重要臨床意義。

BMSCs 具有歸巢效應，當組織損傷時，機體中的干細胞會向損傷部位遷移并分泌各種因子保護組織損傷，研究顯示BMSCs 移植可有效緩解肝衰竭，保護肝功能［13］。近年研究發現BMSCs 對組織纖維化也具有緩解作用，如肺纖維化［14］。肝纖維化中，BMSCs 也具有緩解作用，但其效果和作用機制尚不明確。本研究顯示，BMSCs 抑制可明顯緩解肝組織損傷，抑制Col Ⅰ和Col Ⅲ轉錄和翻譯，并抑制纖維化保護肝功能。此外，本研究顯示，BMSCs 也可減少肝組織TGF-β1/Smad通路關鍵蛋白轉錄和翻譯。TGF-β1是纖維化的最關鍵因子之一，其高表達會激活Smad 轉錄功能，從而促進Col Ⅰ和Col Ⅲ轉錄和翻譯，導致肝纖維化［15］。王磊等［16］研究顯示，BMSCs抑制可通過抑制肺組織TGF-β1/Smad信號通路緩解炎癥反應，從而減輕大鼠急性肺損傷。胰腺炎大鼠模型中，BMSCs 也通過調控TGF-β1/Smad 信號通路緩解胰腺組織損傷［17］。BMSCs 也會通過外泌體抑制TGF-β1/Smad 途徑誘導子宮內膜修復［18］。提示四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠模型中，BMSCs可能通過抑制肝組織中TGF-β1/Smad通路從而抑制Col轉錄和翻譯，進而緩解肝纖維化，保護肝功能。

近年研究顯示免疫炎癥反應在肝纖維化進程中發揮重要作用，肝纖維化病理過程中，Th17 細胞比例升高，誘導巨噬細胞、中性粒細胞等活化誘發炎癥反應，并可通過誘導IL-6和TGF-β1表達促進纖維化［19］。Treg 可拮抗Th17 細胞功能，分泌抗炎因子IL-4 和IL-10 等，從而抑制纖維化［20］。本研究顯示，BMSCs移植不僅可誘導Th17/Treg平衡向Treg偏移，還可抑制淋巴細胞TGF-β1/Smad通路。王凱等［21］研究顯示，BMSCs對不同淋巴細胞的影響不同，BMSCs可抑制Th17 細胞增殖并誘導Treg 增殖。BMSCs 可通過分泌鞘氨醇1 調節再生障礙性貧血患者Treg/Th17平衡［22］。也有研究顯示BMSCs通過調節TGF-β相關通路上調Treg水平并下調Th17細胞水平，從而緩解系統性紅斑狼瘡［23］。

綜上所述，BMSCs 可能通過抑制TGF-β1/Smad通路減少肝組織中Col 表達，并誘導Th17/Treg 向Treg 偏移，從而緩解肝纖維化。但BMSCs 抑制肝纖維化的療效仍需臨床研究，其作用機制需進一步探究。