同位素異位體溯源土壤N2O的方法、技術和展望①

徐 錦，曹亞澄,2*，溫 騰,3,4,5*，張珮儀，張金波,3,4,5，蔡祖聰,3,4,5

同位素異位體溯源土壤N2O的方法、技術和展望①

徐 錦1，曹亞澄1,2*，溫 騰1,3,4,5*，張珮儀1，張金波1,3,4,5，蔡祖聰1,3,4,5

(1 南京師范大學地理科學學院，南京 210023；2 中國科學院南京土壤研究所，南京 210008；3 江蘇省地理信息資源開發與利用協同創新中心，南京 210023；4 虛擬地理環境教育部重點實驗室(南京師范大學)，南京 210023；5 江蘇省地理環境演化國家重點實驗室培育建設點，南京 210023)

土壤是N2O的重要排放來源之一。土壤中N2O產生途徑眾多、受多種因素調控，深入分析土壤N2O產生途徑才能采取針對性的減排策略。穩定同位素技術已廣泛用于研究土壤N2O排放，N2O同位素異位體法是近年來新興的研究方法。該研究方法通過測定土壤N2O的同位素組成(15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O)分析N2O排放貢獻，因無需添加標記物、對土壤系統干擾小、成本低，適合在野外田間研究N2O排放，是15N標記方法的有力補充。本文詳細介紹了N2O同位素異位體法的原理、質譜測定方法、定量分析方法、影響該方法的因素及其應用前景。

N2O同位素異位體；位點優勢值；N2O排放貢獻；同位素比值質譜

鑒于對全球氣候變化的關注日益增加，促進溫室氣體減排已成為熱點研究問題。氧化亞氮(N2O)作為《京都協定書》規定的6種溫室氣體之一，不但會進入平流層破壞臭氧層[1]，還會吸收紅外線造成溫室效應[2]，等摩爾濃度N2O的增溫潛勢是二氧化碳的298倍[3]，且以每年0.73 nmol/mol的速率增加[4]。N2O在大氣中的存在壽命約為118 ～ 131 a[5]，對全球增溫具有長期潛在深遠的影響。據報道，目前全球的總N2O排放量為17.9 Tg/a，在眾多N2O排放源中，農業管理以及自然植被下的土壤構成了全球最主要的N2O來源，其中自然植被土壤N2O 排放量為6 ～ 7 Tg/a，占自然來源的60%，農田土壤N2O排放量為4.3 ～ 5.8 Tg/a，占人為來源的69%[5]。因此，準確估算土壤N2O排放量對于實現全球范圍內N2O的減排具有重要意義。但是土壤N2O排放受多種微生物和非微生物途徑的影響，時空異質性顯著，土壤氮轉化過程極其復雜并具有多種N2O產生途徑[6]，只有深入溯源分析土壤N2O產生途徑才能采取針對性的減排策略，減少大尺度N2O排放量估算的不確定性[7]。

N2O的主要產生過程有反硝化、羥胺氧化、硝化細菌反硝化等[7]。反硝化過程是在無氧或者微氧的條件下，微生物將NO3–、NO2–或者N2O還原為、NO2–、NO、N2O或N2，N2O是反硝化過程的中間產物，在某些條件下是主要最終產物(如：真菌反硝化過程)[8]。羥胺氧化過程中N2O是不同形態氮氧化形成NO3–的副產物，包括自養硝化和異養硝化，其中自養硝化主要由氨氧化細菌、亞硝態氮氧化細菌驅動[9]，將NH4+或NH3經過NO2–氧化為NO3–的過程；異養硝化主要是由一些具有異養硝化能力的真菌和細菌，將有機氮或者NH4+氧化為NO3–的過程。硝化細菌反硝化也是由氨氧化細菌驅動，但有別于自養硝化，是NH4+氧化產生的NO2–進一步還原為N2O和N2[7]。此外，硝酸鹽異化還原為銨過程(DNRA)、化學反硝化過程也產生N2O[10]，但一般認為這些過程對于全球N2O排放的貢獻較小[6]。

