基于化學(xué)成分變化對(duì)炆遠(yuǎn)志“減毒”效應(yīng)研究

丁平平 ，易斌 ，陳華師 ，陳明霞，4，呂尚 ，2，張青 ，陳西勇，饒毅 ，2

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌 330000；3.江西建昌幫藥業(yè)有限公司，江西 撫州 344000；4.北京斯利安藥業(yè)有限公司，北京 100176）

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志（PolygalatenuifoliaWilld.）的干燥根，主要含有三萜皂苷類、寡糖酯類、酮類成分[1-2]。其中遠(yuǎn)志皂苷類成分包括遠(yuǎn)志皂苷A、B、C、D等多種原型皂苷，經(jīng)高溫炮制后水解成具有相同母核的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和遠(yuǎn)志酸（見圖1）。遠(yuǎn)志既具有安神益智、祛痰、消腫的作用，同時(shí)還對(duì)胃腸道有刺激性[3-4]。文獻(xiàn)研究表明，遠(yuǎn)志經(jīng)蜜炙后遠(yuǎn)志皂苷B的含量下降，從而降低了胃腸道毒性，因此可將遠(yuǎn)志進(jìn)行炮制以降低胃腸道毒性[5-6]。歷代醫(yī)方本草對(duì)遠(yuǎn)志的炮制方法記載眾多，甘草制遠(yuǎn)志習(xí)稱制遠(yuǎn)志，首載于《雷公炮炙論》，是目前臨床應(yīng)用最多的炮制品，為2020年版《中國(guó)藥典》所收載。炆法炮制為江西建昌幫藥業(yè)有限公司獨(dú)門炮制技藝，經(jīng)考證最早出自明朝繆希雍《炮炙大法》，早在東晉葛洪已有應(yīng)用，具有“工具輔料獨(dú)特，工藝取法烹飪，講究形色氣味，毒性低療效高”的炮制風(fēng)格，在贛閩地區(qū)廣為流傳，代表飲片有炆熟地、炆黃精、炆遠(yuǎn)志等[7-8]。目前，未見炆遠(yuǎn)志化學(xué)成分與毒性關(guān)系的研究報(bào)道。

圖1 遠(yuǎn)志中的皂苷類成分結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structural formula of saponins in P.tenuifolia

本文以炆遠(yuǎn)志為研究樣品，與生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志進(jìn)行對(duì)比研究，選用遠(yuǎn)志原型皂苷類成分中含量較高的遠(yuǎn)志皂苷B為代表，以及遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖酯、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志酸為檢測(cè)指標(biāo)，分析遠(yuǎn)志炆制過程各成分之間的變化規(guī)律；并針對(duì)具有毒性的遠(yuǎn)志皂苷B變化情況，采用小鼠小腸上皮隱窩細(xì)胞（IEC-6細(xì)胞）為模型，以IC50和可間接反應(yīng)機(jī)體組織細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）為指標(biāo)[9-12]，比較3者對(duì)胃腸道的毒性，研究炆遠(yuǎn)志化學(xué)成分變化與毒性之間的關(guān)系。

1 材料與儀器

1.1 材料

遠(yuǎn)志藥材：批號(hào) Y068-201204、Y068-201206、Y068-201210，由江西建昌幫藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付小梅教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志（PolygalatenuifoliaWilld.）的干燥根。

小鼠小腸上皮隱窩細(xì)胞系（IEC-6細(xì)胞），購(gòu)自中喬新舟生物公司。

DMEM高糖培養(yǎng)基（Solarbio，批號(hào)：12100）；胎牛血清（ExCell Bio，批號(hào)：FSP500）；PBS磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.2-7.4，Solarbio，批號(hào)：P1020）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio，批號(hào)：T1300）；二甲亞砜（DMSO，POWER CELL，批號(hào)：O1028A）；Cell Counting Kit-8（meilunbio，批號(hào)：MA0218-3-Mar-05G）。丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)：A003-1-2）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（批號(hào)：A006-2-1）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)：A001-3-2）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。3，6′-二芥子酰基蔗糖酯（批號(hào)：20021903，純度≧98.0%）、遠(yuǎn)志酮Ⅲ（批號(hào)：YRY144-200401，純度≧98.0%）、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷（批號(hào)：PS000954，純度≧98.0%）、遠(yuǎn)志皂苷B（批號(hào)：35906-36-6，純度≧98.0%）、遠(yuǎn)志酸（批號(hào)：110796-201922，純度＞99.2%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB104-N萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AUW2200十萬(wàn)分之一電子分析天平（日本島津公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；恒溫電熱套（常州國(guó)華公司）；SpectraMax I3多功能酶標(biāo)儀（MD，USA美國(guó)）；BA410生物顯微鏡（廈門Motic公司）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（NAPCO）。

