現(xiàn)代生物技術(shù)在植物源化妝品原料開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

趙平，王艷，趙力民

（廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

化妝品安全評(píng)估是化妝品消費(fèi)安全的重要保障，化妝品功效評(píng)價(jià)是對(duì)化妝品功效宣稱(chēng)進(jìn)行科學(xué)支持的有效手段。其中，化妝品原料是化妝品整個(gè)生命周期的源頭，承載著化妝品的主體，其安全和功效情況直接影響化妝品成品的安全與有效性[1]。我國(guó)是世界上植物資源最豐富的地區(qū)之一，擁有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的藥用植物資源有待作為化妝品新原料開(kāi)發(fā)。然而，“神農(nóng)嘗百草，一日而遇七十毒”，植物化學(xué)和毒理學(xué)研究表明，許多植物成分有明確的致癌性、致敏性、致畸性、光毒性以及由于外界環(huán)境污染等造成的外源性不安全因素等[2]。因此，中國(guó)特色植物化妝品原料的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，并非坦途。而傳統(tǒng)“十年磨一劍”的藥物研發(fā)模式，無(wú)法滿(mǎn)足快速發(fā)展的化妝品行業(yè)對(duì)原料開(kāi)發(fā)的需求速度，因此引入化學(xué)、信息科學(xué)、生命科學(xué)等學(xué)科中成熟便捷、廣泛使用的技術(shù)手段來(lái)進(jìn)行化妝品植物原料的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

目前，世界各國(guó)紛紛開(kāi)展針對(duì)植物化妝品原料開(kāi)發(fā)的技術(shù)手段研究，根據(jù)原料開(kāi)發(fā)“自上而下”或“自下而上”地有序選擇化學(xué)/信息/生物等一系列現(xiàn)代化技術(shù)形成“組合策略”，以最終實(shí)現(xiàn)通過(guò)單一方法或幾種技術(shù)組合的策略來(lái)評(píng)價(jià)化妝品原料的安全和功效性。歐洲化妝品協(xié)會(huì)（Cosmetics Europe）發(fā)布化妝品功效評(píng)價(jià)指南等相關(guān)評(píng)價(jià)方法，歐洲化妝品及其他外用產(chǎn)品功效評(píng)價(jià)專(zhuān)家組（EEMCO）通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬篩選優(yōu)化等技術(shù)對(duì)植物化妝品的毒理安全性、刺激性及彈性、抗氧化性等功效進(jìn)行了研究。韓國(guó)食品醫(yī)藥品安全評(píng)價(jià)院發(fā)布了部分植物化妝品的功效證實(shí)試驗(yàn)方法，細(xì)胞生物學(xué)和斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)等現(xiàn)代生物技術(shù)被采用。在日本化妝品工業(yè)聯(lián)合協(xié)會(huì)（JCIA）發(fā)布的化妝品抗老化、美白和防曬功效評(píng)價(jià)指南中，也將細(xì)胞生物學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)方法應(yīng)用其中。目前，這些方法在我國(guó)的應(yīng)用尚未普及，我國(guó)植物源化妝品的開(kāi)發(fā)技術(shù)革新還有很大的提升空間。

本文針對(duì)我國(guó)目前植物源化妝品原料開(kāi)發(fā)方法現(xiàn)狀，介紹了計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、細(xì)胞生物學(xué)和斑馬魚(yú)模型等現(xiàn)代生物技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用，期望對(duì)新原料的開(kāi)發(fā)起到積極的參考作用。

1 植物源化妝品原料開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的現(xiàn)狀分析

1.1 我國(guó)植物源潛在化妝品原料資源豐富，安全與功效篩選評(píng)估壓力巨大

在我國(guó)新頒布的2021版《已使用化妝品原料目錄》中，有3 115種屬于植物源功效原料。然而，截至目前，我國(guó)境內(nèi)已知36 512種高等植物物種，其中11 118種有藥用記載。因此，化妝品植物原料目錄還有很大的擴(kuò)充空間[3]。同時(shí)，龐大的潛在化妝品用植物原料的存在，對(duì)原料的篩選開(kāi)發(fā)效率和安全功效評(píng)價(jià)技術(shù)提出了更高要求。植物原料的提取獲得方式多樣，成分錯(cuò)綜復(fù)雜，天然提取物的固有味道、顏色、穩(wěn)定性、成本等諸多因素，限制了其開(kāi)發(fā)速率[4]。然而，目前年輕的化妝品消費(fèi)人群對(duì)化妝品的要求理性而全面，對(duì)安全和功效性都有著較高標(biāo)準(zhǔn)。植物源化妝品原料的開(kāi)發(fā)人員需要小心把握安全和功效這柄雙刃劍，為消費(fèi)者帶來(lái)可以被實(shí)際感受到的效果[5-6]。因此，植物源化妝品原料在化妝品行業(yè)的進(jìn)入，需要大量的安全和功效評(píng)估數(shù)據(jù)的支撐，基于原料龐大的基數(shù)，進(jìn)行這些測(cè)評(píng)工作的壓力巨大。

