針刀干預對膝骨關節炎兔原代軟骨細胞活性、凋亡及自噬的影響

修忠標 劉 洪 張良志 劉 晶 林巧璇 盧莉銘 郭澤興 楊金碩

1.福建中醫藥大學附屬人民醫院骨傷一科，福建福州 350004；2.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院骨傷科，福建福州 350122；3.福建中醫藥大學中醫學院，福建福州 350122；4.福建中醫藥大學附屬康復醫院骨傷科，福建福州 350003

中醫原創微創技術針刀療法治療膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）效果明確，已被多個KOA臨床診療指南推薦[1-2]，然而其具體作用機制尚不明確。既往研究表明，筋骨失衡引起的異常機械應力可通過調控軟骨細胞自噬和凋亡水平參與KOA 軟骨退變[3-4]。而針刀可恢復膝周骨骼肌、韌帶功能，調整膝關節力學結構，調節筋骨平衡，延緩軟骨病理改變[5-7]。針刀治療KOA 軟骨保護作用可能與調節軟骨細胞自噬和凋亡水平相關，團隊前期已從軟骨組織學層面證實，針刀可減少KOA 兔細胞凋亡，改善軟骨病理形態[8-9]，本研究將進一步從原代軟骨細胞活性、凋亡和自噬等層面來探討針刀改善KOA 退變的治療機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

普通健康雄性6 月齡新西蘭大白兔24 只，體重（2.5±0.5）kg，購于上海松聯實驗動物責任有限公司[生產許可證號碼：SCXK（滬）2017-0008]，由福建中醫藥大學實驗動物中心[合格證號：SYXK（閩）2019-0007]代購并飼養。單籠喂養，自然光照，自由進食、飲水，室溫（23±2）℃。本研究通過福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批件號：FJTCMIACUC），整個實驗過程中對動物的各種處理均遵照科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導意見》有關動物的使用及倫理學規定。

1.2 實驗試劑與主要儀器

戊巴比妥鈉（上海上藥新亞有限公司，生產批號：811B025）；胰蛋白酶（德國Biofroxx 1004GR100）、DMEM 高糖培養基（美國HyClone D6429）；胎牛血清（澳大利亞Gibco 10099）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，貨號：P1110）；雙抗（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：SV30010）；CCK-8 法細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C0038）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術有效公司，貨號：KGA108）；anti-LC3B 抗體（廣州徠智生物科技有限公司，貨號：bs-2912R）。一次性使用0.4 mm×40 mm 無菌小針刀（江西老宗醫醫療器械有限公司，批號：20172270270）；AX002 型高分子石膏（陜西安信醫學技術開發有限公司）；KL-T1 型自動脫水機（湖北康龍電子科技有限責任公司）；BMJ-A 型組織包埋機（常州中威電子儀器）；RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司）；YT-CJ-2NB 型超凈工作臺（北京亞泰?。?；DH-160 型二氧化碳培養箱（上海三藤儀器Ⅰ）；DSZ2000X 型倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業儀器）；SL02 型低速離心機（知信儀器）；RAD SPEED型數字化拍片系統（日本島津DR 機）；NIB900-FL 型倒置熒光顯微鏡（河南兄弟儀器設備有限公司）；離心機（Labofuge 400R）；CytoFLEX 型流式細胞儀（貝克曼庫爾特公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模 適應性飼養1 周后，按體重進行編號，并應用隨機數字表法將其分為空白組、模型組、針刀組，每組8 只。模型組、針刀組采用本團隊前期研究的改良Videman 法[13]固定，左后肢膝關節伸直中立位0°放置石膏托，使用高分子石膏繃帶、防啃咬繃帶環繞，使膝關節固定于伸直中立位0°，踝關節背曲60°塑形，固定6 周[9]。空白組不予處理。

1.3.2 干預 造模成功后，根據《中國經筋學》中關于膝關節經筋病變規律及整合相關文獻分析[10-12]，選取常見病灶點“鶴頂次（股四頭肌肌腱髕骨上緣附著處）”“髕內下（髕內側支持帶髕骨內下緣附著處）”“髕外下（髕外側支持帶髕骨外下緣附著處）”“成腓間（外側關節間隙中膝外側副韌帶處）”“委陽次（股二頭肌內側緣）”“陰陵次（鵝足腱脛骨內側止點處）”，常規消毒鋪巾，采用一次性無菌小針刀干預，垂直治療點皮膚進針直至抵達病變處，松解范圍應＜0.5 cm。干預周期為1 個月，每周干預1 次。其余兩組不予特殊處理。通過X 線檢測對造模兔進行模型評價，結果顯示關節間隙變窄、周圍骨贅形成表明造模成功[13]。見圖1。

1.3.3 原代軟骨細胞提取和鑒定 干預結束1 周后，對各組8 只新西蘭兔進行原代軟骨細胞提取和鑒定，分別腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（1.5 ml/kg）麻醉后空氣栓塞法處死，無菌條件下迅速解剖截取膝關節，然后超凈工作臺上用刀片刮切軟骨至細小碎塊，轉移至50 ml離心管中，加入5 ml 0.02%Ⅱ型膠原酶、5 ml DMEM培養基，放置CO2培養箱培養4 h；然后通過篩網過濾收集細胞，離心半徑11.5 cm、1000 r/min 離心5 min，吸去上清，加入2.5 ml 含體積分數10%胎牛血清的DMEM 培養基，吹打均勻后接種于細胞培養皿，倒置顯微鏡觀察細胞形態。然后采用Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光細胞染色進行軟骨細胞鑒定，Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞染色可見軟骨細胞胞核清晰，呈藍色[14]。見圖2。

