降解多菌靈和啶蟲脒殘留的復合菌劑研發及初步應用①

李錦濤，楊 涵，陳 洋，焦 宸，湯浩宇，何 健，黃 星

降解多菌靈和啶蟲脒殘留的復合菌劑研發及初步應用①

李錦濤，楊 涵，陳 洋，焦 宸，湯浩宇，何 健，黃 星*

(南京農業大學生命科學學院，南京 210095)

針對菜田土壤中多菌靈和啶蟲脒的殘留問題，以多菌靈降解菌株djl-6和啶蟲脒降解菌株D-2作為材料，進行降解菌劑的復配，研究了使用復合降解菌劑對復合農藥殘留土壤的修復效果及微生態效應。研究結果表明：①復配降解菌株djl-6與D-2的最適體積比為5∶3，復合降解菌劑在3 d內對無機鹽培養基中50 μg/ml的多菌靈降解率為87.14%，對50 μg/ml的啶蟲脒降解率為96.10%。②初始接種量為7% 時，復合降解菌劑可在6 d內將復合農藥污染土壤中5 mg/kg多菌靈降解74.40%，將5 mg/kg啶蟲脒降解95.87%。土壤含水率為25% 時，復合降解菌劑對復合農藥污染土壤中5 mg/kg多菌靈的降解率為80.80%，對5 mg/kg啶蟲脒的降解率為97.87%。③復合農藥污染土壤中10 mg/kg多菌靈和10 mg/kg啶蟲脒即可對小青菜的生長產生明顯的藥害，小青菜生長24 d時根長僅為空白對照的66.56%、莖葉長為58.35%、鮮重為45.13%。在7% 的接種量條件下，復合降解菌劑可解除藥害，使小青菜的生長指標恢復至對照水平。④多菌靈和啶蟲脒殘留造成土壤細菌群落的Observed species指數、Shannon指數、Chao1指數和ACE指數降低，均與濃度呈正相關，接入復合降解菌劑后各指數均提高。可見，該復合降解菌劑具有較好的應用前景。

多菌靈降解菌djl-6；啶蟲脒降解菌D-2；復合降解菌劑

設施栽培是提高蔬菜產量的有效途徑，可以解決我國蔬菜淡季的短缺問題，但因其種植密度高、濕度大、溫度高等特點，致使病蟲害多發，導致農藥的使用頻次高，施用量大[1-2]。大量農藥殘留沉積在土壤中會破壞微生物的生存環境，降低土壤中微生物的總量，折損土壤的肥力[3-4]。殺菌劑多菌靈和啶蟲脒因其高效低毒的特點，被廣泛應用于設施農業中，但同樣也面臨著嚴重的殘留問題亟待解決，土壤中多菌靈和啶蟲脒殘留主要的降解途徑是微生物代謝[5-7]。

以高效降解菌株為材料，開發微生物菌劑用于修復農藥殘留污染是一種公認安全有效的方法[8-10]。菜地土壤農藥殘留量大、殘留種類多，針對該問題組合不同功能的菌株，功能互補，優化得到比單一菌株降解效果更好、更穩定的微生物復合菌劑成為目前主要的研究和應用方向[11-13]。研究表明，微生物菌劑施用得當可以改善土壤的理化性質，增加細菌群落豐富度和多樣性[14]。

本研究以實驗室保藏的多菌靈降解菌株djl-6和啶蟲脒降解菌株D-2為材料[15]，進行降解菌劑的復配，確定復合降解菌劑的最適配比，并在此基礎上分別探究接種量及土壤含水率對復合降解菌劑降解效果的影響，以及復合降解菌劑對復合農藥殘留土壤的修復效果及其微生態效應，以期為菜地多菌靈和啶蟲脒土壤污染修復提供修復制劑及理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑及培養基

