PD-L1阻斷對膿毒癥小鼠T淋巴細胞凋亡及單核細胞功能的影響①

韋金磊 陳建新 張 森 （廣西壯族自治區人民醫院結直腸肛門外科，南寧 530021）

膿毒癥是由細菌感染引起的全身性炎癥應激反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），發病率較高，具體發生機制尚不明確，是導致ICU 患者死亡的主要原因，也是目前全球危重醫學領域研究熱點［1］。研究表明，免疫抑制是膿毒癥晚期最重要的病理變化，膿毒癥患者因免疫系統改變易反復出現全身性嚴重感染［2］。進一步研究顯示，膿毒癥患者器官淋巴細胞凋亡與膿毒癥后期免疫抑制關系密切［3］。CAO 等［4］研究表明淋巴細胞數驟減是免疫功能下降的主要原因。YAO等［5］研究發現阻斷淋巴細胞凋亡可明顯提高膿毒癥小鼠存活率。最新研究表明，單核細胞功能失常在免疫抑制過程中發揮重要作用［6］。初始免疫時，單核細胞產生大量炎癥遞質抵御感染。膿毒癥免疫抑制過程中，單核細胞對感染細菌的功能失常，加劇免疫抑制程度。臨床研究表明，單核細胞可維持促炎功能，明顯縮短患者住院時間［7］。程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡受體-1配體（programmed death-1 ligand，PD-L1）分別為分化簇（cluster of differentiation，CD）家族中的CD279 和CD274，PD-1/PD-L1 通路可通過調節T 淋巴細胞活化及細胞耐受性在免疫調節中發揮關鍵作用［8］。YAGHOUBI 等［9］研究表明，阻斷PD-1/PD-L1 信號通路可明顯增強患者自身免疫功能，縮短結腸癌患者術后康復時間。臨床研究表明，膿毒癥患者T 淋巴細胞表面PD-1 及單核細胞表面PD-L1 表達升高，但PD-1/PD-L1 在膿毒癥中作用的研究鮮有報道［10］。本研究構建膿毒癥小鼠模型，探討PD-1/PD-L1 對T 淋巴細胞凋亡及單核細胞功能的影響，為臨床研究提供證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 30 只8～10 周齡清潔級C57BL/6雄性小鼠，體質量20～30 g，合格證號：TBHS-56-1A-2019，由廣西壯族自治區人民醫院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 胰蛋白酶、麻醉劑（Gibco公司）；抗PD-L1（Santa公司）；ELISA、Western blot試劑盒（德國Rebstock 公司）；IL-6 抗體、TNF-α 抗體、IL-10 抗體（南京建成生物有限公司）；HE 試劑盒、TUNEL 試劑盒（上海碧云天生物技術公司）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）；JSM23510LV 型掃描電鏡（加拿大Visual Sonics 公司）；LIOOS600T 熒光顯微鏡（日本尼康公司）；-80 ℃冰箱（德國維根斯公司）；Leica RM2135 組織切片機（德國Leica 公司）；高速低溫離心機（北京六一儀器廠）；流式細胞儀（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模與分組 小鼠適應性喂養1 周后隨機分為3 組：sham 組、模型組、PD-L1 拮抗組，每組10只，模型組、PD-L1拮抗組小鼠采用盲腸結扎穿孔手術（cecal ligation and puncture，CLP）構建膿毒癥小鼠模型：術前12 h 禁食，10%異氟烷腹腔注射麻醉，仰臥位固定于無菌操作臺，于腹正中行2 cm 縱向切口，牽出盲腸，4號線結扎盲腸根部，14G套管針貫通穿孔（為確保穿刺孔通暢，在穿孔點輕微用力擠出少許大便），將腸管重新放回腹腔，逐層縫合傷口，皮下注射10 ml生理鹽水防止休克［11］。sham 組小鼠暴露盲腸后即縫合傷口，其他操作同上。PD-L1 拮抗組小鼠術后腹腔注射抗PD-L1 抗體（50 μg/只），每6 h 注射1 次，連續4 次，sham 組和模型組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 流式標記法檢測小鼠T 淋巴細胞表面PD-1和單核細胞表面PD-L1 表達 末次注射給藥4 h 后稱重，取小鼠外周抗凝血標本，流式標記法檢測各組小鼠CD3+T 細胞、單核細胞CD11b+表面PD-1、PD-L1表達；頸椎脫臼法處死小鼠，顯微鏡下準確剝離小鼠脾臟和胸腺，稱重，計算小鼠脾臟和胸腺指數=脾臟或胸腺重量/體質量，-80 ℃保存備用。

