重金屬的生物體原位成像技術(shù)研究進(jìn)展

裴誠(chéng)誠(chéng)，聶亞光，趙亞楠，倪珅瑤，許 安，2*

（1.安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，安徽 合肥 230601；2.環(huán)境毒理與污染控制技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院強(qiáng)磁場(chǎng)科學(xué)中心，安徽 合肥 230031）

重金屬是指密度大于4.5 g/cm3的金屬，一般存在于自然環(huán)境中，環(huán)境中的重金屬主要分布于大氣、水、土壤，其來(lái)源可分為自然來(lái)源和人為來(lái)源。隨著工業(yè)化、城市化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，重金屬的污染程度和潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)正逐漸增大［1］。目前我國(guó)很多地區(qū)受到不同程度的重金屬污染，其中大氣中的重金屬主要來(lái)源于工業(yè)生產(chǎn)和汽車尾氣排放，而水體中的重金屬主要來(lái)源于各類生產(chǎn)、生活污水排放［2］。重金屬能夠通過(guò)飲水、被污水灌溉的糧食和蔬菜等途徑進(jìn)入人體，從而危害人體健康［3］。

重金屬對(duì)人體的危害具有隱蔽性，當(dāng)少量重金屬攝入時(shí)不易被察覺(jué)，但通過(guò)食物鏈在人體中積累到一定程度會(huì)造成慢性中毒，損害人體健康［4］，因此檢測(cè)生物體內(nèi)重金屬的含量及分布對(duì)于解釋其致毒機(jī)制十分重要。不同重金屬對(duì)人體的毒性不同，例如微量的鎘（Cd）通過(guò)生物累積進(jìn)入人體后會(huì)對(duì)腎、肺、肝、睪丸、腦、骨骼以及血液系統(tǒng)產(chǎn)生一系列損傷［5］；飲水和食物導(dǎo)致的長(zhǎng)期砷（As）暴露會(huì)顯著提升罹患癌癥風(fēng)險(xiǎn)［6］；汞（Hg）主要通過(guò)消化道、呼吸道和皮膚等侵入人體，造成肺、腎、肝、神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)生病變［7］；而鉛（Pb）會(huì)降低人體的免疫力，直接損害生殖系統(tǒng)［8］。目前針對(duì)重金屬的毒理學(xué)一般借助模式生物，如秀麗隱桿線蟲(chóng)［9］、蚯蚓、小鼠等進(jìn)行研究，將重金屬在生物體內(nèi)的積累與不同的生物學(xué)終點(diǎn)相結(jié)合進(jìn)行分析，如Yu 等［10］發(fā)現(xiàn)銅離子（Cu2+）在小鼠肝臟積累后會(huì)導(dǎo)致肝臟的線粒體吞噬及細(xì)胞凋亡從而造成肝損傷；Yin 等［11］的研究表明鉻離子（Cr6+）在魚的肝、腎中積累后，會(huì)引起氧化應(yīng)激從而造成器官損傷。

重金屬在生物體內(nèi)的分布及形態(tài)是決定其生物效應(yīng)的核心要素，是引起毒性和損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此原位檢測(cè)生物體內(nèi)重金屬是進(jìn)一步探索其致毒機(jī)制的重要手段。現(xiàn)階段的主要檢測(cè)技術(shù)包括激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜法（LA-ICP-MS）、同步輻射以及金屬感測(cè)熒光團(tuán)成像等。由于發(fā)展周期較短，因此原位檢測(cè)重金屬分布的方法有限，同時(shí)不同檢測(cè)方法的原理、測(cè)試精度、對(duì)樣品大小及前處理方法的需求不同［12］，需研究人員對(duì)這些技術(shù)手段有全面深入的了解，以選擇對(duì)自身研究最有利的方法。基于此，本文將從技術(shù)原理、前處理方法和實(shí)際應(yīng)用等方面介紹上述原位檢測(cè)生物體內(nèi)重金屬的手段。

