基于實(shí)時(shí)無標(biāo)記技術(shù)研究流式分選后細(xì)胞活性的檢測方法

李艷偉，王佳佳，邢月婷，郭 春，黃瑩瑩，宋興輝，黃 瓊

（浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺(tái)，浙江 杭州 310058）

近年來，利用流式分選技術(shù)精準(zhǔn)分離、純化的活細(xì)胞被廣泛用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)、新藥篩選、生物材料、疾病機(jī)理等領(lǐng)域的研究［1-6］。由于分選后的細(xì)胞大多數(shù)為群體中的低表達(dá)細(xì)胞，因此用于活性檢測的細(xì)胞用量以及檢測后的細(xì)胞能否重新利用顯得尤為重要，也對分選后細(xì)胞活性的檢測指標(biāo)和檢測方法提出了更高的要求。

細(xì)胞活性是判斷細(xì)胞在某些條件下是否能正常生長的重要指標(biāo)，細(xì)胞活性的檢測相當(dāng)于細(xì)胞增殖能力或凋亡能力的測定，其檢測指標(biāo)通常包括細(xì)胞膜對核酸染料的通透性、代謝活性、細(xì)胞分裂增殖等。目前，細(xì)胞活性常規(guī)檢測方法有四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT 法）、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒法（CCK-8）、流式細(xì)胞法等［7］，這些方法大都需要對細(xì)胞在特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行消化、重懸、染色標(biāo)記等處理，步驟多、檢測點(diǎn)有限，往往會(huì)遺漏細(xì)胞變化的時(shí)間點(diǎn)，增加檢測的盲區(qū)。

流式細(xì)胞分選技術(shù)是目前純化活細(xì)胞最常見的技術(shù)［8］，分選后的細(xì)胞大多數(shù)需繼續(xù)培養(yǎng)后再深入研究其功能，即使是分選后的細(xì)胞直接用于進(jìn)一步功能研究，也需要保持在一定活性狀態(tài)下，因此分選后細(xì)胞的活性不僅可以說明流式分選的水平也為細(xì)胞后續(xù)功能研究提供了保障。檢測細(xì)胞活性的方法很多［9-11］，但很少有研究對分選后的細(xì)胞活性進(jìn)行檢測。

實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析（Real time cellular analysis，RTCA）是一種無需標(biāo)記，可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測細(xì)胞活性的分析技術(shù)，該技術(shù)的核心是將微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到表面適于細(xì)胞貼附與生長的細(xì)胞檢測板底部的微孔膜上。微電子芯片測定的電阻抗轉(zhuǎn)化為細(xì)胞指數(shù)（Cell index，CI值）即可反映細(xì)胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態(tài)［9，12］。雖然RTCA 法的應(yīng)用日趨廣泛，但鮮有報(bào)道將其用于分選后細(xì)胞活性的檢測尤其是長效動(dòng)態(tài)活性的實(shí)時(shí)檢測。本研究以分選前后的人腎上皮細(xì)胞系HEK293T（簡稱293T）細(xì)胞為例，以CCK-8 法、流式細(xì)胞法作為參照，探討了RTCA 法對分選前后細(xì)胞增殖活性的檢測情況，從而建立了簡便、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)長效檢測分選后細(xì)胞活性的方法，以期為分選后活細(xì)胞的功能研究提供保障和檢測手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

293T細(xì)胞（浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）；流式分選專用質(zhì)控微球（美國Beckman Coulter 公司）；流式分析專用質(zhì)控微球（美國BD 公司）；凋亡試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；增殖CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基、血清、胰酶、雙抗（美國Gibco 公司）；96 孔板、離心管、無菌流式管、40μm 細(xì)胞篩（上海普飛生物技術(shù)有限公司）；磷酸緩沖鹽溶液（上海博升生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