啶蟲脒(純度98.3%)原藥購自綠源制藥，多菌靈(純度99.8%)原藥購自江蘇新沂農藥廠。無機鹽培養基：硝酸銨 1.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀 1.5 g/L，氯化鈉1.0 g/L，七水硫酸鎂 0.2 g/L，pH 7.0。LB培養基：酵母浸出物5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0。D-2發酵培養基：葡萄糖9 g/L，硫酸銨0.9 g/L，酵母膏0.3 g/L，氯化鈉0.1 g/L，碳酸鈣1 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，pH 7.0 ～ 7.2。djl-6發酵培養基：葡萄糖8 g/L，硫酸銨0.8 g/L，酵母膏0.2 g/L，氯化鈉0.1 g/L，碳酸鈣0.5 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，七水硫酸鎂0.1 g/L，pH 7.0 ～ 7.2。

1.2 供試菌株、作物與土壤

供試多菌靈降解菌株djl-6和啶蟲脒降解菌株D-2，由本實驗室分離并保藏；供試作物選用上海青，購自南陽青青種業；供試土壤為黃棕壤，采集于南京農業大學牌樓實驗基地。供試土壤基本理化性質：pH 6.91，全氮 0.85 g/kg，全磷 0.32 g/kg，全鉀 1.41 g/kg，有機質15.12 g/kg。

1.3 培養基中降解菌的最適接種量及復配比例確定

分別挑取菌株djl-6和菌株D-2的單菌落于液體LB培養基試管中，置于30℃搖床以160 r/min培養至菌株對數生長期。按照1% 的接種量將菌株分別接入裝有1 000 ml各自發酵培養基的三角瓶中，培養至菌株對數生長期，使用無菌水進行重懸至OD600約0.8左右(活菌數大約108cfu/ml)。將菌株djl-6的發酵液以0.5%、1%、3%、5%、7% 的接種量分別加入到多菌靈濃度為50 mg/L的100 ml無機鹽培養基中，30℃、160 r/min培養，于72 h時取樣，通過高效液相色譜(HPLC)測定樣品中多菌靈的濃度，并計算降解率。同時，將菌株D-2的發酵液以0.5%、1%、3%、5%、7% 的接種量分別加入到啶蟲脒濃度為50 mg/L的100 ml無機鹽培養基中，30℃、160 r/min培養，于72 h時取樣，通過高效液相色譜法測定樣品中啶蟲脒的濃度，并計算降解率。由上述試驗分別確定菌劑djl-6和菌劑D-2的最適接種量，以接種量比例(體積比)將菌株djl-6的發酵液和菌株D-2的發酵液混合接種到多菌靈和啶蟲脒濃度均為50 mg/L的100 ml無機鹽培養基中，30℃、160 r/min培養，于72 h時取樣，通過HPLC測定樣品中多菌靈和啶蟲脒的濃度，并計算降解率。

1.4 多菌靈和啶蟲脒的提取及HPLC檢測條件

多菌靈和啶蟲脒的提取：在待測樣品中加入等體積的二氯甲烷充分振蕩萃取，去除上層廢液，下層有機相加入適量無水硫酸鈉后，取1.5 ml于離心管中置于通風櫥中吹干，待揮發完全后加入300 μl甲醇(色譜純)溶解，經有機相濾器(孔徑為0.22 μm)過濾后，用HPLC測定樣品中多菌靈和啶蟲脒的含量。

HPLC檢測條件：儀器型號為Dionex UltiMate 3000，色譜柱為C18反相色譜柱，規格為250 mm× 4.6 mm×5 μm，流動相為甲醇∶水(60∶40，/)，柱溫為40℃，流速1.0 ml/min，進樣量為20 μl，多菌靈檢測波長為240 nm和280 nm，啶蟲脒檢測波長為235 nm和260 nm。

1.5 接種量對土壤中復合降解菌劑降解效果的影響

向供試土壤中同時加入多菌靈和啶蟲脒的水溶液，充分攪拌均勻，使土壤中多菌靈和啶蟲脒最終濃度為5 mg/kg。按1%、3%、5%、7% 和9% 的接種量將復合降解菌劑接入含100 g土壤的避光塑料杯中，調節土壤含水率為20%，以不加菌劑的土壤為對照組，每個處理設3個重復，并置于光照培養箱(26 ℃、16 h光照和20℃、8 h黑暗為一個周期)中培養。培養過程中，每天進行稱重，通過補水來保持土壤的含水率，并且每3 d取一次土樣，使用HPLC檢測多菌靈和啶蟲脒的濃度，并計算其降解率。