1 激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜法（LA-ICP-MS）

1.1 LA-ICP-MS的基本原理及特點(diǎn)

LA-ICP-MS具有很高的靈敏度，是一種痕量和超痕量分析技術(shù)，具有較低的檢出限，幾乎無(wú)污染且干擾相對(duì)較小，可進(jìn)行生物體內(nèi)重金屬的原位成像分析。LA-ICP-MS主要由激光剝蝕（LA）系統(tǒng)和電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）系統(tǒng)兩部分組成，基本原理是將高能激光束聚焦于固體樣品表面進(jìn)行剝蝕取樣，隨后使用ICP-MS 分析產(chǎn)生的氣溶膠［13］。前者是一種快速直接的微區(qū)取樣技術(shù)，后者用于檢測(cè)所取生物樣品中的元素含量。由于高能激光束是直徑為數(shù)微米的光斑，因此通過(guò)LA連續(xù)采樣覆蓋生物樣品時(shí)，每一次采樣都如同一個(gè)“像素點(diǎn)”，測(cè)定其中的元素含量能獲取整個(gè)生物體的元素分布，具體工作流程及原理如圖1 所示［14］。由于樣品的激光剝蝕過(guò)程需在真空中進(jìn)行，因此在分析生物體內(nèi)元素分布前需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，如冷凍干燥、切片等使其樣品狀態(tài)和大小以達(dá)到儀器檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 利用LA-ICP-MS檢測(cè)秀麗線蟲(chóng)中銀（Ag）含量的原理及工作流程［14］Fig.1 Schematic and workflow for the detection of silver（Ag）in C. elegans by LA-ICP-MS［14］

激光的工作條件（包括燒蝕模式、光斑大小和激光能量密度等）對(duì)檢出限、分辨率和分析時(shí)間均有一定影響，測(cè)試前需確定合適的操作條件以保證分析的準(zhǔn)確性。對(duì)于LA-ICP-MS，選擇合適的空間分辨率十分重要，這不僅是一個(gè)光學(xué)設(shè)計(jì)問(wèn)題，同時(shí)也取決于許多其他因素，如元素濃度、探測(cè)功率等。Brinkhaus等［15］總結(jié)LA-ICP-MS準(zhǔn)確分析需滿足3個(gè)條件：①激光剝蝕取樣需具有代表性，即激光剝蝕產(chǎn)生的氣溶膠的組成與樣品組成相同；②具有高的氣溶膠傳輸效率，即傳輸過(guò)程中氣溶膠損失較少；③具有高的離子化效率，即氣溶膠顆粒能在等離子體中完全離子化。

1.2 LA-ICP-MS在重金屬原位成像中的應(yīng)用

受限于樣品倉(cāng)尺寸和LA 掃描速度，LA-ICP-MS 一般用于檢測(cè)小型動(dòng)物，如線蟲(chóng)等［15-17］。Brinkhaus等［15］通過(guò)LA-ICP-MS研究了L1期線蟲(chóng)對(duì)錳（Mn）的吸收，將經(jīng)過(guò)暴露的線蟲(chóng)離心沖洗冷凍干燥后直接進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果展示了線蟲(chóng)體Mn元素的分布。Wang等［14］利用L3期線蟲(chóng)檢測(cè)了納米二氧化鈦（TiO2NPs）對(duì)Cd吸收的影響，結(jié)果顯示TiO2NPs有助于Cd在線蟲(chóng)生殖細(xì)胞和卵中的積累（圖2），從而增強(qiáng)了Cd的多世代毒性。Crone等［18］將L4期線蟲(chóng)暴露在含鉑（Pt）的溶液中，洗滌后用冰甲醇進(jìn)行固定，利用LA-ICP-MS檢出Pt元素主要位于腸道及線蟲(chóng)頭部。該技術(shù)可運(yùn)用到其他動(dòng)物體內(nèi)金屬元素含量的檢測(cè)，對(duì)無(wú)法達(dá)到LA擊穿厚度的大型動(dòng)物，可通過(guò)器官或組織切片進(jìn)行分析。Becker等［19］通過(guò)將小鼠心臟在液氮中冷凍后進(jìn)行切片檢測(cè)，得到的結(jié)果很直觀地展示了小鼠心臟金屬元素的分布，并觀察到心肌中的重金屬富集程度高于血液，與左心室相比，右心室的鋅（Zn）、Mn、Cu 濃度更高。Togao等［20］用冷凍干燥將小鼠整個(gè)腎臟、肝臟和大腦樣本處理后進(jìn)行切片，通過(guò)圖像結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)Pb在肝臟中分布均勻，在腎臟和大腦中分布不均勻，其中在大腦中Pb 主要積聚于髓質(zhì)而非皮質(zhì)。Pornwilard等［21］報(bào)道LA-ICP-MS 分析證實(shí)了Wilson 病伴隨有小鼠肝部鐵（Fe）、Cu 和Zn 的異常值，具有作為常規(guī)診斷依據(jù)的潛力，為實(shí)驗(yàn)和臨床肝病學(xué)提供了新的診斷證據(jù)。Egger 等［22］通過(guò)對(duì)人體組織切片的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除了腎臟、骨骼和肝臟中有積累外，Cd在肌肉和脂肪中的含量很低，在直腸及腎臟中分布不均勻，Zn在人腦中分布不均勻，推測(cè)其在大腦中不同位置的作用不同。