迄今為止，不少科學方法已廣泛應用于土壤N2O產生途徑的區分和溯源研究中，主要包括15N通量法[11]、抑制劑法以及穩定同位素法。其中通量法和抑制劑法最早用于區分N2O產生來源，但通量法無法明確N2O產生的過程[2]，抑制劑法常常因為微生物所處生長階段不同而無法完全抑制。近年來穩定同位素技術發展迅速，同位素標記技術(15N標記)和自然豐度技術(18ON2O、15ObulkN2O)開始被廣泛用于區分土壤N2O產生途徑[12-14]。15N標記與數值模型的結合實現了對于土壤N2O產生途徑的量化研究，它能同時結合土壤氮轉化過程初級轉化速率和含氮氣體排放的計量變化，全面研究土壤氮轉化和N2O產生途徑。近期開發的土壤–植物15N示蹤模型，更能為量化土壤–植物系統的氮轉化過程和氮轉化率問題提供可靠方法。與同位素標記技術相比，自然豐度技術也早已用于土壤氮素轉化過程的研究[15]，但在復雜的生態系統中應用15N自然豐度法，易受到氮在庫與庫之間轉化過程中的同位素分餾作用的限制，其定量程度處于較低水平[2]。近年來，一種通過測定N2O同位素異位體及兩個N原子間15N位點優勢值(SP: site preference,15OSPN2O)的新方法[16]，已被廣泛應用于土壤、海洋的N2O溯源分析。與15N標記法和抑制劑法相比，它對原有系統的干擾小，更適合用于野外大尺度研究；與傳統自然豐度技術相比，它在N2O產生過程中不受底物的同位素組成影響。而且不同的N2O產生過程，15OSPN2O具有一定的差異性[16-17]；15OSPN2O與18ON2O、15ObulkN2O值結合，還能為N2O產生途徑的溯源分析提供更多信息，在適合的同位素數值模型輔助下，可實現大田和區域尺度上量化土壤N2O各產生途徑的排放貢獻。

1 N2O的同位素異位體和位點優勢值

國際純粹應用化學聯合會(The International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC)于2011年將一組被重同位素取代的數量不同或者被重同位素取代的位置不同的分子，定義為同位素異位體(isotopocule)，它是“isotopically substituted molecules”的縮寫。因為每種元素往往有不止一種穩定同位素，所以一種化合物通常具有多種不同的同位素異位體[18]。N2O分子是一個由一個O原子和兩個N原子形成的三原子非對稱直線型結構，其中N元素有14N、15N兩種穩定同位素；O元素有16O、17O、18O三種穩定同位素，理論上，N2O分子有12種同位素，但實際上自然豐度表現出明顯差異的同位素異位體僅5種[19]。

由于N2O是一個不對稱分子，位于中心和末端的N原子被稱為α-N和β-N[18]或者1-N和2-N[20]，也有用456和546來表示N2O的兩個重要的同位素異位體14N15N16O和15N14N16O[21]。在N2O形成過程中，兩個NO–會結合形成次硝酸鹽狀中間體(–O–N=N–O–)[17]，隨后一側的N–O鍵斷裂形成N2O分子，斷鍵側的N原子位于β位，未斷鍵側的N原子位于α位；而在N2O還原為N2的過程中另一側的N–O鍵也斷裂形成N2。由于較重的同位素原子移動性較弱具有較高的結合能(如15N–16O鍵相較于14N–16O鍵結合能更高，所以14N–16O鍵更易斷裂)，且土壤微生物和酶對于N–O鍵的斷裂也有影響，所以在N2O的產生和還原過程中兩次斷鍵的差異，可能會導致15N在兩個N原子上的分布差異[22]，這個差異就稱為位點優勢值。在N2O分子中15Nα、15Nβ、15Nbulk和15OSPN2O值之間的換算關系如下[18]：

式中：15Nbulk表示兩個N原子上的15N豐度的平均值；15Nα和15Nβ分別表示中心和末端N原子上的15N豐度。

在生成N2O的過程中，由于各個途徑受到不同微生物和酶調控的影響，產生的15OSPN2O值也會存在差異，這些差異可為溯源分析土壤N2O產生途徑提供理論基礎。

2 同位素異位體方法溯源N2O產生途徑的基本原理

穩定同位素方法進行溯源研究的主要依據是，任何一種元素的同位素組成都可以提供來源和形成過程信息。有關來源的信息往往依賴于元素本身獨特的同位素組成，所以在傳遞過程中具有特征性，而包含形成過程的信息往往受同位素分餾作用的影響在傳遞過程中容易丟失而喪失過程特征性[22]。但是，體現N2O分子中15N在兩個N原子上分布差異的15OSPN2O不受基質同位素組成的影響，且在N2O產生過程中15OSPN2O可以保持不變，這一特點使得15OSPN2O成為溯源N2O產生途徑的一個重要指標[23]。