1.6 土壤含水率對復合降解菌劑降解效果的影響

將復合降解菌劑以1.5節中確定的最適接種量接種至含土壤100 g的避光塑料杯中，調節土壤含水率為10%、15%、20%、25% 和30%，每個處理3個重復，置于光照培養箱(26℃、16 h光照和20℃、8 h黑暗為一個周期)中培養。培養過程中，每天進行稱重，通過補水來保持土壤的含水率，并且每3 d取一次土樣，使用HPLC檢測多菌靈和啶蟲脒的濃度，并計算其降解率。

1.7 復合降解菌劑對小青菜生長的修復與促進作用

設置土壤中復合農藥殘留濃度分別為10 mg/kg (多菌靈和啶蟲脒濃度均為10 mg/kg)和50 mg/kg(多菌靈和啶蟲脒濃度均為50 mg/kg)，復合降解菌劑的接種量為7%，進行以下6組處理：空白對照組(CK)、添加復合降解菌劑(J)、添加復合農藥殘留10 mg/kg (Y)、添加復合農藥殘留10 mg/kg和復合降解菌劑(JY)、添加復合農藥殘留50 mg/kg(Y5)、添加復合農藥殘留50 mg/kg和復合降解菌劑(JY5)，每個處理3個重復。供試小青菜種子消毒、萌發后，播種在盆缽中，在南京農業大學溫室中進行試驗。在24 d時取樣，對各處理盆缽中的小青菜隨機取樣，對莖葉長度、根系長度和鮮重等指標進行測量。

1.8 復合降解菌劑對復合農藥殘留污染土壤修復的微生態效應

作物根際微生物對植物的生長和群落演替起重要的作用，根際土壤中微生物的群落結構對于了解添加農藥殘留和添加外源微生物對環境的影響具有重要意義。本試驗分別對1.7節中6組處理的小青菜根際土(24 d時)進行測序分析(北京諾禾致源科技股份有限公司)。包括對有效數據進行OTU(operational taxonomic units)物種分類分析，根據OTU分析結果，對每個OTU做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況；對OTUs進行豐度、Alpha多樣性分析，得到樣品均勻度、物種豐富度、組內和組間樣品多樣性差異等信息。

1.9 數據處理與分析

利用Microsoft Excel?軟件進行數據處理，采用IBM SPSS statistical Ver. 25.0 software進行方差分析。將IonS5TMXL下機數據根據barcode序列區分為各個樣本的數據，然后進行嵌合體過濾，得到可用于后續分析的有效數據。對所有樣本的Effective Tags以97% 的一致性(Identity)進行OTU聚類，用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析，獲得物種分類學信息并分別在門水平和屬水平統計各樣本的群落組成。使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Alpha多樣性指數，包括Observed species指數、Chao1 指數、Shannon指數和ACE指數。

2 結果與分析

2.1 培養基中降解菌的最適接種量及復配比例

由圖1可知，接種量為5% 時，菌劑djl-6能夠在72 h內降解88.00% 無機鹽培養基中濃度為50 mg/L的多菌靈。接種量為3% 時，菌劑D-2能夠在72 h內降解96.89% 無機鹽培養基中濃度為50 mg/L的啶蟲脒。將菌劑djl-6的發酵液和菌劑D-2的發酵液以體積比為5∶3混合制成復合降解菌劑，以7% 的接種量接入啶蟲脒與多菌靈的濃度均為50 mg/L的無機鹽液體培養基中，在72 h內多菌靈的降解率達到87.14%，啶蟲脒的降解率達到96.10%。

(圖中小寫字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05))

2.2 接種量對土壤中復合降解菌劑降解效果的影響

由圖2可知，較高的接種量更有利于復合降解菌劑對多菌靈和啶蟲脒的降解。多菌靈和啶蟲脒的降解率和復合降解菌劑的起始接種量呈正相關。在光照培養箱中連續培養時，接種量越大，起始降解率越高；當接種量大于7% 時，受底物濃度的限制，降解效果基本一致。在培養6 d時，以7%、9% 的接種量接入復合降解菌劑的試驗組對5 mg/kg啶蟲脒的降解率已經接近最高值；在培養9 d時，除了接種量為1% 的試驗組，其余試驗組對5 mg/kg多菌靈的降解率均已達到最高值。