圖2 利用LA-ICP-MS分析線蟲(chóng)體內(nèi)Cd和Ti的分布［17］Fig.2 Distributions of Cd and Ti in C. elegans revealed by LA-ICP-MS［17］

除了動(dòng)物個(gè)體和組織器官外，LA-ICP-MS 同樣廣泛應(yīng)用于植物體內(nèi)重金屬的檢測(cè)，如Becker等［23］在不同尺寸的薄片組織切片上觀察到多種重金屬元素的分布。楊紅霞等［24］通過(guò)對(duì)暴露于Cd溶液的印度芥菜進(jìn)行原位分析，發(fā)現(xiàn)Cd 大量積聚于韌皮部與木質(zhì)部組成的維管組織，且Cd 與鈣（Ca）具有相似的分布規(guī)律，說(shuō)明重金屬元素進(jìn)入植株體內(nèi)吸收運(yùn)輸過(guò)程與其它元素相伴。Promchan等［25］通過(guò)LAICP-MS 對(duì)單個(gè)大米縱截面進(jìn)行重金屬分布分析，以此區(qū)分大米樣品的類型，從而為稻米顆粒分類提供了新依據(jù)。

LA-ICP-MS對(duì)許多重金屬元素均具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性，可同時(shí)檢測(cè)生物樣品中多種重金屬元素的分布，同樣還可以通過(guò)外部校準(zhǔn)進(jìn)行半定量分析，以快速、直接進(jìn)行生物原位分析（表1）。LA是LAICP-MS技術(shù)的核心，未來(lái)的分析應(yīng)在成像分辨率、掃描速度以及對(duì)樣品的穿透性等方面進(jìn)行優(yōu)化。

表1 LA-ICP-MS在生物成像中的應(yīng)用Table 1 Application of LA-ICP-MS in bio-imaging

2 基于同步輻射（Synchrotron radiation）的成像方法

2.1 同步輻射成像的基本原理及特點(diǎn)

同步輻射光源是一種具有從遠(yuǎn)紅外到X射線波長(zhǎng)范圍的連續(xù)光譜，具有高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性以及寬波段等特點(diǎn)，同步輻射技術(shù)是利用同步輻射光源轟擊樣品，激發(fā)樣品中各元素的特征X射線，或與樣品發(fā)生交互作用時(shí)產(chǎn)生各種信號(hào)，然后接收和分析相應(yīng)信號(hào)，從而獲得被轟擊樣品的化學(xué)組成、原子價(jià)態(tài)及結(jié)構(gòu)組成等信息的技術(shù)［27］，可用于原位分析生物樣品。基于同步輻射技術(shù)的分析手段有很多，如同步輻射X射線熒光光譜（SRXRF）、同步輻射X射線吸收光譜（SRXAS）、X射線熒光顯微鏡（XFM）等［28］，這些測(cè)試方法具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高等共同特性。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的同步輻射方法，無(wú)需復(fù)雜前處理過(guò)程即可檢測(cè)生物樣品中的重金屬元素，實(shí)現(xiàn)原位無(wú)損分析。同步輻射技術(shù)的工作原理見(jiàn)圖3［29］。

圖3 識(shí)別晶體結(jié)構(gòu)的微X射線吸收近邊緣光譜（μ-XANES）及微衍射（μ-XRD）技術(shù)原理圖［29］Fig.3 Schematic diagram of micro-X-ray absorption near-edge spectroscopy（μ-XANES）and micro-diffraction（μ-XRD）techniques for identifying crystal structures［29］