Sutka等[24]率先通過純培養試驗發現，自養硝化過程和細菌反硝化過程產生N2O的15OSPN2O存在特征性且差異明顯，這一發現在野外和土壤培養試驗中多次被證實。之后，又發現真菌反硝化和細菌反硝化的15OSPN2O也存在明顯差異[25]。表1是目前基于純培養試驗得到的不同產生途徑N2O的15NbulkN2O、18ON2O和15OSPN2O值，可以發現不同N2O產生途徑的15OSPN2O值大致可以分為兩大類：第一類是硝化細菌反硝化和反硝化途徑(簡稱N2OD)，數值較小，一般在–5.4‰ ～ 2.2‰；第二類是自養硝化、真菌反硝化、化學反硝化和AOA等途徑(簡稱N2ON)，數值較大，一般在28.8‰ ～ 36.8‰[16]。15OSPN2O值的這種差異與N2O產生過程的酶調控機制有關。以NH2OH氧化還原酶(HAO)和NO還原酶(NOR)為例，二者都包含血紅素或非血紅素鐵(Fe)原子的催化中心。HAO酶具有一個中心Fe原子[36]，在N2O形成過程中NH2OH分子順序與同一個Fe原子中心結合，最終產物N2O中的中心(α)和末端(β)N原子分別來自第二個和第一個結合的NH2OH分子，因同位素分餾效應，第二個結合的NH2OH分子中15N較第一個結合的NH2OH分子富集，因此該過程產生N2O的15OSPN2O值較大。然而細菌NOR酶具有兩個Fe原子(雙核中心)且酶之間具有相似性[37]，兩個NO分子可同時與之結合形成次硝酸鹽狀中間體(–O–N=N–O–)，因產生N2O分子的兩個N原子幾乎同時形成，15OSPN2O值接近于零。真菌NOR酶(P405)的催化中心僅具有單個Fe原子[37]，兩個NO分子只能順序與催化中心結合，因此存在與HAO酶類似的現象，N2O的兩個N原子上的15N差異明顯，15OSPN2O值較大[17]。

表1 不同N2O產生途徑的δ15NbulkN2O、δ18ON2O和δ15OSPN2O值

注：異養硝化的數值來源為本課題組純培養試驗未發表數據。

3 N2O同位素異位體的δ15NSPN2O、δ18ON2O和δ15NbulkN2O值的質譜測定方法

N2O同位素異位體的測定方法早在1974年就有研究涉及，隨后Yoshida[6]首次全面描述了質譜測定N2O同位素異位體的方法。質譜分析法是運用質譜儀器分析某種元素穩定同位素比值特征的方法，廣泛應用于農業、環境和生態等領域的研究中。質譜儀由進樣系統、離子源、質量分析器、離子接收器、真空系統和計算機系統組成。樣品氣體在離子源中被燈絲發射的慢電子轟擊后，電離形成具有一定能量的離子束，在加速電壓作用下，帶電離子(帶電的原子、分子或分子碎片)以一定速度進入質量分析器的磁場，根據洛倫茲定律，在電場和磁場的共同作用下，帶電離子因質量數和所帶電荷數之比()不同而分離，被對應法拉第杯接收后，根據檢測到的離子類型和束流強度，實現對樣品氣體某種元素的同位素比值及其組成的測定。

N2O同位素異位體的測定，可通過在質譜儀上配備能同時接收為44的[14N14N16O]+，為45的 [14N15N16O]+、[15N14N16O]+、[14N14N17O]+和為46 的[14N14N18O]+等分子離子，以及為30的 [14N16O]+和為31的[14N17O]+、[15N16O]+等碎片離子的接收杯(圖1)，實現一次進樣在NO和N2O兩種模式得到15N、18O和31NO的值，再經一系列換算，計算得到15Nα、15Nβ和15OSPN2O[17-18]。

圖 1 五杯模式的穩定同位素比值質譜儀示意圖

3.1 質譜離子源工作條件優化

N2O氣體在離子源中，經慢電子轟擊后，主要形成[N2O]+分子離子和少量以NO+為主的碎片離子。由于這兩類離子所需的最優離子源條件可能不同，NO+的產率不高([NO]+/[N2O]+=1/3)，為保證測定結果的穩定性和精密度，需優化離子源條件，來適當提高NO+的產率，保證測定結果的穩定性和精密度。改變質譜儀器的聚焦參數、離子源的電子能量和電離室內的氣壓強等可以調整離子源的工作條件。質譜儀器的聚焦參數可通過儀器的自動聚焦(autofocus)功能實現，也可手動調節離子源的emission、trap等參數。電子能量變化對[N2O]+分子離子和NO+碎片離子的產率均有顯著影響(表2)，而且不同質譜儀器上電子能量的高低對N2O氣體的離子譜影響并不一致：Toyoda和Yoshida[18]發現MAT-252質譜儀上，測定NO+離子的最優電子能量為70 ～ 86 eV，而本課題組使用的是Delta V Plus質譜儀，當電子能量低于100 eV會導致NO+的產率過低(表2)，造成測定結果不準確(表3)。

