檢測SARS-CoV-2的電化學生物傳感器研究進展

竇雪晨，王 冠，張 寧，程 智，杜耀華，田 豐

（軍事科學院系統工程研究院 衛勤保障技術研究所，天津 300161）

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）是一種新發現的人類冠狀病毒，是引起新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的主要病原體。起始于2019年年末、至今未完全遏制的COVID-19的全球大流行，導致了世界范圍內極高的發病率和嚴重的死亡率［1-4］，造成了生活、交通、經濟、醫療等多方面的嚴重問題。COVID-19的潛伏時間長、傳播速度快且存在40%～45%的無癥狀感染［5］，而無癥狀感染者的未知傳播途徑和傳播能力給疾病的預防和控制帶來了眾多監管難題。與此同時，SARS-CoV-2的ORF1（Open reading frame 1）還存在多個變異位點［6］。隨著時間的推移，目前已知SARS-CoV-2病毒已有阿爾法變體、德爾塔（Delta）變異毒株等［7-8］。因此，快速、準確的大規模篩查是遏制病毒傳播的最有效手段之一。

目前，可用于診斷COVID-19的方法包括實時逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、抗原檢測和血清學檢測等。迄今為止，RT-PCR 仍被認為是診斷COVID-19的金標準［9］。然而，RT-PCR 檢測時首先需對病毒進行核酸提取及RNA 的體外指數擴增，存在前處理步驟煩瑣、檢測時間長，需要高精尖設備及專業素養高的操作人員等缺點，不適用于現場的快速診斷。電化學生物傳感器因靈敏、便攜、穩健性高、小型化、成本低等優點被認為是臨床診斷中實時監測新冠肺炎的最強大的替代工具之一［10-11］，而其檢測時間短（可在數分鐘內獲得現場檢測人員的陽性/陰性結果）的優勢還可用于開發COVID-19的即時檢驗（Point-of-care testing，POCT）設備。本文以可特異性檢測SARS-CoV-2 的刺突蛋白（Spike protein）、核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein）和病毒核糖核酸（RNA）3個生物標志物為切入點，綜述了基于抗原和遺傳物質檢測SARS-CoV-2 的電化學生物傳感器研究進展，旨在為設計現場快速診斷COVID-19的設備提供有力支撐。

1 基于刺突蛋白診斷COVID-19的電化學生物傳感器

SARS-CoV-2由刺突蛋白、核衣殼蛋白、包膜蛋白和膜蛋白4種結構蛋白組成［12-13］。其中，刺突蛋白是一種可用于診斷COVID-19 的靶標蛋白，具有高度免疫原性以及受體結合域（Receptor binding domain，RBD），因此將SARS-CoV-2的刺突蛋白用于診斷COVID-19以及研制疫苗和相關治療藥物等方面具有重要意義［14］。基于此，大量學者以檢測刺突蛋白為目標，設計了多種可檢測SARS-CoV-2的電化學生物傳感器。