2.2 同步輻射方法在重金屬原位成像中的應(yīng)用

由于同步輻射光源具有極強(qiáng)亮度，高垂直性，所以SRXRF具有檢出限低，對(duì)樣品損傷小，微米級(jí)光束（可進(jìn)行微區(qū)掃描、成像、結(jié)構(gòu)等分析，提供微觀精細(xì)信息）分辨率高，以及可同時(shí)檢測(cè)樣品中多種元素等特點(diǎn)。SRXRF的使用范圍廣，可運(yùn)用到大部分生物體內(nèi)的元素分析。Zhang等［30］將大腸桿菌在含鑭（La）溶液中進(jìn)行培養(yǎng)，再將線蟲(chóng)接到含La元素的瓊脂板（NGM）中，利用SRXRF原位檢出La在線蟲(chóng)L4時(shí)期體內(nèi)的分布，推斷線蟲(chóng)體內(nèi)的La元素是通過(guò)食物大腸桿菌被攝入和積累。Gao等［31］通過(guò)SRXRF測(cè)得線蟲(chóng)體內(nèi)K和Cu在體內(nèi)的含量，發(fā)現(xiàn)暴露于Cu納米顆粒可導(dǎo)致K和Cu含量升高且線蟲(chóng)中的Cu分布發(fā)生變化。袁靜等［32］對(duì)Pb污染的土壤中蚯蚓進(jìn)行原位分析，通過(guò)SRXRF發(fā)現(xiàn)蚯蚓體內(nèi)富集一定量的Pb，且主要集中在蚯蚓前部，此外還發(fā)現(xiàn)Pb在蚯蚓消化道表面固定，但未產(chǎn)生毒性效應(yīng)，因此推斷蚯蚓消化道表面可以阻止重金屬運(yùn)移到其他器官。Al-Ebraheem等［33］使用化學(xué)固定劑和冷凍干燥制備了人體表皮組織樣本，通過(guò)光斑尺寸為10μm×10μm的SRXRF檢出樣品中Fe、Cu在人體中的含量分布。Zhao等［34］通過(guò)SRXRF檢出Hg和硒（Se）在大蒜根、葉和莖中的含量，Se使莖中的Hg積累增加，但根和葉中的Hg積累減少，且Se抑制了Hg從根到葉的轉(zhuǎn)運(yùn)。Meng等［35］分析顯示稻米中的無(wú)機(jī)汞（Hg2+）在加工過(guò)程中會(huì)被清除，而毒性更大的甲基汞（MeHg）則被保留。同樣可用于元素原位檢測(cè)的還有XFM，Gao等［31］選用光束尺寸3μm×5μm的XFM觀察Cu納米顆粒在線蟲(chóng)中的生物累積，在成蟲(chóng)期，暴露于納米顆粒后Cu和K的水平升高，Cu的生物分布與未暴露對(duì)照組相比，其在頭部聚集明顯。James等［36］通過(guò)XFM觀察到線蟲(chóng)從幼年到產(chǎn)卵后腸細(xì)胞中的Fe有所增加，但不足引起線蟲(chóng)的衰老，實(shí)際衰老的原因是鐵蛋白功能喪失和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的喪失，因此線蟲(chóng)衰老程度與線蟲(chóng)體內(nèi)Fe的含量并無(wú)直接聯(lián)系。

重金屬對(duì)環(huán)境和人體健康的危害不僅受濃度影響，還取決于其形態(tài)，SRXAS可原位檢出生物體內(nèi)重金屬及微量元素的形態(tài)，為不同形態(tài)的重金屬元素的毒性效應(yīng)研究提供幫助。Weekley等［37］用SRXAS檢測(cè)了由食物進(jìn)行亞硒酸鹽暴露的小鼠體內(nèi)Se的形態(tài)及分布狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在腎臟和肝臟中存在Se—Se和Se—C結(jié)構(gòu)，腎臟中還存在未在肝臟中發(fā)現(xiàn)的Se—S結(jié)構(gòu)，從而為在未來(lái)的疾病預(yù)防和治療中有效合理地使用硒化合物奠定了基礎(chǔ)。Diacomanolis等［38］用SRXAS將小鼠組織暴露于不同濃度的Cd2+溶液中，發(fā)現(xiàn)Cd2+在肝臟和腎臟中的配位環(huán)境一致，大多數(shù)Cd2+會(huì)與組織中金屬硫蛋白結(jié)合。Porcaro等［39］通過(guò)將擬南芥暴露于高濃度Cd2+后，檢出Cd2+在根和葉毛狀體的維管中積累，造成植物生長(zhǎng)受阻。