3.2 重排因子測定

N2O在離子源中會發生重排，所形成的[NO]+離子的N原子主要來自α-N，部分來自β-N[18]，引起這種重排效應的原因目前尚不明確，推測與N2O+受電子轟擊后形成NO+的途徑有關。準確測定N2O的同位素異位體，需要確定重排因子，它通常不受樣品濃度和豐度影響，取決于所使用的質譜儀器和離子源條件，同一臺質譜儀器在離子源條件發生變化后(如：更換燈絲)需要重新測定重排因子。Toyoda和Yoshida[18]、Westley等[38]發現在MAT-252、253質譜儀上重排因子大約為0.07 ～ 0.09，即[NO]+離子中有7% ～ 9% 是來自β-N；而Sutka等[24,26]發現IsoPrime質譜儀的重排因子可達19.5%。

表2 電子能量變化對離子流強度的影響

注：信號衰減率均以124 eV的離子流強度為基準計算。

表3 電子能量變化對N2O同位素異位體測定值的影響

質譜儀器重排因子的測定一般可通過NH4NO3熱解法和標記氣體混合法實現[18]。NH4NO3熱解法是將不同豐度的NH415NO3和15NH4NO3加熱分解生成不同豐度的N2O氣體，由于分解形成的N2O中α-N都來自NO3-N，β-N都來自NH4-N，因此可制得一系列已知豐度的15NNO和N15NO氣體。將這些氣體在質譜儀上的測定值與其理論值繪制成一條直線，直線的斜率即為重排因子。標記氣體混合法是通過購買市售的高豐度高純15NNO和N15NO氣體(>99 atom%)，將其與自然豐度的工作標準N-2O氣體(0.3663 atom%)混合，即可制得一系列已知豐度的15NNO和N15NO氣體，再將測定得到31R值與45R值繪制成一條直線，斜率即為重排因子。這兩種方法中，NH4NO3熱解法得到的重排因子更為準確，但操作非常繁瑣，需使用特制的熱解裝置，而標準氣體混合法操作相對簡單，目前大部分研究人員仍然選擇使用標準氣體混合法測定重排因子[39–41]。本課題組使用的Delta V Plus質譜儀，通過標記氣體混合法測定的重排因子為0.085，這一結果與Toyoda和Yoshida[18]、Well等[40]、 Mohn等[42]報道過的結果(0.08 ～ 0.09)一致。

3.3 N2O工作標準氣體的校準

由于長期缺乏N2O國際標準氣體，如何在不同實驗室內準確校準N2O工作標準氣體，一直是困擾研究人員的難題。雖然NH4NO3熱解生成的已知豐度的N2O氣體能夠實現工作標準氣體的校準，但這一方法操作較繁瑣，還需要特殊的熱解裝置，很難在每個實驗室內單獨實現。在國外學者的努力下，美國地質勘探局2016年開始提供USGS51和USGS52兩種國際標準品(表4)，研究者可直接購買標準品完成工作標準氣體的校準。需要注意的是，不同實驗室對USGS51和USGS52的比對測定結果顯示，15OSPN2O值的測定誤差較大，因此在日常測定工作中應采用兩點校正，減少測定誤差[42]?？梢灾苯邮褂肬SGS51和USGS52進行兩點校正，也可以使用能覆蓋樣品15OSPN2O值范圍的實驗室自制標準氣體進行兩點校正。

表4 N2O國際標準品USGS51和USGS52(‰)

注：表中數據來源于https://isotopes.usgs.gov/lab/referencematerials.htm。

3.4 其他測定問題

N2O同位素異位體的準確測定對質譜儀器的穩定性要求較高。在實際工作中發現，極少量溶于水的CO2會生成[CO]+，干擾[NO]+的準確測定，因此需經常更換微量預濃縮裝置中的除水和CO2的化學阱，也可將化學阱分成除水、除CO2兩部分，分別單獨更換，既節約試劑又提高效率。樣品氣體中如果雜質太多，會在色譜柱中逐漸累積，干擾測定結果，加大烘烤色譜柱的頻率，或在樣品測定完成后反吹色譜柱，有助于去除雜質。對于和N2O信號過于靠近的雜質峰，可通過降低流速和色譜柱溫度，實現有效分離。使用穩定同位素比值質譜儀測定N2O同位素異位體時，N2O樣品的信號高低，直接影響NO+碎片離子的產率，非線性問題會顯著影響測定結果，常規的線性測試是通過一系列不同信號的矩形信號峰完成，而樣品峰是瞬時信號，要準確實現對樣品峰的線性校正，需要用同樣峰形的標準氣體，可通過在每一天運行樣品N2O的前后，分別運行一組接近樣品最高和最低濃度的N2O標準氣體，標準氣體盡量使用與樣品同一體積的樣品瓶，完成線性校正。