Seo 等［12］基 于 場 效 應 晶 體 管（Field-effect transistor，FET）設計了一種可用于臨床樣本檢測SARS-CoV-2 以實現COVID-19 診斷的電化學生物傳感器。通過在FET 的石墨烯電極片上用1-芘丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（PBASE）進行修飾，并將其作為界面偶聯劑固定SARS-CoV-2 刺突蛋白特異性抗體（如圖1A）后，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH 7.4）完全覆蓋FET 作為電解質，基于管道的表面的電位變化和對電響應影響實現SARS-CoV-2 的臨床樣本檢測，得到其檢出限為2.42 × 102copies/mL。基于FET 的電化學生物傳感器具有成本低、靈敏度高、動態響應范圍廣等優勢，為臨床檢測SARS-CoV-2、診斷COVID-19 提供了一種無需對樣品進行預處理或標記的高靈敏免疫學診斷方法。Vadlamani 等［14］設計了一種低成本、高靈敏度的二氧化鈦納米管（Co-TNTs）電化學生物傳感器：通過一步電化學陽極氧化方法合成TNTs，采用離子交換對TNTs平臺進行鈷功能化后，將其連接到恒電位儀上進行數據采集，并采用電流法檢測刺突蛋白表面的RBD快速檢測SARS-CoV-2以診斷COVID-19。基于Co-TNTs的電化學生物傳感器在較低病毒蛋白載量范圍內可特異性檢測SARS-CoV-2 刺突蛋白RBD，并在檢測濃度范圍內表現出線性響應。此傳感器的最大優勢在于檢測速度快，約30 s 即可高效檢測SARS-CoV-2 刺突蛋白RBD。未來，可將其用于開發一款快速診斷口鼻分泌物中是否存在SARS-CoV-2 的即時診斷設備。Fabiani 等［15］基于磁珠的電化學檢測方法和炭黑基的絲網印刷電極設計了一種可同時對唾液中SARS-CoV-2 刺突蛋白和核衣殼蛋白進行檢測的高靈敏度電化學生物傳感器（如圖1B）。該傳感器以PalmSens便攜式恒電位儀作為讀數計，在30 min 內通過伏安曲線檢測到未進行處理的唾液樣本中的刺突蛋白和核衣殼蛋白，檢出限分別為19 ng/mL和8 ng/mL。將該傳感器與實時定量PCR檢測同一樣本的數據進行對比，發現數據一致性較好且檢測速度更快。Lima等［16］利用半胱胺穩定的AuNPs 改性石墨鉛筆芯和塑料瓶，以血管緊張素轉換酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）作為識別元件，設計了一種快速、低成本、高便攜度的可檢測SARS-CoV-2刺突蛋白的電化學生物傳感器。在塑料瓶中將50μL含有刺突蛋白的PBS加入石墨電極中孵育5 min，隨后加入1 mL 自制的氧化還原探針溶液并檢測刺突蛋白與電化學生物傳感器結合后的電流抑制情況。該傳感器可在6.5 min 內診斷疑似患者是否感染COVID-19，且對SARSCoV-2刺突蛋白的檢出限為229 fg/mL，測試費僅需1.5 美元。

圖1 基于刺突蛋白檢測SARS-CoV-2的電化學傳感器Fig.1 Electrochemical sensor based on SARS-CoV-2 detection with spike protein A. FET-based electrochemical biosensor for COVID-19（基于FET的COVID-19電化學生物傳感器）［12］；B. carbon black-based electrochemical sensor with screen-printed electrodes for detection of SARS-CoV-2（基于炭黑基的絲網印刷電極電化學傳感器檢測SARS-CoV-2）［15］

此外，還有一些其他基于SARS-CoV-2刺突蛋白檢測以診斷COVID-19的電化學傳感器。如Liv等［17］利用牛血清蛋白、SARS-CoV-2刺突蛋白抗體和功能化氧化石墨烯修飾玻碳電極（BSA/AB/f-GO/GCE）或絲網印刷電極（BSA/AB/f-GO/SPE）組成電化學生物傳感器，通過抗原-抗體之間的相互作用，利用伏安法測定SARS-CoV-2刺突蛋白；Zaccariotto等［18］設計了一種利用還原的氧化石墨烯修飾玻碳電極的電化學生物傳感器，通過電化學阻抗譜和循環伏安法成功檢測了唾液樣本中SARS-CoV-2刺突蛋白RBD；Guo等［19］利用特制的納米有機電化學晶體管，根據檢測過程中的電流變化，成功檢測了不同病毒載量的未經處理的臨床鼻咽拭子和唾液樣本中的SARS-CoV-2刺突蛋白；Yousefi等［20］將特異性抗體固定在包含還原探針的雙鏈DNA上，采用計時電流法，根據傳感器結合刺突蛋白前后的表面流體力學變化實現了SARS-CoV-2的檢測，檢測時間在5 min 內；El-Said 等［21］使用高度均勻的Au微立方體作為微電極，以抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗體為探針，基于循環伏安法和方波伏安法對SARS-CoV-2刺突蛋白進行檢測，得到檢測范圍為100 pmol/L ～5 nmol/L，檢出限為276 fmol/L；Zhang 等［22］利用自制的二聚體DNA 適體DSA1N5設計了一種簡單快速的基于唾液的SARS-CoV-2抗原檢測的電化學傳感器，用于識別野生型病毒及其Alpha和Delta變體的刺突蛋白；Idili等［23］利用電化學適配體設計了一種快速、無試劑、可定量檢測SARS-CoV-2刺突蛋白的傳感器，可在15 s內檢測到目標蛋白，且能區分類目標蛋白與其他干擾蛋白。表1總結了近3年基于刺突蛋白檢測SARS-CoV-2的電化學傳感器，這些成果為后續設計基于SARS-CoV-2刺突蛋白診斷COVID-19的便攜式設備提了供研究基礎及理論依據。