由于不同同步輻射裝置檢測(cè)出的信息不同，聯(lián)用技術(shù)在原位成像方面發(fā)揮了很大作用。Guimar?es等［40］利用同步輻射X射線熒光微束分析（SR-μXRF）發(fā)現(xiàn)As主要在蝦的頭部和腹部節(jié)段有局部積累（圖4B），同時(shí)用μ-XANES在蝦的頭部對(duì)As進(jìn)行表征，并與LA-ICP-MS結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，確定砷化物和砷酸膽堿是可能存在的形態(tài)，證實(shí)大多數(shù)As 以基本無(wú)毒的砷酸膽堿進(jìn)行代謝（圖4A、B）。Weekley等［41］用XAS和XFM聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)了Se和Cu在小鼠腎臟中的分布及形態(tài)，發(fā)現(xiàn)在腎臟部位中這兩種元素含量較高，而XAS分析顯示在腎組織中存在Se—Se鍵，而非Se—Cu鍵，Cu在腎臟中與S、N元素相結(jié)合。Homma-Takeda等［42］通過(guò)SR-μXRF成像結(jié)合μ-XAFS，對(duì)小鼠組織進(jìn)行化學(xué)染色，以1μm×1μm的空間分辨率分析獲得鈾（U）在小鼠腎臟中的分布。Kopittke等［43］將豇豆的根暴露在As（Ⅲ）和As（Ⅴ）溶液中24 h，通過(guò)SRXRF與μ-XRF聯(lián)用檢測(cè)根中As的含量，發(fā)現(xiàn)As（Ⅴ）的積累量更多。

圖4 蝦體內(nèi)不同砷形態(tài)的熒光μ-XANES光譜（A），及蝦體內(nèi)的As、Ca、Br 元素分布（SR-μXRF）（B）［40］Fig.4 μ-XANES spectra of K-edge fluorescence of arsenic species in shrimp（A），and element distribution of As，Ca，Br in shrimp by SR-μXRF（B）［40］

基于同步加速器技術(shù)可對(duì)含水和新鮮植物組織中的金屬和類金屬進(jìn)行原位檢測(cè)，且不會(huì)造成明顯的損傷［44］。同步輻射相比于LA-ICP-MS 的分辨率更高，且可檢出重金屬在生物體內(nèi)的分布及形態(tài)，從而解釋其不同形態(tài)重金屬所造成的毒性效應(yīng)，但該技術(shù)受設(shè)備機(jī)時(shí)和樣品大小的限制。

表2列出了部分同步輻射在生物成像中的應(yīng)用。

表2 同步輻射在生物成像中的應(yīng)用Table 2 Application of synchrotron radiation in bio-imaging

3 金屬感測(cè)熒光團(tuán)（Metal sensing fluorophore）成像

3.1 金屬感測(cè)熒光團(tuán)成像的基本原理及特點(diǎn)

金屬感測(cè)熒光團(tuán)成像是通過(guò)熒光染料將金屬離子染色，從而檢測(cè)生物體內(nèi)重金屬的一種技術(shù)。圖5 展示了熒光PET（光誘電子轉(zhuǎn)移）傳感器識(shí)別重金屬的成像原理［45］。金屬熒光傳感器主要具有兩個(gè)基本特征：①金屬結(jié)合部位至少有一個(gè)熒光團(tuán)，與待測(cè)金屬結(jié)合后，用熒光顯微鏡檢測(cè)被熒光染色的離子；②不同熒光染料對(duì)金屬離子有特異性，因而能檢出生物體內(nèi)多種重金屬的分布［46］。

圖5 熒光PET傳感器識(shí)別重金屬的原理［45］Fig.5 Schematic of heavy metal recognition by fluorescent PET sensors［45］