4.1 同位素指標的選擇

4.2 二源同位素混合模型

N2O的同位素組成指標結合同位素混合模型，可分析不同來源途徑N2O的排放貢獻。線性同位素混合模型，尤其是二源線性同位素混合模型(two- endmember isotope mixing model)是最常用的方法，它可用線性方程= a+ b表示，其中=15NSPN2O，=18ON2O。在二源同位素混合模型中，兩個途徑對N2O的排放貢獻可通過同位素混合方程sample途徑1×途徑1途徑2×途徑2計算，途徑1和途徑2的值根據文獻中不同N2O產生途徑的純培養試驗數據得到相應范圍，途徑1和途徑2表示兩個途徑對N2O的貢獻率，途徑1+途徑2=1[44,46](圖2)。二源同位素混合模型一次只能考慮兩個來源[47]，無法將所有N2O產生途徑放入模型同時運行，需要對各途徑兩兩進行場景假設分別定量分析。因為各產生途徑的15NSPN2O可分為N2OD和N2ON兩大類，可分別從兩類中選擇一個途徑進行兩兩分析。

但是，在反硝化過程中，N2O會消耗還原為N2，隨著還原進程的進行，15NSPN2O因分餾效應發生變化，需對這一過程進行校正，才能準確計算排放貢獻[16]。N2O還原過程中15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O的同位素效應變化較一致，分餾系數比率(red15Nsp/red18O或red15Nsp/red15N)十分穩定，可作為校正N2O還原過程影響的指標[40, 43-44]。首先，根據需要分析的兩種N2O產生途徑的15NSPN2O和18ON2O值，在樣品值散點圖上繪制出相應的端元值范圍，運用Monte Carlo采樣方法在取值范圍內各取一個點連接得到混合曲線；其次以N2O還原為N2過程中15N和18O分餾因子的穩定比值(red15Nsp/red18O)為斜率，經過樣品值點繪制出還原曲線的取值范圍，再用Monte Carlo采樣方法在范圍內取一條曲線即為該樣品點對應的還原曲線，還原曲線與混合曲線的交點即可區分兩個途徑對樣品N2O的排放貢獻[39-40,43](圖2)。Lewicka-Szczebak等[41]和Wu等[48]發現，在實際土壤中N2O還原為N2過程還存在兩種可能(圖3)：一是還原–混合過程(R-M)，即N2O先還原后混合的過程，首先細菌反硝化途徑產生的N2O部分還原為N2，剩余未還原的N2O與硝化、真菌反硝化途徑產生的N2O混合；二是混合–還原過程(M-R)，即N2O先混合后還原的過程，各個途徑產生的N2O先混合，接著部分N2O還原為N2。他們進一步提出了Mapping approach校正N2O還原為N2過程的方法，假設該體系為封閉體系，根據Rayleigh分餾方程進行校正(公式(10))。以第一種情況為例，在線性混合模型中還原曲線和混合曲線可分別用公式(3)、(4)表示，根據公式(5) ～ (7)代入兩個途徑的15NSPN2O和18O值后，可得還原曲線的截距bred、混合曲線的斜率amix和截距bmix。整合還原曲線和混合曲線的方程(公式(3)、(4))，可得到二者交點的15NSPN2O和18ON2O值(公式(8)、(9))。

圖 2 二源同位素混合模型概念圖

(場景1(藍色虛線)：混合–還原過程(M-R)；場景2(黃色虛線)：還原–混合過程(R-M)；a點截距：還原前各個途徑產生的混合N2O；b點截距：細菌反硝化途徑產生的N2O部分還原為N2后殘余的部分)

式中：ared是15NSPN2O值和18O的分餾系數之比(red15Nsp/red18O)，該比值穩定在2.4 ～ 2.6；=15NSPN2O，=18ON2O；對于細菌反硝化過程，bD是細菌反硝化過程的15NSPN2O值，bD是細菌反硝化過程的18ON2O值，同理Ni/fD和Ni/fD分別是硝化或真菌反硝化過程的15NSPN2O和18ON2O值；int、int分別為還原曲線和混合曲線交點的18ON2O和15NSPN2O值。