表1 基于刺突蛋白檢測SARS-CoV-2的電化學傳感器Table 1 Electrochemical sensor based on SARS-CoV-2 detection with spike protein

由于刺突蛋白位于SARS-CoV-2 病毒的表面，因此采用電化學生物傳感器無需進行前處理即可實現刺突蛋白的檢測，且具有操作簡便、檢測速度快等優勢。目前基于刺突蛋白診斷COVID-19 的電化學生物傳感器研究已有很多報道［24-33］，但僅針對刺突蛋白進行SARS-CoV-2 檢測以診斷COVID-19還存在不確定性，可能產生假陽/陰性結果。例如，刺突蛋白存在多個變異位點，隨著時間的推移會根據地理位置等相關條件的變化產生變異［34-35］，如已知的德爾塔變異病毒株。而基于刺突蛋白檢測SARS-CoV-2 的電化學生物傳感器一般是檢測刺突蛋白的固定片段，若刺突蛋白的相關片段發生變異，則極有可能造成檢測的假陽/陰性結果，這對于目前變異毒株的即時快速檢測是一大阻礙。

2 基于核衣殼蛋白檢測SARS-CoV-2的電化學生物傳感器

相較于刺突蛋白，核衣殼蛋白更加穩定，隨時間推移突變較少［36-40］，且核衣殼蛋白在COVID-19患者感染期間會大量表達［41］，從而在COVID-19患者血清中可檢測到較高濃度的核衣殼蛋白的免疫球蛋白（Immunoglobulin G，IgG）抗體。同時，已有學者的研究證明了核衣殼蛋白對SARS-CoV-2 病毒的整個生命周期至關重要［42］。因此，通過檢測核衣殼蛋白診斷COVID-19是一條可行之路。