1.2.3 HE 染色檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織病理學改變 取10%各組小鼠脾臟和胸腺組織，HE染色，切片，光學顯微鏡下觀察各組小鼠心肌組織病理學改變。

1.2.4 電鏡觀察各組小鼠脾臟和胸腺組織超微結構改變 取10%各組小鼠脾臟和胸腺組織，制成0.3 cm×0.5 cm 超薄組織切片，2.5%戊二醛固定8 h，生理鹽水清洗3 次，梯度乙醇脫水，-20 ℃冷凍干燥過夜，掃描電鏡下觀察各組小鼠脾臟和胸腺超微病理結構改變。

1.2.5 TUNEL 染色檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織細胞凋亡 取10%各組小鼠脾臟和胸腺組織，固定，切片，梯度乙醇洗脫，過氧化氫-甲醇浸泡，加入0.1%TritonX-100、0.1% 緩沖液、TUNEL 混合液37 ℃反應1 h，梯度乙醇脫水，封片，顯微鏡下觀察結果。

1.2.6 流式細胞術檢測各組小鼠胸腺組織T 淋巴細胞凋亡 取10%各組小鼠胸腺組織，制成胸腺單細胞懸液，流式細胞儀檢測各組小鼠T 淋巴細胞凋亡情況。

1.2.7 ELISA檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織Caspase-3及血清TNF-α、IL-6 和IL-10 水平 采用ELISA 試劑盒檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織Caspase-3 表達及血清TNF-α、IL-6、IL-10 含量，Varioskan LUX 多功能酶標儀分別測定OD值。

1.3 統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用獨立t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 流式標記法檢測PD-1和PD-L1表達 與sham組相比，模型組小鼠CD3+、CD11b+細胞表面PD-1 和PD-L1表達明顯升高（P<0.05），提示構建模型成功；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠CD3+、CD11b+細胞表面PD-1和PD-L1表達明顯降低（P<0.05，圖1）。

圖1 流式標記法檢測PD-1和PD-L1表達Fig.1 Flow cytometry method to detect expressions of PD-1 and PD-L1

2.2 各組小鼠臟器指數比較 與sham 組相比，模型組小鼠胸腺和脾臟指數明顯下降（P<0.05），提示模型組小鼠免疫功能受限；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠胸腺和脾臟指數明顯升高（P<0.05，圖2），提示PD-L1拮抗組小鼠免疫功能有所恢復。

圖2 各組小鼠臟器指數Fig.2 Organ index of mice in each group

2.3 HE 染色檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織病理學改變 sham 組小鼠脾臟表面有光澤，結構完整，紅髓、白髓界限清晰，脾小體形態和數量正常，脾小結性狀正常，淋巴細胞未見明顯分化分裂現象，細胞分布致密；模型組小鼠脾臟腫脹明顯，體積變大，脾臟結構破壞明顯，紅髓、白髓分界不清，紅髓縮小，白髓區域擴張，濾泡增加，結締組織增加，脾小體明顯減少，脾小結不同程度腫脹，淋巴細胞排列稀疏；PD-L1拮抗組小鼠脾臟可見清晰白髓、紅髓及邊緣區，脾小體數量有所恢復，淋巴細胞數量有所增加，脾臟病理學變化有所改善（圖3A）。sham 組小鼠胸腺可見小葉內梁，分葉清晰，胸腺皮質和髓質結構完整，大小和形態未見異常，細胞密集排列。模型組小鼠胸腺髓質和皮質分界不清晰，細胞稀疏，胸小葉及胸腺小體結構缺失嚴重；PD-L1拮抗組小鼠雖無法辨別胸小葉分區，但皮質和髓質形態較模型組明顯好轉，淋巴細胞數明顯增多（圖3B）。