最后，依據Rayleigh分餾方程，未還原的N2O比例(N2O)和細菌反硝化過程的貢獻(bD)可以通過公式(10)～(11)計算得出。

同理，第二種場景假設的計算方法與此類似，具體可參照Wu等[48]文章的附錄。對比預測結果和實測結果發現，一般來說還原–混合過程的場景假設其估計值和觀測值之間更加契合[39,48–50]，但也有研究對比標記試驗結果發現，部分土壤類型中混合–還原過程場景假設的結果與觀測值之間更加吻合[41,51]。

總之，二源同位素混合模型可針對場景假設中兩種N2O產生途徑計算相對貢獻，自此基于N2O同位素異位體同位素特征值的溯源分析方法開始向半定量化推進。但是，簡單的二源同位素線性混合模型一次所能區分的N2O產生途徑有限，只能進行多次場景假設，在樣本量和產生途徑較多的情況下難以兼顧數據源的不確定性，可能產生較大誤差。由于樣本的同位素特征值來自于試驗測定，存在一定的實驗誤差和系統誤差。各N2O產生途徑的源數據整理自文獻中不同條件下的純培養試驗結果，變化范圍較大，如果將整個范圍代入，與特定試驗條件下的實際范圍相比也存在一定偏差。Buchen等[39]嘗試將源數據范圍全部代入計算，均發現結果的不確定性較大。這種情況下，使用二源同位素線性混合模型難以準確量化N2O排放貢獻。

4.3 貝葉斯同位素混合模型

同位素混合模型不僅包括線性混合模型，也有近年來發展迅速的基于貝葉斯統計的同位素混合模型(如：SIAR、MixSIR等)，在R語言的輔助下，已逐漸應用于生態、地質等領域中食物貢獻率、水分貢獻率溯源分析。其中，SIAR發展最早，它能考慮多種來源數據的不確定性和先驗信息，而MixSIR在樣品混合物取值非常穩定時結果更可靠，但是樣品值的微小變動容易引起貢獻率結果波動[52]。2018年Stock等[47]綜合SIAR模型和MixSIR模型二者優勢，在考慮多種源不確定性和先驗信息基礎上，加入了隨機效應分類變量、殘差和過程誤差等開發出了MixSIAR模型，已被認為是最優的貝葉斯混合模型。雖然目前應用該模型的研究對象都不同，但均是用于量化不同源對于混合物(最終產物)的貢獻，該模型基于R語言實現，通過為每個源和混合物定義均值和方差參數，從而將源同位素值的不確定性納入模型[53]。2020年Lewicka-Szczebak等[51]首次提出基于貝葉斯的三源同位素值混合模型(3DI模型)，同時使用15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O三種同位素特征值，雖然15NbulkN2O值變異性很大但依然包含了重要信息，在同位素特征值個數不受限制的情況下，將其納入模型的同位素特征值數據中，可為N2O的溯源分析提供更多科學依據，有助于提高分析方法的定量化水平。該模型的核心基于Moore和Semmens等[53]的工作并進行了進一步擴展，允許將輸入數據的不確定性包括到模型中，即假設來自4個N2O產生途徑(bD、nD、fD、和Ni)的源數據集(15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O值)正態分布，多次測量構成單個樣本后對其進行Monte Carlo積分，源數據的不確定性通過非歸一化似然計算中的方差輸入模型。3DI模型允許同時考慮N2O的4種產生途徑，使用基于貝葉斯框架的穩定同位素混合模型確定最終貢獻比例的概率分布。Lewicka-Szczebak等[51]比較了3DI模型、SP/O圖(15NSPN2O–18ON2O)、SP/N圖(15NSPN2O–15NbulkN2O)以及N/O圖(15NbulkN2O–18ON2O)的分析結果，發現SP/O圖和3DI模型的結果較一致，且與15N標記的試驗結果較吻合，且在N2O還原作用的估算上更優于15N標記法；與SP/O圖相比，3DI模型結果中的相關性分析更能保證貢獻率結果的準確性；SP/N圖則問題較大，輸出結果難以解釋。本課題在現有4個N2O產生途徑基礎上增加了異養硝化途徑，使用3DI模型分析得到的 N2O排放貢獻與15N標記方法基本吻合(未發表數據)。因此，3DI模型能夠更加全面地估算各N2O產生途徑的貢獻和N2O殘余比例N2O[41]，可大幅提高基于自然豐度的土壤N2O溯源研究定量程度。