Raziq 等［43］利用具有合成分子識別功能的分子印跡聚合物（MIP）構建核衣殼蛋白-MIP 識別原件并以其修飾Au 薄膜電極，設計了一種可檢測SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的電化學生物傳感器（如圖2A）。該傳感器可由平板計算機或智能手機中的軟件連接便攜式恒電位儀，通過氧化還原探針測量核衣殼蛋白-MIP 元件到Au 薄膜電極的電荷轉移強度，從而得到與病毒蛋白濃度相關的電流大小。結果表明，該傳感器不僅與SARS-CoV-2核衣殼蛋白濃度在2.22 ～111 fmol/L范圍內呈良好的線性關系，檢出限低至15 fmol/L，還可以通過MIP 區分SARS-CoV-2 核衣殼蛋白和干擾蛋白（BSA、CD48、E2 HCV等），獲得良好的特異性。Tian等［44］通過修飾Au@Pt納米粒子和酶的金屬-有機骨架MIL-53，設計了一種檢測SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的雙適配體電化學生物傳感器。通過將2 個巰基修飾的不同核酸適配體固定在電極表面捕獲SARS-CoV-2 核衣殼蛋白，再通過修飾Au@Pt/MIL-53 材料構成適配體-蛋白質-納米探針的免疫夾心體系。研究結果顯示，傳感器對SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的線性范圍為0.025 ～50 ng/mL，檢出限為8.33 pg/mL。Eissa等［45］將SARS-CoV-2核衣殼蛋白固定在碳納米纖維修飾的絲網印刷電極上，設計了一種可檢測SARS-CoV-2 的電化學生物傳感器（如圖2B）。該傳感器利用方波伏安法，通過在檢測溶液中加入固定數量的核衣殼蛋白抗體確定所含核衣殼蛋白的濃度，檢出限為0.8 pg/mL。該傳感器具有無需樣本轉移和預處理，即可直接快速檢測的優勢，且不與人乳頭狀瘤病毒等其他病毒的抗原發生交叉反應，具有一定的選擇性。Li等［46］采用辣根過氧化物酶和目標抗體雙重標記的磁珠進行免疫磁性富集和信號放大策略，利用絲網印刷金電極電化學傳感器，根據電流響應成功地檢測了SARS-CoV-2 核衣殼蛋白。該傳感器可在55 min 內檢測到全血中的目標蛋白，檢出限為50 pg/mL；可在30 min 內于5 倍稀釋血清中檢測到目標蛋白，檢出限為10 pg/mL，具有便攜性高、操作簡單、靈敏度高等優勢。Eissa 等［47］使用11-巰基十一烷酸對納米金修飾的絲網印刷電極進行功能化，并將抗SARS-CoV-2 核衣殼抗體附在電極上，通過方波伏安法檢測還原峰電流的變化，以無標記形式實現了SARS-COV-2核衣殼蛋白的檢測。該傳感器的線性范圍為1.0 pg/mL ～100 ng/mL，在磷酸鹽緩沖液溶液中的檢出限為0.4 pg/mL，具有小型化、成本低、快速響應等優勢，且對SARSCoV-2 具有高度選擇性。與此同時，聚焦于核衣殼蛋白檢測診斷COVID-9 的電化學傳感器研究還有很多［48-50］。如Torrente-Rodríguez 等［48］利用可批量生產的激光雕刻石墨烯電極設計了一種超靈敏、低成本、多路復用的電化學傳感器，不僅可檢測SARS-CoV-2病毒抗原核衣殼蛋白、IgM 和IgG 抗體以及炎癥生物標志物C 反應蛋白等多種評估COVID-19 的生物標志物，還具有檢測速度快、選擇性高等優勢；Torres 等［49］構建了一種由血管緊張素轉換酶2 修飾的微型生物傳感器并將其命名為RAPID 1.0，可在4 min 內通過測量電化學阻抗譜的變化實現對鼻咽/口咽拭子和唾液樣本中核衣殼蛋白的檢測，具有高的特異性、敏感性和準確性；Singh等［50］設計了一種基于適配體的電化學葡萄糖傳感器，可利用市面現有的血糖儀檢測SARS-CoV-2病毒的核衣殼蛋白或刺突蛋白，且蛋白濃度與血糖濃度成正比，具有成本低、設備易于獲取且無需額外投入等優勢。表2總結了近3年基于核衣殼蛋白診斷COVID-19 的電化學傳感器研究工作［15，43-47，49-52］。

表2 基于核衣殼蛋白檢測SARS-CoV-2的電化學傳感器Table 2 Electrochemical sensor based on SARS-CoV-2 detection with nuclear capsid proteins

圖2 基于核衣殼蛋白的電化學傳感器Fig.2 Electrochemical sensors based on the nucleocapsid proteins A. COVID-19 diagnostics principle by nucleocapsid protein sensor analyzing the samples prepared from nasopharyngeal swab specimens of patients（利用核衣殼蛋白傳感器診斷COVID-19患者鼻咽拭子標本）［43］；B. detection principle diagram of dual aptamer electrochemical biosensor（雙適配體電化學生物傳感器檢測原理圖）［45］

與基于刺突蛋白的電化學傳感器研究相比，基于核衣殼蛋白的電化學傳感器研究較少，這可能與核衣殼蛋白所處位置有關。核衣殼蛋白是SARS-CoV-2 病毒內部的結構蛋白，部分電化學生物傳感器在檢測前需將SARS-CoV-2 病毒裂解，從而釋放其內部的核衣殼蛋白。相較于對SARS-CoV-2的RNA進行檢測，基于核衣殼蛋白檢測以診斷COVID-19的電化學生物傳感器在操作便捷性、試劑成本及檢測成本、操作人員專業技能要求、檢測時間等方面仍具有相當優勢。未來，基于核衣殼蛋白檢測的電化學生物傳感器可專注于開發快速即時診斷COVID-19的檢測設備，以應對現場大規模快速篩查和及早診斷。