3.2 金屬感測(cè)熒光團(tuán)成像在重金屬原位成像中的應(yīng)用

金屬感測(cè)熒光團(tuán)技術(shù)在線蟲(chóng)中應(yīng)用廣泛，Huang等［47］通過(guò)一種基于超靈敏雙鏈DNA 特異性染料和無(wú)標(biāo)記核苷酸傳感器，將8種金屬離子染色后，發(fā)現(xiàn)對(duì)Pb2+具有很高的選擇性。Huo等［48］開(kāi)發(fā)了一種Pb2+的熒光探針（TPI），其通過(guò)催化脫丙炔化反應(yīng)生成肟，能在80 s內(nèi)快速檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)低濃度的Pd2+。熒光探針也可原位檢測(cè)線蟲(chóng)體內(nèi)的重金屬元素，如Kaletta等［49］在線蟲(chóng)培養(yǎng)基上添加Zn特異性熒光染料，用熒光顯微鏡進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)在線蟲(chóng)體內(nèi)的Zn2+主要集中在腸細(xì)胞的囊泡中。Chung等［50］利用氰化物傳感器與Cu2+之間的熒光作用判斷是否存在Cu2+。有研究報(bào)道了一種Fe3+選擇性熒光傳感器，該傳感器對(duì)Fe3+有62倍的熒光增強(qiáng)，可用于線蟲(chóng)體內(nèi)Fe3+的分布檢測(cè)［51］。Chen 等［52］用一種含巰基和羧酸基團(tuán)的羅丹明腙衍生物作為Hg2+的選擇性熒光傳感器，可觀察到Hg2+在線蟲(chóng)體內(nèi)的積累，由于熒光檢測(cè)的靈敏度高，可進(jìn)一步探索Hg2+在體內(nèi)的運(yùn)移情況，這是首次用熒光傳感器觀察到生物體內(nèi)nmol級(jí)別的Hg2+。

熒光感測(cè)技術(shù)不僅適用于線蟲(chóng)體內(nèi)金屬的檢測(cè)（表3），同樣也可用于其他生物體內(nèi)金屬離子的檢測(cè)。Lakshmi等［53］發(fā)現(xiàn)含羅丹明單元的3種新型聚芳醚樹(shù)枝狀衍生物在含有其他競(jìng)爭(zhēng)金屬離子的情況下可選擇性地感應(yīng)小鼠體內(nèi)的Hg2+。Hirayama 等［54］通過(guò)Cu 的熒光傳感器揭示了小鼠體內(nèi)Cu 含量的變化，為研究健康和疾病狀態(tài)下Cu 的生理行為提供了新的技術(shù)手段。Chereddy 等［55］合成了4 種基于羅丹明的選擇性識(shí)別金屬離子的化學(xué)傳感器，其中D 是1 種添加了三唑的無(wú)色化學(xué)傳感器，分別考察未處理和Cu2+孵育的成纖維細(xì)胞的顯微鏡和熒光顯微鏡照片（圖6A、B、D、E），發(fā)現(xiàn)在存在其他競(jìng)爭(zhēng)性金屬離子的情況下，D仍可與Cu2+形成粉紅色的復(fù)合物（圖6C、F）。Shu等［56］用小鼠的Cu2+-EDTA單克隆抗體捕獲EDTA中的Cu2+，通過(guò)UV降解Cu2+-EDTA螯合物從而釋放游離Cu2+，并利用CdSe/ZnS量子點(diǎn)熒光的猝滅效應(yīng)檢測(cè)Cu2+。Xu等［57］利用熒光染料EPNP 檢測(cè)出芥菜植株和細(xì)胞中Hg2+的分布和運(yùn)輸，Hg2+被熒光染料染色后的共聚焦顯微鏡圖像顯示Hg2+主要積聚在溶解液泡而非細(xì)胞核或線粒體，研究結(jié)果為開(kāi)展植物中金屬離子的分布、轉(zhuǎn)運(yùn)研究提供了新的技術(shù)手段。

圖6 未經(jīng)處理的成纖維細(xì)胞（A），與Cu2+（5μmol/L）孵育的成纖維細(xì)胞（B），以及與Cu2+（5μmol/L）和D化學(xué)傳感器（1μmol/L）孵育的成纖維細(xì)胞（C）的顯微圖像；未經(jīng)處理的成纖維細(xì)胞（D），與Cu2+（5μmol/L）孵育的成纖維細(xì)胞（E），以及與Cu2+（5μmol/L）和D化學(xué)傳感器（1μmol/L）孵育的成纖維細(xì)胞（F）的熒光顯微圖像［55］Fig.6 Microscopic images of untreated fibroblast cells（A），cells incubated with Cu2+（5μmol/L）（B），and cells incubated with Cu2+（5μmol/L）and D（1μmol/L）（C）；fluorescence microscopic images of untreated fibroblast cells（D），cells incubated with Cu2+（5μmol/L）（E），and cells incubated with Cu2+（5μmol/L）and D（1μmol/L）（F）［55］