4.4 不同模型方法的優勢與不足

在N2O同位素異位體方法的發展過程中，最初關注不同實驗室間如何準確測定N2O的一系列同位素特征值15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O，國際標準品USGS51和USGS52的出現解決了這一問題。隨著更多N2O產生途徑的同位素特征值的發現，研究人員重點關注如何定量不同N2O產生途徑的排放貢獻。從最初的僅根據N2O產生途徑端元值簡單劃分，發展到二源同位素混合模型(SP/O或SP/N同位素混合模型)以及最新的貝葉斯同位素混合模型(3DI模型)等研究方法。

二源同位素混合模型，解決了只能通過15NbulkN2O端元值定性判斷N2O排放來源問題，能半定量分析兩種N2O產生途徑的貢獻比例。因其核心是線性方程，僅考慮兩個N2O來源，在一定程度上限制了模型結果的準確性。但基于SP/N的二源同位素混合模型仍然廣泛應用于水生生態系統的N2O排放研究，基于SP/O的二源同位素混合模型則主要應用在土壤生態系統中。不少研究人員開展了15N標記試驗作為對比，證明二源同位素混合模型可以準確估算主要的N2O產生途徑，還能準確量化N2O的還原比例[39, 48, 51]。

基于Python實現的3DI模型擺脫了N2O來源個數的限制，能同時對多個N2O產生途徑進行定量分析，還提供了定量結果的不確定性分析，這也是運用同位素異位體方法研究N2O排放貢獻的一大突破進展。但是這一方法仍處于起步階段，還存在不足：①N2O產生途徑源數據的不確定性。目前異養硝化、協同反硝化、DNRA等N2O產生途徑的15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O值尚不明確，尤其是與有機氮庫有關的異養硝化途徑對土壤N2O的排放貢獻不可忽略，其在林地、草地和農田土壤中貢獻率可達25% ～ 85%，已被證明是亞熱帶酸性森林土壤的主要N2O產生途徑[54]，亟需將其納入源數據中，才能準確定量土壤N2O排放貢獻。而且現有的各N2O產生途徑源數據主要基于某幾類典型微生物純培養，在土壤微生物中所屬功能群的比例小，源數據的準確性需要在不同類型土壤中反復驗證。需要開展大量純培養和土壤培養試驗，建立源數據庫，才能有助于評估不同生態系統、不同土壤類型中源數據的特點和差異。②定量方法的不確定性。土壤中N2O的各產生過程和N2O還原過程同時發生，二者之間存在復雜的相互作用[41,49]。在現有的同位素混合模型中，當N2O潛在來源增加時，任何一個來源貢獻的不確定性也會增加[55]。不同類型土壤特點各異，土壤微生物群落結構差異大，15NbulkN2O和18ON2O值對不同反應底物同位素特征的依賴性大[44]，3DI模型亟需在不同類型土壤中開展大量對比試驗，通過15N標記結合數值模型的方法檢驗定量結果的準確性，調整模型中的參數計算方法和假設條件，如：針對實際研究體系的18ON2O計算方法，以及N2O還原為N2過程的假設條件。

5 同位素異位體方法溯源土壤N2O的應用和展望

基于N2O同位素異位體組成特征溯源土壤N2O排放貢獻，主要依據對N2O產生和還原過程的同位素效應的理解[45]。從1999年Toyoda和Yoshida[18]建立質譜測定N2O同位素異位體的方法后，該方法的技術已發展成熟。近年來，激光光譜儀測定N2O同位素異位體的方法發展迅速，雖然質譜儀在18ON2O和15NbulkN2O的測定上有明顯優勢，但光譜儀對15NSPN2O值的測定更為穩定，且因其測定成本較低，適合野外實地工作，備受研究人員的青睞。但是，質譜儀所需氣體量較小，可精確區分其他痕量氣體的影響，能準確校正N2O濃度變化引起的非線性問題，所以目前仍然是主流測定方法。

許多學者已將同位素異位體方法應用到不同領域的研究中，Koba等[44]首次使用15NSPN2O、15NbulkN2O值，結合二源同位素混合模型，分析溫帶針葉林地區地下水的N2O排放貢獻；Toyoda等[43]、Well等[40]在此基礎上提出利用分餾系數比率(red15NSP/red18O或red15NSP/red15N)校正N2O還原過程的影響，分析了不同施肥處理下各作物種植土壤的N2O排放貢獻；Zou等[46]運用這一方法，研究了茶園土壤的N2O排放貢獻；Lewicka-Szczebak等[41]提出Mapping approach方法區分還原混合的先后過程，考察對N2O還原作用校正結果的影響；Buchen等[39]首次選擇15NSPN2O和18ON2O兩個指標來區分不同來源N2O排放貢獻，指出土壤類型、處理條件等都會顯著影響N2O排放產生途徑的貢獻，在研究涉及的兩種土壤類型中，N2O還原為N2對同位素組成有不同影響，并據此對各個場景進行分析，得到其計算方法存在不確定性的結論[39]。

