不同產地佩蘭UPLC指紋圖譜研究

李素梅，羅思妮，畢曉黎，胥愛麗，李養學，肖觀林，陳偉韜

[1.廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院）/廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州 510095；2.佛山市中醫院，廣東 佛山 528000]

佩蘭來源于菊科植物佩蘭EupatoriumfortuneiTurcz.的干燥地上部分，具有芳香化濕、醒脾開胃、發表解暑的功效，用于治療濕濁中阻、口中甜膩、口臭、暑濕表證、濕溫初起等[1]，為常用化濕、醒脾、解表中藥，用藥歷史悠久，在我國華南、西南、中南、華東、陜西、河北、山東及湖北等地均有分布[2]。佩蘭主要含揮發油類[3-4]、黃酮類[5-7]、生物堿類[8-9]、腦苷脂類、蒲公英甾醇、蒲公英甾醇乙酸酯等成分[10]。藥理研究表明，佩蘭具有抗炎[11]、祛痰[12]、抗腫瘤[13]、抑菌[14-16]、增強免疫力[17-18]等作用。

目前，關于佩蘭質量控制方面的研究報道較少，且主要集中在揮發油[19-21]分析和化學成分提取分析研究等方面[10]，均未涉及到佩蘭藥材的超高效液相色譜指紋圖譜研究。2020年版《中國藥典》收載的佩蘭質量控制項目主要是定性鑒別和總揮發油含量，缺少具體的指標性成分要求。為了更全面地評價、控制佩蘭的質量，本研究收集了6個不同產地的佩蘭，采用UPLC技術建立了佩蘭指紋圖譜，旨在為佩蘭的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TLE-204分析天平、XS205DU型分析天平（瑞士-梅特勒托利多儀器公司）；JJ500電子天平（常熟-雙杰測試儀器廠）；KQ700DE超聲清洗器（昆山超聲儀器公司）；安捷倫1290超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試藥

香豆素對照品（批號：X-013-150801，純度：98%），購自成都瑞芬思生物科技有限公司；24批佩蘭藥材經廣東省中醫藥工程技術研究院劉法錦教授鑒定為菊科植物佩蘭EupatoriumfortuneiTurcz的干燥地上部分，產地信息見表1；液相用甲醇為Merck色譜純試劑，液相用水為屈臣氏水，甲醇、磷酸等其他試劑為分析純。

表1 佩蘭樣品信息Table 1 Information of the E.fortunei

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以 Waters Cortecs UPLC T3（2.1 mm×150 mm，1.6μm）為色譜柱，以甲醇為流動相A，0.1%磷酸水溶液為流動相 B，梯度洗脫（0～40 min，5%～100%A）；流速為0.25 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為35℃；進樣量為2μL。

2.2 供試品溶液的制備

取佩蘭粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定質量，置錐形瓶中，精密加入70%（體積分數，下同）甲醇溶液10 mL，超聲處理（功率700 W，頻率45 kHz）提取20 min，取出，放冷，用70%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，提取液通過0.22μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.3 對照品溶液的配制

精密稱取香豆素對照品5.36 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為0.210 1 mg/mL的對照品溶液，從中精密吸取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為21.01μg/mL的對照品溶液，備用。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 精密吸取70%甲醇溶液2μL進樣，按“2.1”項下的色譜條件測定，結果見圖1，專屬性試驗結果表明，該分析方法能正確檢測所指認的共有峰，不受提取溶劑的干擾。

圖1 專屬性試驗UPLC圖Figure 1 The UPLC of specific test

2.4.2 精密度試驗 取S1供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣6針，以5號峰（香豆素）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，其中各共有峰相對保留時間的RSD在0.06%～0.12%之間，相對峰面積RSD在1.22%～2.33%之間，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取佩蘭S1樣品，按“2.2”項方法平行處理6份供試品溶液，再按“2.1”項色譜條件進樣分析，以5號峰（香豆素）為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積RSD在1.42%～4.75%之間，表明方法重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 取佩蘭S1供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別在0、2、4、7、9、11、13、15、17 h分別進樣分析，以5號峰（香豆素）為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積RSD在0.71%～1.92%之間，表明佩蘭供試品溶液在17 h內穩定性良好。