圖2 復合菌劑不同接種量對復合農藥降解的影響

2.3 土壤含水率對復合降解菌劑降解效果的影響

圖3的結果表明，較高的土壤含水率更有利于復合降解菌劑對多菌靈和啶蟲脒的降解。多菌靈和啶蟲脒的降解率與土壤含水率呈正相關。在光照培養箱中連續培養時，土壤含水率越大，起始降解率越高。在培養12 d時，土壤含水率大于25% 時，多菌靈的降解率達94.71%，同時趨于穩定；土壤含水率為20% 時，啶蟲脒的降解率基本達到最高；土壤含水率低于25% 時，復合降解菌劑對啶蟲脒的降解效果優于對多菌靈的降解效果。

圖3 土壤含水率對復合降解菌劑降解復合農藥的影響

2.4 不同處理條件下小青菜的生長情況

由表1可知，多菌靈和啶蟲脒的復合農藥殘留對小青菜的生長產生明顯的藥害且與濃度呈正相關，導致小青菜的根系長度、莖葉長度和鮮物質量的生理指標都遠低于CK，添加50 mg/kg復合農藥殘留處理(Y5)的小青菜根長僅為CK的30.10%、莖葉長僅為CK的43.30%，鮮物質量僅為CK的31.94%。復合降解菌劑可以有效降解多菌靈和啶蟲脒復合農藥殘留，修復復合農藥殘留對小青菜產生的藥害，添加10 mg/kg復合農藥殘留和復合降解菌劑處理(JY)的小青菜生長指標基本達到CK水平，添加50 mg/kg復合農藥殘留和復合降解菌劑處理(JY5)的小青菜各生長指標相較于Y5處理提高1倍以上。

表1 不同處理條件下小青菜的生長指標

注：表中數據后小寫字母不同表示處理間差異顯著(<0.05)。

2.5 復合降解菌劑對復合農藥殘留污染土壤修復的微生態效應

本試驗通過IonS5TMXL 平臺對各處理樣本中的16S V3 ～ V4 區域進行PCR 擴增和測序，下機數據根據barcode 序列對各個樣本數據進行區分、過濾，獲得有效數據。對不同樣本在97% 一致性閾值下的Alpha 多樣性進行統計(均一化時選取的數據量：cutoff=28 239)。

Alpha多樣性主要關注的是單個樣本下物種的多樣性，也被稱為生境內的多樣性，是反映豐富度和多樣性的綜合指標。Chao1指數和ACE指數用來反映群落的豐富度，即樣本中所含OUT數目，指數越大，群落豐富度越高。Shannon指數用來反映群落的多樣性，即群落中個體分配上的均勻性，其中Shannon值越大，說明群落多樣性越高。Observed species指數代表OTU的直觀數量統計，表示該樣品中含有的物種數目。Good coverage指數是反映測序深度的指標，其值越接近于1，說明測序深度越合理，即該深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種；反之，測序深度不高，許多物種僅被測到了一次，暗示著很多低豐度物種可能尚未被測序測到。由表2可知，各處理樣品Good coverage指數均大于0.95，本試驗測序深度合理，基本覆蓋到樣品中所有的物種。相較于CK，不同處理的Observed species指數、Shannon指數、Chao1指數和ACE指數的變化具有一致性。在添加復合降解菌劑處理中，各指數均顯著高于CK。添加復合農藥的各處理相比于CK均降低，且復合農藥的濃度越高抑制作用越明顯。JY處理與CK基本持平，而JY5處理則低于CK，但也高于Y5處理。綜上，復合農藥殘留對土壤群落的物種數目、豐富度和多樣性具有抑制作用且與濃度呈正相關，而接入復合降解菌劑能夠在很大程度上減輕抑制作用，使其恢復至正常狀態。