2 方法

2.1 炮制品的制備

生遠(yuǎn)志：取遠(yuǎn)志藥材，洗凈，去除遠(yuǎn)志木質(zhì)心，

2.2 遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖酯和細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量測(cè)定

采用2020年版《中國(guó)藥典》“遠(yuǎn)志”項(xiàng)下的方法。

2.3 遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志酸的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）；以乙腈（A）-0.05%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～5 min,85%～75%B;5～10 min,75%～65%B;10～50 min,65%～53%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志酸對(duì)照品適量，精密稱定，分別加70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇制成每1 mL含1 mg遠(yuǎn)志皂苷B、0.2 mg遠(yuǎn)志酸的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取生遠(yuǎn)志（Y068-201204、Y068-201206、Y068-201210）按“2.1”項(xiàng)下炆遠(yuǎn)志炮制工藝進(jìn)行炮制，分別于炆制過程中的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣。精密稱取各遠(yuǎn)志樣品粉末約0.5 g，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾即可。

2.3.4 測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.4 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

稱取生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及炆遠(yuǎn)志，精密加入70%甲醇提取2次，減壓濃縮回收溶劑后，真空干燥制得干膏。分別精確稱定生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及炆遠(yuǎn)志干膏加入適量DMSO溶解，制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL（按飲片計(jì)）母液。遠(yuǎn)志皂苷B用DMSO溶解，制成10 mg/mL的母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)再以含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液（以下簡(jiǎn)稱為完全培養(yǎng)基）進(jìn)行等比例稀釋，得各所需濃度稀釋液，用于小鼠小腸上皮隱窩IEC-6細(xì)胞毒性試驗(yàn)。

2.4.1 CCK-8測(cè)定細(xì)胞抑制率 將小鼠小腸上皮隱60℃烘箱鼓風(fēng)干燥，即可。

制遠(yuǎn)志：參照2020年版《中國(guó)藥典》項(xiàng)下方法炮制。取甘草，加適量水煎湯，去渣，加入凈遠(yuǎn)志，用文火煮至湯吸盡，取出，干燥，即得制遠(yuǎn)志[3]。

炆遠(yuǎn)志：取凈遠(yuǎn)志和甘草，一同放入炆藥罐內(nèi)，加入溫水（45～50℃）適量，上蓋，將罐移至圍灶內(nèi)，堆放干糠于四周，點(diǎn)火加熱，炆制16 h，至罐內(nèi)汁水吸盡，取出，篩去甘草，65℃干燥至半干后，取出拌入藥汁，待藥汁吸盡后繼續(xù)干燥，即得炆遠(yuǎn)志[13]。該炮制方法由江西建昌幫藥業(yè)提供。窩細(xì)胞IEC-6在含10%FBS的高糖DMEM中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。試驗(yàn)分為對(duì)照組（含有細(xì)胞的未給藥組）、空白組（不含細(xì)胞的未給藥組）、不同炮制工藝的遠(yuǎn)志樣品組和遠(yuǎn)志皂苷B組。參照文獻(xiàn)[12-15]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IEC-6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 5×105個(gè)/mL，每孔 100 μL接種于96孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天取出，棄去上清液，分別于細(xì)胞中加入以上稀釋至不同濃度的生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B單體藥液，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔；同時(shí)設(shè)置未加藥液的對(duì)照組。將處理好的細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培育24 h。取出，分別加入CCK-8試劑200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后停止，在450 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算細(xì)胞抑制率及IC50值。

2.4.2 細(xì)胞中MDA、SOD、GSH的測(cè)定 根據(jù)細(xì)胞抑制試驗(yàn)結(jié)果，分別設(shè)置生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B單體的高、中、低3個(gè)濃度組及對(duì)照組（含有細(xì)胞的未給藥組）、空白組（不含細(xì)胞的未給藥組）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IEC-6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.2×106個(gè)/mL，每孔2 mL接種于6孔板中，置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天取出，棄去上清液，加入預(yù)配置的樣品溶液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔，將處理好的細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培育24 h。將培養(yǎng)好的細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行樣品前處理及MDA、GSH、SOD的測(cè)定[5-7]。

3 結(jié)果及討論

3.1 遠(yuǎn)志炆制過程及遠(yuǎn)志不同炮制品的含量測(cè)定

遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志酸的含量測(cè)定方法學(xué)考察結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志皂苷B及遠(yuǎn)志酸的線性回歸方程分別為y=2 793.80x+22 348.71、y=4 662.78x+2 830.06，線性范圍分別為 15.47～494.90 μg/mL、6.31～201.88 μg/mL，相關(guān)系數(shù)分別為0.997 6、0.999 6。精密度試驗(yàn)RSD值分別為0.13%、2.99%（n=6），穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD 值分別為 1.32%、0.83%（n=6），重現(xiàn)性試驗(yàn)RSD值分別為0.81%、1.18%，平均加樣回收率分別為98.97%和98.55%、RSD值分別為0.93%和1.21%。以上結(jié)果表明遠(yuǎn)志皂苷B、遠(yuǎn)志酸含量測(cè)定方法可行，符合要求。