MoFlo AstriosEQ超高速流式細(xì)胞分選儀（美國Beckman Coulter 公司）；LSRFortessa 流式細(xì)胞分析儀（美國BD 公司）；RTCA-SP高通量實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析儀（德國Roche公司）；SynergyMx M5多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分選前樣本制備 復(fù)蘇293T 細(xì)胞并接種于含10%磷酸緩沖鹽溶液及1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的孵箱內(nèi)孵育并傳代3次后，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時(shí)（密度為70%～80%），棄上清，加入0.25%胰酶消化，300 g 離心5 min，棄上清，用無菌磷酸緩沖鹽溶液制備成濃度為1 ×107個(gè)/mL 的單細(xì)胞懸液作為分選前樣本，置冰浴中備用，待上機(jī)分選前使用40μm 的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾。整個(gè)操作過程需在無菌環(huán)境下完成。

1.3.2 流式分選參數(shù)調(diào)試 所用的Beckman MoFlo AstriosEQ分選系統(tǒng)具有超高速分選性能［13］，使用100 μm 噴嘴分選細(xì)胞，設(shè)定鞘液壓力為0.2 MPa，樣本與鞘液的壓力差為0.002 MPa，分選模式為Purty 模式。調(diào)節(jié)液流與激光垂直正交并校準(zhǔn)激光光斑圖像。準(zhǔn)備分選質(zhì)控微球原液1 滴加入800 μL ddH2O 中混勻并校準(zhǔn)激光延遲，完成儀器質(zhì)控檢測CV、電壓、median 等信號(hào)。計(jì)算液滴延遲，校準(zhǔn)液流偏轉(zhuǎn)角度。打開分選監(jiān)測軟件（Summit 6.2），建立實(shí)驗(yàn)方案，分別激活前向散射光信號(hào)（FSC）、側(cè)向散射光信號(hào)（SSC）、目標(biāo)熒光通道，建立FSC（A）/SSC（A）散點(diǎn)圖并圈定目標(biāo)細(xì)胞群，建立FSC（A）/FSC（H）散點(diǎn)圖并圈定單細(xì)胞群，排除黏連細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片等。

1.3.3 流式細(xì)胞分選 將預(yù)先制備好的1 mL 細(xì)胞收集液加入到15 mL 離心管中并置于收集架內(nèi)，用40μm細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液作為分選前樣本，調(diào)整上樣細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，設(shè)置收集管內(nèi)分選細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/mL。分選前后細(xì)胞均置于冰浴中用于后續(xù)活性檢測。

1.3.4 流式細(xì)胞分析參數(shù)質(zhì)控調(diào)試 BD LSRFortessa 流式細(xì)胞分析儀具有檢測速度快、靈敏度高的特點(diǎn)，采用儀器參數(shù)設(shè)置及追蹤（CST）自動(dòng)校正程序：取渦旋后的CST微球原液1滴加入500μL ddH2O中混懸，上樣采集進(jìn)行儀器CV、PMTV、mean、median等參數(shù)校正。

1.3.5 分選前后細(xì)胞的流式凋亡檢測 選取分選前、后的293T 細(xì)胞懸液，于4 ℃、300 g 離心5 min，棄去上清液，按照凋亡試劑盒稀釋5×結(jié)合緩沖液為1×結(jié)合緩沖液，取500μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整重懸后細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。每管加入Annexin V-FITC 染色液5μL 和碘化丙啶（PI）染色液10μL，于冰浴中避光孵育5 min，進(jìn)行流式細(xì)胞凋亡檢測。按常規(guī)兩色標(biāo)記，首先以未染色管樣本調(diào)節(jié)電壓，單標(biāo)管調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償，以Annexin V-FITC 為橫坐標(biāo)、PI 為縱坐標(biāo)作流式圖。分析時(shí)以Annexin V-FITC 單陽細(xì)胞比例確定細(xì)胞早期凋亡情況，以Annexin V-FITC/PI 雙陽細(xì)胞比例確定細(xì)胞晚期凋亡情況，以Annexin V-FITC/PI雙陰細(xì)胞比例確定細(xì)胞活性情況。

1.3.6 分選前后細(xì)胞的CCK-8 增殖檢測 選取分選前、后的293T 細(xì)胞懸液，于4 ℃、300 g 離心5 min，棄上清液，加入10%血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度為2 × 104個(gè)/mL，取100 μL 細(xì)胞液分別接種在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，每孔分別加入10 μL 增強(qiáng)型CCK-8 試劑，于37 ℃、5% CO2孵箱中孵育?？瞻讓φ罩形醇尤爰?xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分別于0、24、48、72 h 檢測450 nm 處的吸光度（D450）值，計(jì)算細(xì)胞的平均吸光度，分別繪制細(xì)胞增殖曲線，確定細(xì)胞增殖活性。