3 基于RNA檢測SARS-CoV-2的電化學生物傳感器

基于RNA的RT-PCR檢測是直接對SARS-CoV-2病毒的RNA進行檢測，因此該技術被公認為是診斷COVID-19的金標準，且檢測靈敏度高，檢出限可優化至3.9 copies［53］。但RNA 檢測需特有的、昂貴的檢驗設備，樣本采樣后須轉運至專門的實驗室。若在轉運或操作過程中存在失誤，則可能造成樣本的假陽/陰性結果。因此，部分學者研究了基于RNA 檢測診斷COVID-19 的可便攜電化學生物傳感器。

Alafeef等［54］利用石墨烯和金納米粒子設計了一種超靈敏電化學生物傳感器（如圖3A），其中金電極利用疏基修飾的反義寡核苷酸進行修飾，在未進行核酸擴增的情況下，通過監測石墨烯表面電荷和電子遷移率的變化可在5 min內快速、準確、高選擇性和超靈敏地檢測到SARS-CoV-2 RNA，檢出限為6.9 copies/μL。與其他研究成果相比［12-14，55-62］，該傳感器不僅提高了靈敏度，加快了響應速度，還降低了RNA 檢測的成本。Peng 等［63］利用離子的靜電吸附作用可顯著放大電化學信號的原理設計催化發夾組裝的信號放大策略，設計了一種靈敏檢測SARS-CoV-2 RNA 的電化學生物傳感器，其檢測原理如圖3B。將傳感器用于感染患者的血清、唾液和咽喉樣本中SARS-CoV-2 RNA 的檢測，得到檢出限為26 fmol/L。方法避免了繁瑣的實驗步驟和復雜的探針修改，增強檢測信號的同時也提升了傳感器的抗干擾能力。Zhao 等［64］利用杯芳烴功能化氧化石墨烯設計了一種靶向SARS-CoV-2 RNA 的超靈敏電化學生物傳感器。通過預制混合液A 和B對病毒的RNA 進行提取，隨后用傳感器進行檢測并將其與智能手機關聯，基于超夾心識別策略通過電化學信號峰的變化確認靶標是否存在（靶標存在時，電化學信號峰高；無靶標時，電化學信號峰弱）。該傳感器檢測無需大型設備和專業操作人員，也無需核酸擴增和逆轉錄等步驟，且具有高度特異性和選擇性，對臨床樣本的檢出限為200 copies/mL。但其操作步驟增加，檢測時長超過3 h，使之在快速檢測方面仍有不足。

圖3 基于RNA檢測的電化學生物傳感器Fig.3 Electrochemical biosensor based on RNA detection A. schematic diagram of ultra-sensitive electrochemical biosensor detection（超靈敏電化學生物傳感器檢測原理圖）［54］；B. principle of the proposed electrochemical biosensor for sensitive analysis of SARS-CoV-2 RNA（SARS-CoV-2RNA靈敏分析的電化學生物傳感器的原理）［63］

目前，基于RNA 檢測SARS-CoV-2的電化學生物傳感器發展如火如荼，但受限于未對RNA 進行擴增等前處理，此類傳感器或靈敏度不理想，或對傳感器電極和表面修飾過于復雜。因此，如何在不進行RNA 擴增，以及表面修飾步驟簡單的前提下提高靈敏度是目前此類電化學生物傳感器亟需解決的問題。

表3 總結了部分基于刺突蛋白、核衣殼蛋白和RNA 檢測SARS-CoV-2 的電化學生物傳感器的構建方法及參數，可看出3 種類型電化學傳感器檢測SARS-CoV-2 的檢出限范圍跨度很大，部分電化學傳感器的靈敏度完全可媲美RT-PCR 的RNA 檢測，且縮短了檢測時間。因此，電化學傳感器更適用于現場快速篩選潛伏期患者，尤其是基于刺突蛋白的電化學傳感器，因其位于病毒表面，更易于檢測。而基于核衣殼蛋白和RNA 的電化學傳感器可對疑似患者進行二次現場快速篩選，以輔助診斷COVID-19患者。