圖3 各組小鼠脾臟和胸腺組織病理學改變（×400）Fig.3 Pathological changes of spleen and thymus tissues of mice in each group（×400）

2.4 電鏡觀察各組小鼠脾臟和胸腺組織超微結構改變 sham 組小鼠脾臟組織脾索與脾竇相間排列，脾索內網狀支架結構清晰可辨，淋巴細胞、巨噬細胞及紅細胞黏附于網狀支架，菱形或短桿狀內皮細胞平行排列構成穩定的脾竇組織；模型組小鼠脾臟組織脾索與脾竇結構均出現不同程度損傷，部分淋巴細胞從網狀支架上脫落導致局部間質網狀支架裸露，出現較多空洞。淋巴細胞排列散亂、稀松，體積明顯變小；PD-L1 拮抗組小鼠脾臟較模型組明顯改善，淋巴細胞數明顯增多，脾臟內空洞基本消失（圖4A）。sham 組小鼠胸腺組織胸小葉及小葉間隔結構完整，胸腺內淋巴細胞形狀規整，呈圓形，細胞數量豐富，排列致密，未見空洞或凹陷；模型組小鼠胸腺組織胸小葉體積明顯縮小，間隔不清晰，結締纖維組織增生明顯，淋巴細胞排列散亂、疏松，部分淋巴細胞與間質脫離呈空洞結構，部分淋巴與間質徹底脫離出現明顯凹陷；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠胸腺組織胸小葉明顯增大，結構清晰，淋巴細胞基本無脫落現象，排列緊密（圖4B）。

圖4 各組小鼠脾臟、胸腺組織超微結構改變Fig.4 Ultrastructure changes of spleen and thymus of mice in each group

2.5 TUNEL 染色檢測各組小鼠脾臟和胸腺細胞凋亡 與sham 組相比，模型組小鼠脾臟和胸腺組織細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠脾臟和胸腺組織細胞凋亡率明顯降低（P<0.05，圖5）。

圖5 TUNEL染色檢測各組小鼠脾臟和胸腺細胞凋亡Fig.5 TUNEL staining to detect cell apoptosis of spleen and thymus of mice in each group

2.6 流式細胞術檢測各組小鼠胸腺組織T 淋巴細胞凋亡 與sham 組相比，模型組小鼠T 淋巴細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠T淋巴細胞凋亡率明顯降低（P<0.05，圖6）。

圖6 流式細胞術檢測各組小鼠胸腺T細胞的凋亡Fig.6 Flow cytometry to detect apoptosis of thymus T cells of mice in each group

2.7 ELISA 檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10表達 與sham組相比，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10 表達明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，PD-L1拮抗組小鼠血清中促炎分子TNF-α、IL-6表達明顯降低（P<0.05），抑炎分子IL-10 表達明顯升高（P<0.05，圖7）。提示PD-L1 拮抗組小鼠單核細胞功能有所恢復。

圖7 ELISA檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10表達Fig.7 ELISA to detected expressions of serum TNF-α，IL-6 and IL-10 of mice in each group

2.8 PD-L1 與Caspase-3 蛋白關系預測 Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末端剪切酶，是細胞凋亡的執行分子，本研究首先在生物信息學網站http：//genemania.org 數據庫顯示PD-L1 可直接影響Caspase-3表達（圖8）。

圖8 PD-L1與Caspase-3蛋白關系預測Fig.8 Prediction of relationship between PD-L1 and Cas?pase-3 protein

2.9 ELISA 檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織Cas?pase-3 表達 與sham 組相比，模型組小鼠細胞中Caspase-3蛋白表達明顯上升（P<0.05），與模型組相比，PD-L1 拮抗組小鼠Caspase-3 表達明顯下降（P<0.05，圖9）。

圖9 ELISA檢測各組小鼠脾臟和胸腺組織Caspase-3表達Fig.9 ELISA to detect expression of Caspase-3 in spleen and thymus tissues of mice in each group