對(duì)3批次炆遠(yuǎn)志炮制過程中的5個(gè)成分的變化進(jìn)行檢測(cè)，并與制遠(yuǎn)志進(jìn)行比較。結(jié)果見表1、圖2-4。

圖2 生品及不同炮制品中遠(yuǎn)志酮Ⅲ及3，6-二芥子酰基蔗糖酯含量測(cè)定HPLC圖譜Figure 2 Chromatogram of determination of polyxanthoneⅢand 3，6-dicarinoacyl sucrose ester in crude P.tenuifolia and different processed product by HPLC

圖3 生品及不同炮制品中遠(yuǎn)志皂苷B及遠(yuǎn)志酸含量測(cè)定HPLC圖譜Figure 3 Chromatogram of determination of polygenin B and polygenic acid in crude P.tenuifolia and different processed product by HPLC

圖4 生品及不同炮制品中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量測(cè)定HPLC圖譜Figure 4 Chromatogram determination of polygala saponin in crude P.tenuifolia and different processed product by HPLC

表1 5種化學(xué)成分的含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Content determination of five chemical compositions（n=3） w/%

3.2 細(xì)胞抑制率試驗(yàn)

通過體外培養(yǎng)小鼠小腸上皮隱窩細(xì)胞IEC-6，以抑制率和IC50為指標(biāo)，考察生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B單體在不同濃度下的細(xì)胞毒作用，見表2。結(jié)果表明，各組藥物都顯示出了明顯的細(xì)胞毒作用，且呈明顯劑量依賴關(guān)系；但在同一濃度下，制遠(yuǎn)志的細(xì)胞抑制率小于生遠(yuǎn)志，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），炆遠(yuǎn)志的細(xì)胞抑制率明顯低于生遠(yuǎn)志和制遠(yuǎn)志，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；同時(shí)，生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B單體的IC50值依次為0.423、0.699、1.386、0.039 mg/mL。綜合抑制率和IC50值可以看出，3種遠(yuǎn)志對(duì)細(xì)胞的毒性順序?yàn)樯h(yuǎn)志＞制遠(yuǎn)志＞炆遠(yuǎn)志。

表2 生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B的細(xì)胞抑制率Table 2 Inhibition rate of crude P.tenuifolia,stewed P.tenuifolia,processed P.tenuifolia and polygala saponin B on cells(±s,n=6)

表2 生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B的細(xì)胞抑制率Table 2 Inhibition rate of crude P.tenuifolia,stewed P.tenuifolia,processed P.tenuifolia and polygala saponin B on cells(±s,n=6)

與生遠(yuǎn)志各濃度組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與制遠(yuǎn)志各濃度組比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別生遠(yuǎn)志ρ/（mg·mL-1）2 1 IC50/（mg·mL-1）0.423 95%的可信區(qū)間0.357～0.501 0.5 0.25 0.125 0.062 5制遠(yuǎn)志2 1 0.6990.610～0.803 0.5 0.25 0.125 0.062 5炆遠(yuǎn)志2 1 1.3861.317～1.431遠(yuǎn)志皂苷B 0.5 0.25 0.125 0.062 5 0.632 0.326 0.161 0.083 0.044 0.022細(xì)胞抑制率/%99.577±1.860 79.983±1.450 66.071±0.983 51.864±0.731 35.995±0.820 18.295±0.601 99.851±1.415 83.700±1.050*68.330±0.713*49.641±0.571*34.478±0.840*24.070±0.451**80.195±1.755**▲▲65.337±0.880**▲▲54.230±0.753*▲▲44.559±0.881**▲▲34.532±0.460 22.152±0.803**▲97.521±1.420 87.070±1.150**▲70.517±1.283**65.641±0.811**▲▲51.842±1.680**▲▲41.251±0.851**▲▲0.0390.031～0.049

采用在遠(yuǎn)志原型皂苷中含量相對(duì)較高的遠(yuǎn)志皂苷B進(jìn)行比較。生遠(yuǎn)志中含有與遠(yuǎn)志皂苷B為代表的原型遠(yuǎn)志皂苷含量較高，IC50值最小，毒性最大。而炆遠(yuǎn)志中含有的遠(yuǎn)志皂苷B含量最少，IC50值最大，毒性較小。

3.3 MDA、GSH、SOD指標(biāo)的測(cè)定

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）的含量高低可間接反應(yīng)機(jī)體組織細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度，即MDA的值越大，SOD及GSH的值越小，毒性越大[9-11]。因此選擇MDA、SOD、GSH進(jìn)行測(cè)定，來進(jìn)一步探討炆制“減毒”的原因。