2.5 佩蘭對照指紋圖譜的建立及相似度評價

取24批佩蘭樣品，按“2.2”項方法分別制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件，測定24批樣品指紋圖譜。將24批佩蘭指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》（2012年版）進行評價，以S1為參照圖譜，對照圖譜生成方法為中位數法，時間窗設置為0.1，經過多點校正和峰匹配，得到24批樣品的共有峰模式及佩蘭對照指紋圖譜，結果見圖2、圖3。其中標定了13個共有峰，通過與對照品比對，指認5號峰為香豆素。以5號峰（香豆素）為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2、表3。結果顯示，13個共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.1%，而相對峰面積RSD值在36.55%～87.37%之間，表明不同產地佩蘭的化學成分含量存在較大的差異。以生成的對照指紋圖譜作為對照，計算各批次樣品的相似度，結果見表4。可見，除S8外，24批樣品相似度均大于0.90，表明不同產地的佩蘭化學成分一致性較好。

表2 24批佩蘭的共有峰相對保留時間Table 2 Relative peak time of common peaks of 24 batches of the E.fortunei

表3 24批佩蘭的共有峰相對峰面積Table 3 Relative peak area of common peaks of 24 batches of the E.fortunei

表4 相似度評價結果Table 4 Results of similarity analysis

圖2 佩蘭對照指紋圖譜Figure 2 Rreference fingerprint of E.fortunei

圖3 24批佩蘭指紋圖譜共有峰模式Figure 3 The common peak pattern of the HPLC fingerprints of 24 batches of the E.fortunei

2.6 化學計量學分析

將24批佩蘭指紋圖譜中的13個共有峰峰面積導入IBM SPSS Statistics 21.0軟件進行PCA分析，計算得到主成分特征值、累積貢獻率，結果見表5。可見，PCA共提取3個特征值大于1的主成分，累積方差貢獻率達87.450%，表明提取的前3個主成分可以代表佩蘭指紋圖譜共有峰中大部分的信息。旋轉后的成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小[22]，結果見表6。結果顯示，第1主成分主要反映了峰8、12、9、10、3、2、13、7、4對第1主成分的貢獻；峰5、1對第2主成分的貢獻較大；第3主成分主要反映了峰11、6的信息。將共有峰峰面積導入SIMCA 14.0軟件進行PCA分析，得到主成分得分散點圖見圖4。可見，大部分樣品較為集中，表明不同產地佩蘭的差異性較小，提示地理環境等因素對佩蘭藥材質量的影響并不顯著。

圖4 主成分得分散點圖Figure 4 PCA score plot

表5 特征值及方差貢獻率Table 5 Characteristic value and variance contribution rate

表6 旋轉后成分載荷矩陣Table 6 Factors loading matrix after rotating

3 討論

本研究考察了不同的提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、乙醇）、不同提取時間（5、10、20 min）和不同的提取方式（超聲、回流）對佩蘭指紋圖譜的影響，結果發現以70%甲醇提取的指紋圖譜信息最為豐富，且不同提取時間和提取方式的差異不明顯，因此，選擇以70%甲醇超聲10 min作為供試品溶液的制備方法。通過考察不同的流動相體系，結果顯示以甲醇-0.1%磷酸水溶液分離效果最佳，因此，選擇以甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相。采用DAD檢測器進行全波長掃描（190～400 nm），結果顯示以220 nm為檢測波長的指紋圖譜色譜峰較多、基線穩定，因此，選擇以220 nm作為檢測波長。

本研究建立了不同產地佩蘭藥材的指紋圖譜，標定了13個共有峰，并指認了其中的5號峰為香豆素。23批樣品的相似度均大于0.90，其中1批樣品相似度低于0.9，可能與生長年限、貯藏環境等因素有關，需進一步進行分析。相似度結果表明不同產地佩蘭的化學成分種類一致性較高。PCA共提取了3個主成分。主成分得分散點圖結果表明不同產地及來源的佩蘭樣品相似度較高，產地差異不易區分，與相似度評價結果一致。這可能是由于佩蘭藥材品質受產地環境影響不大，也為佩蘭道地性不明顯提供了佐證，提示佩蘭藥材的質量優劣可能與采收時間、加工方式等更為密切，因此下一步可以對不同采收時間、加工方式的佩蘭藥材進行指紋圖譜研究。

本研究建立了佩蘭藥材的指紋圖譜，但僅指認了其中的1個色譜峰，后續將結合液質聯用技術對未知峰進行指認。另外，由于本研究采集的樣本量較少，后續仍需進一步收集更多產地的多批次樣品進行研究。

中藥是通過多成分、多靶點、多通路發揮療效的，僅僅對一類成分進行分析不能全面的評價其質量優劣。中藥指紋圖譜具有專屬性高、穩定性好、整體性強的特點，能更全面的反映中藥材整體的化學成分信息。本研究所建立的佩蘭藥材指紋圖譜，為佩蘭藥材指標成分定量分析、完善佩蘭藥材的質量標準提供了科學的依據，同時，對含有佩蘭的中成藥質量標準研究也具有重要的參考價值。