1.3.7 分選前后細(xì)胞的RTCA 檢測 向96 孔增殖板中加50μL 的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液測定基線。選取分選前、后濃度為1×105個(gè)/mL的293T細(xì)胞懸液，于4 ℃、300 g離心5 min，去上清液，加入10%血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，濃度為5×104個(gè)/mL，取100μL 細(xì)胞液加入上述增殖板中，使每個(gè)孔包含5 000 個(gè)細(xì)胞，設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，超凈臺(tái)內(nèi)靜置30 min 后放入檢測儀，設(shè)定每15 min 進(jìn)行一次CI 值檢測，連續(xù)檢測72 h，以細(xì)胞CI值為Y軸，時(shí)間t為X軸繪制293T細(xì)胞增殖曲線［14-15］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為每次實(shí)驗(yàn)的至少3 個(gè)重復(fù)，所用圖片與數(shù)據(jù)分別為具有代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用FlowJo_V10 軟件進(jìn)行處理分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較組間統(tǒng)計(jì)差異。其中，P＜0.05 表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 流式細(xì)胞凋亡檢測

細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞活性檢測的指標(biāo)之一，是一種程序性死亡過程，早期凋亡細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）外翻與Annexin V 結(jié)合，晚期凋亡時(shí)細(xì)胞膜具有通透性且仍保留PS 外翻特性，PI 染料可進(jìn)入核內(nèi)與DNA 結(jié)合，壞死的細(xì)胞為裸核，只有PI 與DNA 結(jié)合［16-17］。因此利用流式凋亡圖可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率等于3 個(gè)復(fù)孔細(xì)胞凋亡率的平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)方差。根據(jù)細(xì)胞凋亡率可以判斷分選前后細(xì)胞的凋亡情況，統(tǒng)計(jì)分析流式凋亡圖中的活細(xì)胞比例則可以判斷分選前后細(xì)胞活性情況。本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分選后需在4 ℃條件下離心、重懸、染色孵育、上機(jī)檢測，其中離心、重懸吹吸操作等會(huì)增加細(xì)胞凋亡的比例，因此需要記錄大量細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)選取有代表性的流式細(xì)胞凋亡圖（圖1A）進(jìn)行展示。計(jì)算得到分選后細(xì)胞凋亡率為（3.85 ± 0.008）%，分選前細(xì)胞凋亡率為（14.09 ± 0.021）%，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析分選前后的細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，分選后細(xì)胞凋亡率較分選前下降明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖1B）；統(tǒng)計(jì)分選前后的活細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，流式分選后細(xì)胞活性高于分選前，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖1C）。

圖1 流式細(xì)胞法檢測分選前、后293T細(xì)胞的凋亡結(jié)果Fig.1 Apoptosis results of 293T cells before and after sorting by flow cytometry A. apoptosis results；B. apoptosis statistics chart of 293T cell，*P ＜0.05；C. activity statistics chart of 293T cell，***P ＜0.001

2.2 CCK-8增殖檢測

細(xì)胞增殖是活細(xì)胞的重要生理功能之一，而細(xì)胞代謝活性檢測基于被細(xì)胞線粒體脫氫酶還原為黃色的水溶性甲臜產(chǎn)物，該黃色甲臜物的吸光度與活細(xì)胞數(shù)量成正比，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量［18-19］。實(shí)驗(yàn)中，需將淡紅色的CCK-8試劑直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中混勻（試劑顏色與酚紅顏色接近，需避免漏加或多加［20］）。連續(xù)孵育0、24、48、72 h，分別進(jìn)行吸光度的檢測。結(jié)果顯示，293T 細(xì)胞的吸光度（D450）隨著細(xì)胞孵育時(shí)間的增加而增加，隨后增殖曲線進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞吸光度（D450）增幅越來越小（圖2A）。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，分選后293T 細(xì)胞的吸光度在孵育24 h 后高于分選前，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖2B）。

