響應面法優化紫丁香葉總黃酮超聲提取工藝

李菁，杜少兵 ，楊蕾 ，周慧慧 ，孟祎 ，薛志鵬，王小平 ，2，白吉慶 ，2

（1.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥原料質量監測技術服務中心，陜西 咸陽 712046）

紫丁香SyringaoblateLindl.是木犀科丁香屬多年生灌木或小喬木[1]，具有清熱解毒、利濕退黃的功效[2]，用于治療急性瀉痢、黃疸型肝炎、火眼、瘡瘍等[3-4]。現代研究表明，紫丁香葉中含有黃酮類、苯丙素類、三萜類、環烯醚萜類等多種化學成分[3-8]，其中黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗微生物、抗炎鎮痛、保肝降血脂等多種藥理活性[9-11]。響應面法是一種綜合試驗設計和數學建模的優化方法，可全面考察各因素之間的交互作用，改善正交試驗設計中精度與預測性較差等不足[12]。由于黃酮類成分具有多種生物活性，廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等行業[13]，開發應用前景較廣，而關于紫丁香葉總黃酮的研究報道較少，因此，本研究采用響應面法優化紫丁香葉總黃酮的超聲提取工藝，擬為紫丁香葉總黃酮的高效提取及后續的開發利用奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-6100 DOUBLE BEAM紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；KQ-300VDE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子分析天平（瑞士MettlerToledo公司，精度：0.01 mg，量程：81 g/220 g～0.01 g/0.1 mg）；DHG-9075A干燥箱（上海恒科有限公司）；LG-01高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 試劑與藥物

紫丁香葉采自陜西省富縣，經陜西中醫藥大學白吉慶教授鑒定為木犀科丁香屬紫丁香Syringa oblataLindl.的干燥葉（標本存放于陜西中醫藥大學中藥資源普查樣本儲藏室，標本號：20200412LY）；蘆丁對照品（純度≥92.5%，批號10080-200707，中國藥品生物制品檢定所）；無水乙醇、Al（NO3）3、NaOH、NaNO2（天津市天力化學試劑有限公司）均為分析純。

2 方法與結果

2.1 總黃酮質量分數測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 取蘆丁4.60 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加適量95%（體積分數，下同）的乙醇溶解后定容，即得0.18 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱定一定量的紫丁香葉粉末（過二號篩），按照料液比（g∶mL）1∶20加入55%（體積分數，下同）乙醇，按照超聲波功率為90W、頻率為45 kHz超聲50 min，提取2次，合并2次續濾液并定容，即得。

2.1.3 檢測波長的選擇 精密吸取供試品溶液、對照品溶液各1 mL，置于25 mL量瓶中，加入5%NaNO2溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加入10%Al（NO3）31 mL，混勻，放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，用相應溶劑定容，混勻，放置15 min。以相應試劑作為空白，在波長為400～800 nm范圍進行測定，結果顯示上述2種溶液在505 nm處均有最大吸收，故選擇檢測波長為505 nm。

2.1.4 標準曲線的制備 分別精密吸取上述對照品溶液 0、1、2、3、4、5 mL，置于 25 mL 量瓶中，按“2.1.3”項方法進行顯色，在505 nm處測定吸光度。將蘆丁質量濃度（mg/mL）設為橫坐標、吸光度設為縱坐標，線性回歸，得回歸方程y=10.784x+0.008（r=0.999 5），表明在0.000～0.092 mg/mL質量濃度范圍內呈現良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，按“2.1.3”項方法進行顯色，在505 nm處測定，連續測定6次，結果測得吸光度的RSD值為0.01%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 精密稱定樣品粉末，按“2.1.2”項方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.3”項方法進行顯色，在505 nm處測定吸光度計算總黃酮質量分數，結果顯示總黃酮質量分數為（107.43±1.31）mg/g，RSD值為0.75%，表明方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1.3”項方法進行顯色，分別于0、1、2、4、6、8、12 h在505 nm處測定吸光度，結果顯示吸光度的RSD值為2.14%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取總黃酮質量分數已知的樣品1 g，精密稱定6份，分別加入對照品0.05 g，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項方法進行顯色，在505 nm測定吸光度，計算加樣回收率，結果顯示平均加樣回收率為（98.07±1.46）%，其RSD為1.49%，見表1，表明方法的加樣回收率符合要求。