3 討論

膿毒癥是一種與免疫抑制密切相關的危及生命的器官功能障礙綜合征，常見于外科術后、創傷以及免疫低下等情況，如未有效控制細菌引發的全身性嚴重感染可進一步演變為膿毒癥休克或多器官衰竭綜合征，威脅患者生命［12］。由于其病理生理發病機制尚未明確，尚無有效藥物用于膿毒癥治療，因此解除患者免疫抑制，提高其自身免疫功能在膿毒癥臨床治療中意義重大。

免疫系統包括器官、組織、細胞和效應分子在內的綜合復雜系統，其中脾臟和胸腺是哺乳動物最重要的免疫器官，脾臟是外周免疫器官的關鍵，是機體內最大的淋巴器官，可產生淋巴細胞，胸腺是中樞免疫器官核心，是成熟的T 淋巴細胞主要分布區域，是T 淋巴細胞進行分化、發揮免疫功能的場所。免疫器官臟器指數是衡量免疫系統臟器是否受損的關鍵指標［13］。CHANG 等［14］研究發現，提高膿毒癥大鼠免疫功能可明顯改善膿毒癥引起的器官損傷。黃鑫等［15］研究表明，免疫抑制膿毒癥大鼠脾臟和胸腺受到不同程度損傷，導致免疫功能下降。T 淋巴細胞數量驟減是導致膿毒癥免疫抑制的重要原因。研究表明，提高早期膿毒癥大鼠T細胞水平能明顯改善其免疫功能［16-17］。許志恒等［18］研究發現，提高外周血T淋巴細胞水平能明顯緩解膿毒癥相關肺損傷。本研究中模型組小鼠脾臟、胸腺組織T 淋巴細胞凋亡率明顯升高，抑制T 細胞凋亡可明顯改善脾臟和胸腺組織損傷。

PD-1/PD-L1通路在多種免疫性疾病中發揮關鍵作用［19］。GANE 等［20］研究表明，控制PD-1 抗體用量阻斷PD-1/PD-L1 通路可明顯增強慢性病毒性肝炎患者淋巴細胞功能，提高其抗感染能力。SAGE等［21］研究報道，樹突狀細胞PD-L1 可抑制濾泡性T 細胞分化，導致免疫功能障礙。研究證實，PD-1/PD-L1通路與淋巴細胞凋亡關系密切［22］。但PD-1/PD-L1通路在膿毒癥淋巴細胞凋亡中的作用機制鮮有報道。本研究表明，阻斷PD-L1 后，PD-L1 拮抗組小鼠在膿毒癥病理以及細胞凋亡率方面均有明顯改善。生物信息數據庫顯示，PD-L1 和凋亡蛋白Caspase-3存在調控關系，ELISA 結果表明阻斷PD-L1 可明顯降低膿毒癥小鼠組織Caspase-3表達，推斷阻斷PD-L1可能通過抑制Caspase-3表達抑制T細胞凋亡。

單核細胞在機體炎癥應激中占據核心地位。機體膿毒癥應激過程中單核細胞釋放TNF-α、IL-6和IL-10 等炎癥因子［23］。危重膿毒癥患者單核細胞體外分泌炎癥因子能力下降，直接導致其免疫削弱和病死率提高［24］。陳海龍等［25］研究報道，干預膿毒癥患者單核細胞功能可明顯改善重型膿毒癥患者免疫抑制情況。PD-1/PD-L1 信號通路在誘導和維持外周組織免疫耐受中發揮重要作用，對防止組織過度炎癥反應發生具有積極作用［26］。ELISA 結果表明，阻斷PD-L1 可明顯降低促炎分子TNF-α、IL-6 表達，增強抑炎分子IL-10 表達，說明PD-L1 阻斷可明顯改善膿毒癥小鼠單核細胞功能。

綜上所述，膿毒癥小鼠中，PD-L1阻斷可有效降低T細胞凋亡率，改善其單核細胞功能，但如何將其應用于膿毒癥臨床靶向治療仍需進一步研究。