圖2 CCK-8檢測法檢測分選前、后293T細(xì)胞的增殖結(jié)果Fig.2 Proliferation results of 293T cells before and after sorting by CCK-8 detection method A. the absorbance value of 293T cells over time；B. proliferation activity statistics chart of 293T cells，***P ＜0.001

2.3 RTCA實(shí)時(shí)增殖檢測

RTCA 法操作簡單，具有實(shí)時(shí)、自動(dòng)、無標(biāo)記、高通量的優(yōu)勢［21-22］。實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于96 孔增殖板中，連續(xù)動(dòng)態(tài)檢測72 h，觀察細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)增殖曲線。結(jié)果顯示，CI 值變化與細(xì)胞的活性成正比，細(xì)胞活性越好，貼壁生長的數(shù)量就越多，增殖板孔底微電子芯片的電阻抗增加越快，CI 值增加越快。當(dāng)增殖板孔中的細(xì)胞鋪滿孔底時(shí)，孔底微電子芯片的電阻抗不再變化，CI值不再增加，曲線進(jìn)入平臺(tái)期。結(jié)果顯示，分選后細(xì)胞動(dòng)態(tài)增殖曲線的CI 值高于分選前（圖3A）。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，分選后293T 細(xì)胞的增殖活性明顯高于分選前，具有極顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.000 1）（圖3B）。

圖3 RTCA檢測法檢測分選前、后293T細(xì)胞的增殖結(jié)果Fig.3 Proliferation results of 293T cells before and after sorting by RTCA detection method A. cell proliferation index value of 293T cells over time；B. proliferation activity statistics chart of 293T cells，****P ＜0.000 1

2.4 3種檢測方法的比較

比較RTCA法、CCK-8法、流式細(xì)胞法對分選后細(xì)胞活性的檢測結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，RTCA法檢測的細(xì)胞活性高于CCK-8法，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；RTCA法檢測的細(xì)胞活性明顯高于流式細(xì)胞法，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；CCK-8法檢測的細(xì)胞活性與流式細(xì)胞法檢測的細(xì)胞活性無明顯差異（P＞0.05）。

圖4 3種方法檢測分選前、后293T細(xì)胞活性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.4 Statistical results of three detection methods to detect the activity of 293T cells before and after sorting**P ＜0.01，nsP ＞0.05

綜合比較3種細(xì)胞活性檢測方法（表1）。RTCA 法操作最簡單，細(xì)胞用量少，全程無額外刺激干擾，結(jié)果最全面、客觀；CCK-8 法細(xì)胞用量小、成本也相對較低，缺點(diǎn)是需要耗費(fèi)較長時(shí)間來摸索最佳檢測條件［23］。這兩種方法檢測后的細(xì)胞可繼續(xù)用于細(xì)胞其他功能的測定。流式細(xì)胞法可以定量計(jì)算細(xì)胞的凋亡率及活性率，但細(xì)胞用量大，操作步驟多，實(shí)驗(yàn)成本較高，而且檢測后的細(xì)胞直接流入廢液，不可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8 法和流式細(xì)胞法，檢測過程需要人工操作，自動(dòng)化程度不高；而RTCA 法在細(xì)胞鋪板后，會(huì)實(shí)時(shí)自動(dòng)監(jiān)測細(xì)胞增殖變化的整個(gè)過程，自動(dòng)化程度高［24］。因此，RTCA 法具有操作流程極簡、無需標(biāo)記、檢測靈敏度高、可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測細(xì)胞整個(gè)生長變化過程的優(yōu)勢，可作為實(shí)時(shí)便捷的分選后細(xì)胞活性檢測方法，檢測的細(xì)胞長效活性結(jié)果可為分選后細(xì)胞功能的深入研究提供保障，為基礎(chǔ)與臨床細(xì)胞活性研究提供檢測手段。

表1 3種細(xì)胞活性檢測方法的比較Table 1 Comparison of three cell activity detection assays

3 結(jié) 論

本文通過比較RTCA法、CCK-8法、流式細(xì)胞法3種檢測方法，建立了流式分選后細(xì)胞活性的實(shí)時(shí)無標(biāo)記檢測方法，用于驗(yàn)證流式分選后細(xì)胞狀態(tài)的高穩(wěn)定性和高活性，為分選后細(xì)胞功能的深入研究提供了保障。