表1 總黃酮加樣回收率試驗結果Table 1 The recovery results of total flavonoids

2.2 單因素試驗

根據文獻報道和預實驗結果，分別考察料液比、提取時間、乙醇體積分數、超聲溫度、提取次數對紫丁香葉總黃酮質量分數的影響。

2.2.1 料液比 取樣品粉末1 g，精密稱定，按照料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，分別加入體積分數為55%的乙醇溶液，溫度設定50℃，超聲處理50 min，超聲波功率為90 W、頻率為45 kHz，提取1次，測定吸光度計算總黃酮質量分數，結果見圖1。可見，料液比（g∶mL）為1∶20時，總黃酮質量分數最多；料液比大于1∶40時，總黃酮質量分數無顯著性差異，為節約溶劑，故選定料液比（g∶mL）為1∶20。

圖1 不同料液比對總黃酮質量分數的影響Figure 1 Effect of different material liquid ratio on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.2 乙醇體積分數 取樣品粉末1 g，精密稱定，按照料液比為1∶20，分別加入25%、35%、45%、55%、65%、75%的乙醇，50℃、超聲波功率為90W、頻率為45 kHz超聲提取50 min，提取1次，測定吸光度計算總黃酮質量分數，結果見圖2。可見，乙醇體積分數為55%時總黃酮質量分數最多，故選定乙醇體積分數為55%。

圖2 不同乙醇體積分數對總黃酮質量分數的影響Figure 2 Effect of different ethanol volume fraction on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.3 提取時間 取樣品粉末1 g，精密稱定，加入體積分數為55%的乙醇20 mL，50℃分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min，測定吸光度計算總黃酮質量分數，結果見圖3。可見，提取時間50 min時總黃酮質量分數最多，故選定提取時間為50 min。

圖3 不同超聲時間對總黃酮質量分數的影響Figure 3 Effect of different extraction time on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.4 超聲溫度 取樣品粉末1 g，精密稱定，加入體積分數為55%的乙醇溶液20 mL，分別于溫度20、30、40、50、60 ℃進行超聲提取50 min，測定吸光度計算總黃酮質量分數，結果見圖4。可見，超聲溫度為50℃時總黃酮質量分數最多，故選定超聲溫度為50℃。

圖4 不同超聲溫度對總黃酮質量分數的影響Figure 4 Effect of different ultrasonic temperature on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.5 提取次數 取樣品粉末1 g，精密稱定，加入體積分數為55%的乙醇溶液20 mL，50℃分別超聲提取1、2、3次，50 min/次，測定吸光度計算總黃酮質量分數，結果見圖5。可見，提取次數為2次時總黃酮質量分數最多，故選定提取次數為2次。

圖5 不同提取次數對總黃酮質量分數的影響Figure 5 Effect of different extraction times on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.3 響應面法優化提取工藝

2.3.1 響應面法實驗設計 通過單因素試驗，初步確定料液比（g∶mL）為1∶20，乙醇體積分數為55%，提取時間50 min，超聲溫度50℃，提取2次較為合適，在單因素試驗篩選的基礎上結合耗能等因素，以料液比（A）、乙醇體積分數（B）、提取時間（C）為影響因素，總黃酮質量分數為評價指標，采用Design-Expert 11軟件，根據Box-Behnken設計原理，進行3因素3水平17個實驗點Box-Behnken設計-響應面分析實驗。因素水平見表2，試驗結果見表3。