綜上，N2O同位素異位體法可實現野外原位采集氣體樣品，經質譜儀或光譜儀分析得到數據，結合模型即能得到土壤N2O排放貢獻，與15N標記方法相比受時空限制小，易于在大尺度的野外試驗中推行，是極具潛力的新方法和新技術。雖然在定量分析上仍有不足，但經過不斷完善發展，其已開始廣泛應用于不同地區、不同土壤類型、不同處理條件下的N2O排放貢獻分析，所以這一新興的土壤N2O溯源分析方法的應用前景十分廣闊。

1) 可與15N標記方法互為補充。N2O的同位素異位體方法能在較大的時空尺度上半定量或定量評估N2O的排放貢獻，能區分細菌、真菌反硝化過程產生的N2O，還能定量N2O還原為N2的過程，有效彌補了15N標記方法的不足之處。

2) 可與DNDC等模型相結合?；谶^程機理開發的DNDC生物地球化學模型被廣泛用于估算區域尺度的N2O排放，將N2O的15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O值引入DNDC模型，比較實際測定值和模型估算值，能有效率定模型參數、驗證模型結果，量化區域尺度的N2O排放，為制定合理、有效的N2O減排措施提供科學依據[56]。

3) 可為解析N2O產生途徑的生化機制提供信息。N2O的N、O同位素組成受其產生途徑的生化機制調控，15NSPN2O值體現N2O兩個N原子上的同位素組成差異，可作為N2O產生過程的分子機理的有力佐證。在細菌反硝化過程中，NOR酶如何催化產生N2O，曾有順式(cis)和反式(trans)兩種可能機制的爭論，其較低的15NSPN2O值(–10‰ ～ 0‰)表明兩個N原子上的15N組成差異不大，證明了反式機制的正確性[57-58]。這一發現推動了將N2O的同位素異位體(如：15N14N18O和14N15N18O)作為新型示蹤劑，深度解析并量化N2O產生途徑。

4)可嘗試進一步建立更高精度的數值定量模型。目前的二源同位素混合模型在計算不同來源排放貢獻的過程中存在明顯局限性，如對源個數的限制等。而基于貝葉斯的數值模型能同時考慮N2O的不同產生和消耗途徑，兼顧土壤異質性、土壤反應過程速率差異性和底物同位素組成差異性，但模型結果的精度還有待進一步提高，所以進一步完善以及嘗試建立更高精度的數值模型將是該領域未來的研究重點之一。

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Isotopocule Analysis to Source Partition Soil Produced N2O: A Review

XU Jin1, CAO Yacheng1,2*, WEN Teng1,3,4,5*, ZHANG Peiyi1, ZHANG Jinbo1,3,4,5, CAI Zucong1,3,4,5

(1 School of Geography Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 2 Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 3 Jiangsu Center for Collaborative Innovation in Geographical Information Resource Development and Application, Nanjing 210023, China; 4 Key Laboratory of Virtual Geographic Environment (Nanjing Normal University), Ministry of Education, Nanjing 210023, China; 5 State Key Laboratory Cultivation Base of Geographical Environment Evolution (Jiangsu Province), Nanjing 210023, China)

Soil is one of the important sources of N2O emissions. Soil N2O production pathway is numerous and regulated by variety of factors, in-depth analysis of soil N2O production pathway can adopt targeted emission reduction strategies. Stable isotope technology has been widely used to the study of soil N2O emissions, N2O isotope method is an emerging research method in recent years. This method analyzes N2O emission contribution by measuring the isotope composition of soil N2O (15NSPN2O,18ON2Oand15NbulkN2O), because not need to add markers, little interference to soil system and low in cost, it is suitable for field research on N2O emissions and is a powerful supplement to15N labeling method. This paper introduces in detail the principle of N2O isotope method, mass spectrometry method and quantitative analysis method, the factors affecting the method and its application prospect.

N2O isotopocules; Site preference; Source partitioning N2O; Isotope ratio mass spectrometry (IRMS)

S153

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.03.001

徐錦, 曹亞澄, 溫騰, 等. 同位素異位體溯源土壤N2O的方法、技術和展望. 土壤, 2022, 54(3): 425–436.

國家自然科學基金面上項目(41977084)資助。

(yccao@issas.ac.cn; wenteng@njnu.edu.cn)

徐錦(1998—)，女，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事土壤氮轉化研究。E-mail: 201302014@njnu.edu.cn