表3 基于RNA檢測SARS-CoV-2的電化學傳感器Table 3 Electrochemical biosensors for detecting SARS-CoV-2 based on RNA

4 與其他方法的比較

目前，還有一些檢測SARS-CoV-2的其他生物傳感器方法［65-73］，如基于熒光檢測的生物傳感器、基于抗體檢測的電化學傳感器等。Kim 等［66］結合重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification，RPA）技術設計了一種可快速檢測SARS-CoV-2的電化學生物傳感器，通過脈沖伏安法可檢出多個靶基因；Yakoh 等［67］基于橫向流動測定設計了一種無標記的紙基電化學傳感器，可用于SARS-CoV-2 抗體的檢測；Gao 等［68］基于AuNPs 提出了一種比色/表面增強拉曼散射/熒光三模式生物傳感器，可在40 min內快速選擇性檢測病毒的RNA。表4總結了近年電化學傳感器和RT-PCR 等檢測SARS-CoV-2方法的參數和性能對比，可看出RNA的檢測用時普遍高于電化學傳感器，且需要復雜、昂貴的專用設備。

表4 電化學法與常規SARS-CoV-2 檢測方法的比較Table 4 Comparison of electrochemical and conventional SARS-CoV-2 detection methods

經典的RT-PCR 法通過提取RNA 進行COVID-19 檢測，并憑借其高度敏感性和特異性成為診斷金標準，其檢測時長雖已減至約2 h［74-78］，但仍存在專業檢測設備昂貴、對人員專業技能要求高、檢測時間長等不足，且引物探針的設計對識別唯一靶序列的準確性至關重要［79-80］。為進一步縮短分析時長并降低檢測要求，大量學者在減少核酸擴增時間方面進行了相關研究［81-95］。如Vincent 等［96］提出利用快速循環光纖和反饋控制的激光加熱縮短PCR 的加熱周期，Xu 等［97］利用逆轉錄PCR 環介導的等溫擴增（Reverse transcription PCR-LAMP，RT-LAMP）技術減少分析周期。但目前仍很少有核酸擴增實驗被授權用于即時檢測［98］。

5 總結與展望

本文綜述了基于抗原和遺傳物質RNA 檢測的電化學生物傳感器，此類傳感器通過直接測定SARS-CoV-2 對感染COVID-19 的患者進行無創檢測。無論是確診患者，還是潛伏期患者，只要感染了SARS-CoV-2 病毒，基于抗原和遺傳物質RNA 檢測的電化學生物傳感器即可對其進行相關檢測以輔助COVID-19診斷。此外，電化學生物傳感器因具有響應速度快、前處理步驟簡單、成本低等優勢，被廣泛用于便攜式、小型分析設備的研發，但將其用于商業化應用仍不成熟。例如，大部分電化學生物傳感器在檢測時均為恒定的實驗室條件，當外界物理條件改變時，部分電化學生物傳感器的性質會發生一定變化，穩定性欠佳；同時，如何保證基于刺突蛋白、核衣殼蛋白等檢測的電化學生物傳感器在非潔凈環境中其微小結構不受污染、不影響檢測結果也是亟需解決的問題。此外，由于臨床樣本的復雜性，電化學生物傳感器的檢測靈敏度相較于標準品（PBS 環境）有顯著差異。因此，對電化學生物傳感器進行評價時還應考慮臨床樣本感染等多種情況。

與作為金標準的RT-PCR 檢測方法相比，用于檢測SARS-CoV-2 的電化學生物傳感器主要以快速、便攜、低成本等為目的，少有對樣本的前處理步驟，導致大多電化學生物傳感器存在檢測靈敏度不高或穩定性欠佳的不足，尤其是在病毒載量極低時無法正常檢出［99-100］。

未來，期望可以通過優化檢測電極材料及反應條件、修飾檢測探針等，以及與其他免疫檢測方法（如側向流免疫層析、膠體金、免疫熒光等）進行多學科的交叉融合［101-105］，以研發可快速、準確檢測SARS-CoV-2 病毒的成熟電化學生物傳感器，并將其商業化，從而對COVID-19 患者做到早發現、早隔離、早治療，盡早阻斷SARS-CoV-2病毒的傳播。