1.3.4 CCK-8 檢測細胞活性 96 孔板加入空白組、模型組、針刀組原代軟骨細胞100 μl/孔，向各孔中加入10 μl CCK-8 檢測溶液，分別在37℃下孵育1、2、4、6、8、12 h，酶標儀在450 nm 波長處檢測每孔的吸光度。以培養時間為橫軸，吸光度值為縱軸，繪制生長曲線。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI 雙染流式檢測細胞凋亡用PBS 分別洗滌空白組、模型組、針刀組原代軟骨細胞二次，離心半徑11.5 cm、1000 r/min 離心5 min，收集細胞，加入500 μl 的Binding Buffer 懸浮細胞；加入5 μl Annexin V-FITC 混勻后，加入5 μl Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應10 min；然后進行流式細胞儀的觀察和檢測。應用FACSdiva 軟件獲取10000 個細胞，并進行結果分析，以Annexin V-FITC為橫坐標、PI 為縱坐標作圖。每組實驗重復3 次。

1.3.6 LC3B 免疫熒光染色檢測細胞自噬水平 分別制作空白組、模型組、針刀組的細胞爬片，PBS 清洗3 次，用4%多聚甲醛固定30 min；PBS 沖洗，加入0.3%曲拉通37℃通透30 min；PBS 沖洗；5% BSA 37℃封閉60 min；PBS 沖洗，滴加1∶100 的一抗LC3B，4℃過夜；PBS 沖洗，滴加50 μl 抗-LC3B-IgG 標記熒光二抗（1∶500），37℃孵育90 min；PBS 沖洗，DAPI 工作液37℃染核10 min；PBS 沖洗，緩沖甘油封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察。每組實驗重復3 次，凋亡率取平均值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組實驗兔情況

實驗期間三組實驗兔狀態良好，體重與進食量基本一致，無死亡。

2.2 三組兔原代軟骨細胞CCK-8 細胞活性檢測比較

三組組內各時間點細胞活性比較，差異均有統計學意義（P ＜0.05）；模型組同期細胞活性低于空白組，針刀組同期細胞活性高于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

2.3 三組兔原代軟骨細胞Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞凋亡檢測比較

模型組軟骨細胞凋亡率高于空白組（P ＜0.05），針刀組軟骨細胞凋亡率低于模型組（P ＜0.05）。見圖4、表1。

表1 三組Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞凋亡率比較

2.4 三組兔原代軟骨細胞LC3B 免疫熒光染色細胞自噬水平檢測比較

與空白組比較，模型組LC3B 熒光強度下降。與模型組比較，針刀組LC3B 熒光強度增強。見圖5。

3 討論

KOA 被認為是以關節軟骨退行性變、骨贅形成、軟骨下骨增厚、滑膜炎癥、半月板損傷等為特征的慢性退行性疾患?，F代醫學研究認為筋骨失衡導致的異常機械應力可誘導KOA 軟骨退變。自噬在機械壓力、缺氧、內質網應激等異常生理條件下對軟骨細胞起保護作用，在調節能量和營養、維持體內能量代謝方面起著至關重要的作用，可通過溶酶體對受損或老化的細胞器進行降解和再利用，提供氨基酸、核苷酸、糖類和脂肪酸來維持組織穩態[15]，與軟骨細胞的生長、增殖和凋亡等過程密切相關，參與了KOA 重要病理過程[16]。因此，糾正關節軟骨表面異常機械應力分布和改善軟骨免疫微環境治療KOA 有效途徑[17-18]。

中醫多從“筋骨”角度來認識KOA，《素問·痿論》曰：“宗筋主束骨而利機關也?！弊闳柦浗詈妥闳幗浗瞽h繞膝周，各經筋之間相互協調，從而保證關節屈伸功能。KOA 的發病與經筋失衡（骨骼肌、韌帶損傷和神經支配功能障礙），筋骨力學結構改變，繼而軟骨退變密切相關[19]。團隊前期梳理經筋理論，研究表明“橫絡痹阻、筋骨失衡、氣血失和”是KOA 關鍵病機，通過針刀松解膝周經筋病灶點“解結橫絡”，以“調衡筋骨、調和氣血”，從而有效治療KOA[20]。

自噬作為一種高度保守的細胞行為，對于維持體內穩態促進細胞存活具有重要意義[21]。研究表明[22-23]，軟骨細胞自噬水平的升高能夠有效抑制軟骨細胞凋亡。本研究結果顯示，針刀治療能夠提高軟骨細胞自噬水平，且對于軟骨細胞增殖活性起到促進作用，進一步抑制軟骨細胞凋亡。軟骨細胞凋亡是KOA 膝關節軟骨退變機制中的重要一環[24-26]，軟骨細胞凋亡受到多種蛋白調控，但其具體機制尚不明確[27-28]。本研究結果顯示，針刀治療能夠抑制軟骨細胞凋亡，從而發揮對軟骨的保護作用。然而，針刀是通過何種途徑對軟骨細胞自噬和凋亡產生影響，尚需進一步探索和研究。