表2 不同處理條件下根際土壤中細菌的Alpha多樣性指數

各處理土壤中細菌在門水平物種相對豐度如圖4所示，由高到低分別是Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)。相較CK，Proteobacteria相對豐度在其他處理中均降低，但在添加復合農藥殘留的處理中尤為明顯。Actinobacteria相對豐度在各個處理中基本保持穩定。Acidobacteria相對豐度在所有添加復合農藥殘留的處理中均表現為升高。Bacteroidetes相對豐度在添加10 mg/kg和50 mg/kg復合農藥殘留處理中呈現顯著提高。CK處理中(紅球菌屬)相對豐度為0.085%、(嗜染料菌屬)相對豐度為0.004%，接入復合降解菌劑處理中相對豐度為7.822%、相對豐度為1.286%。

3 討論

微生物復合菌劑相較于單一菌劑有明顯優勢，競爭力較強，接種后可迅速成為優勢菌群，提高對目標污染物的降解能力[16]。復合菌劑的制備需要充分了解菌株的生物學特性，將菌種進行科學、合理的復配，發揮復合菌劑菌群間的互惠、協同、共生等作用，以避免競爭或拮抗的發生[17]。本試驗先分別確定培養基中菌劑djl-6和菌劑D-2的最適接種量，以接種量體積比配置復合菌劑再加以驗證，最終確定復合菌劑的復配比例為體積比5∶3。復合降解菌劑可在3 d內將無機鹽培養基中復合農藥殘留中的50 mg/kg的多菌靈降解87.14%，將50 mg/kg的啶蟲脒降解96.10%。可見，復合降解菌劑對復合農藥殘留的降解效果達到了單一菌劑的水平，滿足開展后續試驗的條件。

圖4 不同處理條件下細菌門水平相對豐度

本試驗結果表明，多菌靈和啶蟲脒的降解率與復合降解菌劑的起始接種量和土壤含水率呈正相關，當接種量大于7% 或含水率高于25% 時，受底物濃度限制，降解效果基本一致。同時土壤含水率低于25% 時，復合降解菌劑對啶蟲脒的降解效果優于對多菌靈的降解效果。研究表明，土壤含水率對多菌靈和啶蟲脒的降解具有不同的影響，在一定的土壤含水率范圍內，隨著含水率升高，多菌靈在土壤中的降解速度加快，而土壤濕度為20% 和80% 時，啶蟲脒降解速率無明顯差異[18-19]。復合降解菌劑的接種量是田間施用時的重要指標，接種量過小會導致菌株生長延滯期延長，降解效果差。而接種量過大一方面增加生產成本造成浪費，另一方面可能影響土壤菌群群落結構，消耗營養物質而降低土壤肥力[20]。綜合考量復合降解菌劑的降解效果、田間的環境條件以及在實際應用的經濟效益，本研究認為7% 為復合降解菌劑的最佳接種量，同時在復合降解菌劑施用期間應保持土壤含水率不低于25%。

本試驗結果表明，復合降解菌劑可以有效降解多菌靈和啶蟲脒復合農藥殘留，修復復合農藥殘留對小青菜產生的藥害，添加10 mg/kg復合農藥殘留和復合降解菌劑處理組小青菜的生長指標基本達到對照組水平，添加50 mg/kg復合農藥殘留和復合降解菌劑處理組的小青菜各生長指標相較于添加50 mg/kg復合農藥殘留處理均大幅提高。土壤的生物肥力指土壤中的微生物等有機體為作物生長發育所需的營養和理化條件做出的貢獻，長期大量施用農藥會對土壤肥力產生損害，施用微生物菌劑是維持和提高土壤肥力的有效手段[21]。