表2 響應面因素水平表Table 2 Coding table of response surface factor level

表3 響應面試驗設計與試驗結果Table 3 Design and results of response surface test

2.3.2 數學模型的建立及分析 使用Design Expert軟件進行擬合，得到的回歸方程如下：Y=107.15+3.62A-2.81B-2.14C-2.31AB+0.7075AC-0.3625BC-20.30A2-8.92B2-8.15C2，R2=0.9891，與 1 接近，說明通過二次回歸得到的綜合評分模型與試驗擬合較好。方差分析結果見表4。

表4 回歸模型方差分析結果Table 4 The results of variance analysis of regression model

由表4可知，模型極顯著（F=70.82，P＜0.0001），失擬項不顯著（P=0.1381＞0.05），說明此模型有統計學意義。各因素對紫丁香葉總黃酮質量分數的影響由大到小的順序為A＞B＞C，即料液比＞乙醇體積分數＞提取時間，其中二次項A2、B2、C2的影響極顯著（P＜0.01），可利用此模型來分析和預測紫丁香葉中的總黃酮質量分數。

2.3.3 響應面交互作用分析 用Design Expert 11軟件繪制的各因素交互作用的曲面圖與等高線圖，可直觀地反映各因素間的交互作用對響應值的影響程度，響應面圖的坡度越陡表示兩個因素之間交互作用越大，等高線圖為橢圓時表示兩因素交互作用顯著[14-17]。由圖6可知，料液比與乙醇體積分數之間的曲線最陡峭、提取時間次之，乙醇體積分數與提取時間的等高線圖最圓，說明料液比與乙醇體積分數之間的交互作用對響應值（總黃酮質量分數）的影響最顯著，乙醇體積分數與提取時間之間的交互作用對響應值（總黃酮質量分數）的影響最不顯著，與表4中 AB（F=4.89，P=0.062 7）＞AC（F=0.457 4，P=0.520 6）＞BC（F=0.120 1，P=0.739 1）相對應。

圖6 各因素交互作用的曲面圖與等高線圖Figure 6 Surface and contour plots of the interaction of various factors

2.3.4 驗證試驗 通過Design Expert 11軟件計算得出最優提取工藝為：料液比（g∶mL）1∶20.964、乙醇體積分數53.322%、提取時間48.769 min，預測總黃酮質量分數為107.692 mg/g。考慮到實際實驗的可操作性，將優化條件修正為料液比（g∶mL）1∶20、乙醇體積分數55%、提取時間50 min，紫丁香葉總黃酮質量分數為（106.50±1.21）mg/g（n=3），與預測值107.69 mg/g接近，表明方法穩定可行。

3 討論

植物中總黃酮的提取方法有回流提取法、熱浸提法、超聲提取法、微波萃取提取法等[18-19]，超聲波提取可利用超聲波的空化作用增加溶劑穿透能力，有效破壞組織的細胞壁，促進總黃酮釋放到溶劑中從而提高提取率，提取率相對較高且節能環保[20-21]。常用的優化提取工藝的方法有響應面法、正交試驗法、均勻設計法等，均勻設計用于水平數較多且各因素水平數不等的情況[14]，響應面法是一種綜合試驗設計和數學建模的優化方法，可全面考察各因素之間的交互作用，改善正交試驗設計中精度與預測性較差等不足[12]。因此本研究采用響應面法優化紫丁香葉總黃酮超聲提取工藝。

單因素試驗中，分別考察了料液比、乙醇體積分數、提取時間、超聲溫度、提取次數5個因素對于總黃酮質量分數的影響，由于超聲過程中儀器自身發熱會對超聲溫度產生一定的影響，因此選擇以料液比、乙醇體積分數、提取時間為影響因素，總黃酮質量分數為評價指標，進一步優化紫丁香葉總黃酮提取工藝，得到最佳工藝為：料液比為1∶20（g∶mL）、乙醇體積分數55%、提取時間50 min，驗證實驗與預測值相接近，說明響應面法優化超聲提取工藝的結果準確可靠，為紫丁香葉總黃酮的資源開發利用提供實驗依據。