表3 生物感測(cè)熒光團(tuán)成像的應(yīng)用Table 3 Application of fluorescence sensor in bio-imaging

熒光團(tuán)成像的核心機(jī)制是通過(guò)特異性熒光將特定的金屬元素染色后進(jìn)行直接觀察。由于熒光染料的特異性，該方法在只針對(duì)生物體內(nèi)某一種金屬元素時(shí)具有很好的選擇性，但和LA-ICP-MS及同步輻射技術(shù)相比，若同時(shí)將幾種金屬染色，則可能造成一定的干擾，因此并不適于同時(shí)研究生物體內(nèi)多種重金屬元素的含量及分布。

4 總結(jié)與展望

原位檢測(cè)技術(shù)除以上介紹的3種方法，激光誘導(dǎo)擊穿光譜（LIBS）［58-59］、拉曼光譜（需要制作基底間接檢測(cè)［60］）等技術(shù)在原位檢測(cè)生物體內(nèi)重金屬方面的應(yīng)用也在逐漸增加。根據(jù)已有文獻(xiàn)顯示，重金屬在生物體內(nèi)的原位成像已成為毒理學(xué)、病理學(xué)、環(huán)境化學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域的重要研究手段，是揭示重金屬與生物體相互作用的重要工具。通常可根據(jù)研究需要選擇合適的檢測(cè)方法，LA-ICP-MS和同步輻射可以檢測(cè)生物體內(nèi)的幾乎所有重金屬元素［61-63］。其中LA-ICP-MS可檢測(cè)的重金屬種類與ICP-MS相同。而同步輻射技術(shù)一般用于檢測(cè)生物體內(nèi)元素價(jià)態(tài)及元素結(jié)合位點(diǎn)，如As形態(tài)的檢測(cè)，Cu在生物體內(nèi)結(jié)合方式的檢測(cè)等［64-65］。金屬感測(cè)熒光團(tuán)成像已用于Ag、Cd、Zn、Hg、Pb、Cu等元素的檢測(cè)［66-69］。盡管龐大的應(yīng)用需求推動(dòng)了這些檢測(cè)手段的快速發(fā)展，也產(chǎn)生了許多具有典型代表性的工作，但受限于其自身的局限性，這些技術(shù)仍存在不足，如LA-ICP-MS的分辨率有待提高，樣品大小和厚度受限，同步輻射技術(shù)的設(shè)備機(jī)時(shí)有限，難以開(kāi)展大規(guī)模檢測(cè)，金屬感測(cè)熒光團(tuán)在多種重金屬同時(shí)染色時(shí)存在干擾等（表4）。通過(guò)對(duì)上述3種方法的總結(jié)，可發(fā)現(xiàn)樣品大小、檢測(cè)時(shí)間、空間分辨率是生物體原位檢測(cè)時(shí)無(wú)法同時(shí)滿足的需求：目前進(jìn)行分析的樣品主要以小型動(dòng)物的整體或是大型動(dòng)植物的組織切片為主，類似線蟲(chóng)、蚤等小型動(dòng)物雖能做到整體的重金屬分布檢測(cè)，但分辨率不足以區(qū)分其內(nèi)部組織器官，大型動(dòng)物僅以切片樣品進(jìn)行檢測(cè)，很難對(duì)重金屬在生物整體層面的傳輸和富集進(jìn)行表征，同時(shí)無(wú)限制擴(kuò)大樣品大小也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)分辨率無(wú)法適應(yīng)，從而造成檢測(cè)時(shí)間無(wú)法控制，因此在技術(shù)條件存在較大限制的情況下，研究者更需在選擇檢測(cè)方法時(shí)謹(jǐn)慎權(quán)衡。此外，目前的檢測(cè)方法還無(wú)法實(shí)現(xiàn)活體生物的檢測(cè)，一些重金屬與生物相互作用的細(xì)節(jié)無(wú)法被揭示，時(shí)間尺度上的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程只能通過(guò)截取不同暴露階段的不同生物樣品進(jìn)行探索，無(wú)損且能夠?qū)y(cè)試生物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的分析方法將是相關(guān)技術(shù)未來(lái)發(fā)展的方向。

表4 不同技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及使用范圍Table 4 Advantages，disadvantages and application scope of different technologies