從表3可見：與對(duì)照組比較，生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志的各組細(xì)胞GSH和SOD的含量明顯降低（P＜0.01），MDA含量明顯增加（P＜0.01）；與生遠(yuǎn)志組比較，制遠(yuǎn)志和炆遠(yuǎn)志各組的GSH及SOD的含量均顯著增加（P＜0.01），MDA 的含量顯著降低（P＜0.01），說明生遠(yuǎn)志經(jīng)過炮制后的制遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志毒性顯著降低；與制遠(yuǎn)志進(jìn)行比較，炆遠(yuǎn)志各檔次濃度組的GSH及SOD的含量均顯著增加（P＜0.01），MDA的含量顯著降低（P＜0.01），說明炆遠(yuǎn)志毒性與制遠(yuǎn)志比較顯著降低；遠(yuǎn)志皂苷B單體對(duì)MDA、SOD、GSH的含量變化與生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志和制遠(yuǎn)志的變化相反，證明其具有較強(qiáng)的胃腸道毒性。

表3 生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B對(duì)GSH、SOD、MDA的影響Table 3 Effects of crude P.tenuifolia，stewed P.tenuifolia，processed P.tenuifolia and polygala saponin B on GSH，SOD and MDA(±s,n=6)

表3 生遠(yuǎn)志、炆遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志及遠(yuǎn)志皂苷B對(duì)GSH、SOD、MDA的影響Table 3 Effects of crude P.tenuifolia，stewed P.tenuifolia，processed P.tenuifolia and polygala saponin B on GSH，SOD and MDA(±s,n=6)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與生遠(yuǎn)志各濃度組比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與制遠(yuǎn)志各濃度組比較：■P＜0.05，■■P＜0.01。

組別對(duì)照生遠(yuǎn)志ρ/（mg·mL-1）0 2 1 0.5制遠(yuǎn)志2 1 0.5炆遠(yuǎn)志2 1遠(yuǎn)志皂苷B 0.5 0.161 0.083 0.044 GSH/（μmol·g-1）96.346±9.531 36.121±0.20**46.527±0.528**56.399±0.347**46.321±0.293**▲▲56.572±0.43**▲▲66.504±0.492**▲▲60.255±0.243**▲▲■■72.173±0.63**▲▲■■84.273±0.382**▲▲■■10.209±0.603**▲▲■■14.294±0.45**▲▲■■16.371±0.523▲▲■■SOD/（μmol·g-1）831.071±12.434 380.486±5.025**442.168±8.513**500.310±7.941**400.341±10.530**▲▲460.636±11.904**▲520.165±12.070**▲560.378±10.460**▲▲■■634.384±8.364**▲▲■■696.834±9.240**▲▲■■105.400±9.342**▲▲■■122.592±1.412**▲▲■■157.291±2.457**▲▲■■MDA/（μmol·g-1）10.334±0.870 70.783±9.202**60.354±8.289**50.275±0.350**60.167±5.135**50.257±1.752**40.376±1.457**▲▲44.791±5.685**▲■34.474±1.142**▲▲■■24.426±1.787**▲▲■■34.417 ±6.134**▲▲■■30.271±1.127**▲▲■■25.435±1.346**▲▲■■

4 小結(jié)

遠(yuǎn)志中原型皂苷類成分（如遠(yuǎn)志皂苷B）既是遠(yuǎn)志祛痰鎮(zhèn)咳、抗癡呆和腦保護(hù)的活性成分，也是對(duì)胃腸道刺激的毒性成分[1-4，17-19]。此類成分因炮制受熱，糖苷鍵斷裂，水解為毒性較低的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷等成分，導(dǎo)致含量降低，從而降低胃腸道毒性。本文通過比較原型皂苷類中含量較高遠(yuǎn)志皂苷B的含量大小，結(jié)果顯示生遠(yuǎn)志＞制遠(yuǎn)志飲片＞炆遠(yuǎn)志飲片。推測(cè)原因是由于炆法炮制需加熱炮制16 h，時(shí)間長(zhǎng)，而制遠(yuǎn)志炮制時(shí)間是幾小時(shí)，時(shí)間較短，導(dǎo)致炆遠(yuǎn)志中遠(yuǎn)志皂苷B含量更低。另外，從IEC-6細(xì)胞胃腸道毒性試驗(yàn)結(jié)果可見，IC50和MDA、GSH、SOD的含量變化，均表明毒性大小為生遠(yuǎn)志＞制遠(yuǎn)志＞炆遠(yuǎn)志。推測(cè)遠(yuǎn)志皂苷B含量的降低為遠(yuǎn)志胃腸毒性減小的原因之一，該結(jié)果可為炆遠(yuǎn)志的炮制提供參考，為炆遠(yuǎn)志的“減毒”效應(yīng)提供一定的科學(xué)依據(jù)。