微生物種群的多樣性和豐富度是其實現土壤物質循環和養分轉化等功能的基礎，也是維持土壤肥力的保障。研究表明，土壤微生物量與土壤的肥力狀況存在顯著相關性[22]，土壤微生物群落豐富度和多樣性對農業生產中作物的抗病性起到重要作用[23]。微生物菌劑的施用會在一定程度上提高土壤細菌種群多樣性，豐富細菌群落結構[24]。本試驗結果表明，復合農藥殘留對土壤群落的物種數目、豐富度和多樣性具有顯著的抑制作用且與農藥殘留的濃度呈正相關，而接入復合降解菌劑不僅能夠使其恢復至正常狀態，且有明顯的促進作用。本試驗結果表明，Proteobacteria(變形菌門)相對豐度在所有處理中均降低，但在添加復合農藥殘留的處理中尤為明顯，推測可能的原因是復合降解菌劑接種后與其產生競爭作用，同時復合農藥殘留對Proteobacteria也有一定的抑制效果。Acidobacteria(酸桿菌門)和Bacteroidetes (擬桿菌門)相對豐度在添加10 mg/kg和50 mg/kg復合農藥殘留處理中呈現顯著提高。

本研究提供了一種降解能力可靠、具備實際開發價值的復合農藥殘留降解菌劑，為復合農藥殘留的降解以及復合降解菌劑的應用提供了理論基礎。但是也存在一定的局限性，如未開展田間試驗，同時復合菌劑菌群與土壤菌群間的互作及其在根際土壤的定殖還有待進一步的研究。

4 結論

復合降解菌劑中菌株djl-6與D-2的最適體積比為5∶3，其在3 d內對無機鹽培養基中50 μg/ml的多菌靈降解率為87.14%，對50 μg/ml的啶蟲脒降解率為96.10%。復合降解菌劑的最佳接種量為7%，菌劑施用期間土壤含水率應保持在25% 以上。復合降解菌劑可有效修復多菌靈和啶蟲脒殘留對小青菜的藥害，同時對小青菜有顯著的促生作用。施加復合降解菌劑可有效提高土壤微生物種群的多樣性和豐富度，進而提高土壤的肥力。

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Development and Preliminary Application of Compound Bacterial Agent for Degrading Carbendazim and Acetamiprid Residues

LI Jintao, YANG Han, CHEN Yang, JIAO Chen, TANG Haoyu, HE Jian, HUANG Xing*

(College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to solve carbendazim and acetamiprid residues in vegetable soil, carbendazim degradation straindjl-6 and acetamiprid degradation strainD-2 were used as materials to study the remediation effect and microecological effect of compound degradation bacteria on compound pesticide residue soil. The results show that:1) The optimum volume ratio of compound degradation strain djl-6︰D-2 is 5︰3, and the degradation rates of carbendazim and acetamiprid are 85.46% and 94.36% for 50 μg/ml respectively within 3 days. 2) When the initial inoculation amount is 7%, the degradation rates of 5 mg/kg carbendazim and acetamiprid in compound pesticide contaminated soil are 74.40% and 95.87% respectively within 6 days. When soil water content is 25%, the degradation rates of 5 mg/kg carbendazim and 5 mg/kg acetamiprid in soil contaminated by compound pesticides are 80.80% and 97.87%, respectively. 3) Soil contaminated by 10 mg/kg carbendazim and 10 mg/kg acetamiprid (compound pesticides) cause obvious drug damage to the growth of green vegetables. After growing for 24 days, the root length, stem and leaf length and fresh weight of green vegetables are only 66.56%, 58.35% and 45.13% of those of the blank control. Under the condition of 7% inoculation, the compound degradation bacteria can relieve the drug damage, and the growth index of green vegetables is consistent with that of the control. 4) Carbendazim and acetamiprid residues have significant inhibitory effects on Observed species index, Shannon index, Chao1 index and ACE index of soil bacterial community, which are positively correlated with the concentrations of carbendazim and acetamiprid. In conclusion, the compound degradation bacterial agent has a broad application prospect.

Carbendazim-degrading strain djl-6; Acetamiprid-degrading strain D-2; Compound degradation agents

X172

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.03.027

李錦濤, 楊涵, 陳洋, 等. 降解多菌靈和啶蟲脒殘留的復合菌劑研發及初步應用. 土壤, 2022, 54(3): 646–652.

中央高校基本科研業務費項目 (KYZZ2022001)和江蘇省農業科技自主創新資金項目(CX(18)1005)資助。

(huangxing@njau.edu.cn)

李錦濤(1998—)，男，安徽阜陽人，碩士研究生，主要從事環境微生物學研究。E-mail: 2020816122@stu.njau.edu.cn