1.2 國(guó)家對(duì)化妝品安全和功效評(píng)價(jià)的管理法規(guī)頻出，日趨嚴(yán)格

化妝品是直接作用于人體皮膚，其安全性對(duì)消費(fèi)人群的健康緊密相關(guān)。此外，化妝品作為高度依賴(lài)產(chǎn)品宣稱(chēng)的行業(yè)，其功效宣稱(chēng)與產(chǎn)品銷(xiāo)量密切相關(guān)，直接影響到消費(fèi)者權(quán)益和企業(yè)效益[7]。原料的安全性是化妝品產(chǎn)品安全的前提條件，活性原料的功效性是產(chǎn)品功效性的根本來(lái)源[8]。為保障《化妝品監(jiān)督管理?xiàng)l例》的實(shí)施而制定的《化妝品安全評(píng)估技術(shù)導(dǎo)則》和《化妝品功效宣稱(chēng)評(píng)價(jià)規(guī)范》均規(guī)定，在注冊(cè)備案化妝品新原料和成品前，必須開(kāi)展安全評(píng)估；化妝品的功效宣稱(chēng)應(yīng)當(dāng)有充分的科學(xué)依據(jù)，企業(yè)對(duì)功效宣稱(chēng)負(fù)責(zé)，并應(yīng)當(dāng)將有關(guān)研究數(shù)據(jù)或功效驗(yàn)證材料在指定網(wǎng)站公開(kāi)，接受社會(huì)監(jiān)督[9]。頻繁出臺(tái)的法規(guī)和管理辦法，充分展示了政府對(duì)整頓化妝品功效宣稱(chēng)混亂現(xiàn)象的決心，也對(duì)化妝品企業(yè)提出了嚴(yán)峻的考驗(yàn)。

1.3 化妝品原料的篩選和評(píng)估周期漫長(zhǎng)，成本高昂

化妝品原料的安全功效篩選評(píng)估當(dāng)前大多沿用傳統(tǒng)的藥物研發(fā)模式，各大評(píng)測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)化妝品原料及產(chǎn)品的安全和功效評(píng)估廣泛采用的是動(dòng)物在體和志愿者主觀評(píng)價(jià)配合客觀儀器評(píng)估等方法，這些方法實(shí)施周期漫長(zhǎng)，影響因素眾多，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)制定難度較大，測(cè)試費(fèi)用較高，人力物力成本較大[10]。因此，企業(yè)缺乏新原料研發(fā)的主動(dòng)參與積極性。我國(guó)現(xiàn)有175家化妝品注冊(cè)和備案檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)，其中廣東省僅有37家。由于缺乏高效的篩選和評(píng)估技術(shù)，未建立相應(yīng)的化妝品功效評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)，上述機(jī)構(gòu)所開(kāi)展的基本是化妝品成品的安全與功效性方面的基本檢測(cè)，目前尚未進(jìn)行化妝品新原料開(kāi)發(fā)和評(píng)估方面的探索。暨南大學(xué)等科研院校開(kāi)展了部分的化妝品原料安全功效評(píng)估工作，但也不夠高效和系統(tǒng)化。

2 現(xiàn)代生物技術(shù)在植物源化妝品原料開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

目前，植物源化妝品原料的安全功效篩選評(píng)估大多沿用傳統(tǒng)的“十年磨一劍”的藥物研發(fā)模式，研發(fā)周期較長(zhǎng)、投入成本較高，成功率低，耗時(shí)費(fèi)力，不能滿(mǎn)足快速發(fā)展的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)需求[11]。化學(xué)、藥學(xué)、中藥學(xué)、信息科學(xué)、生命科學(xué)等多學(xué)科手段靈活運(yùn)用，協(xié)同助力，是未來(lái)化妝品新原料安全與功效評(píng)估的主要發(fā)展趨勢(shì)[12]。其中，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、細(xì)胞生物學(xué)體外替代實(shí)驗(yàn)以及斑馬魚(yú)模型等手段的交叉應(yīng)用，將成為化妝品開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià)方法的主導(dǎo)，見(jiàn)圖1。

圖1 植物源化妝品原料開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià)方法示意圖Figure 1 Schematic diagram of the development and evaluation method of plant-derived cosmetic raw materials

2.1 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)高效篩選植物源化妝品原料

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)思路可以實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)性質(zhì)高效快捷的預(yù)測(cè)模擬篩選，目標(biāo)靶點(diǎn)選用病理學(xué)、皮膚生理學(xué)相關(guān)蛋白，進(jìn)行植物源化妝品潛在功效原料的開(kāi)發(fā)工作。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)用于篩選植物源化妝品原料的方法一般分如下幾步：（a)對(duì)《已使用化妝品原料名稱(chēng)目錄》(2021版)中的植物源原料根據(jù)功效進(jìn)行整理，構(gòu)建植物源化妝品原料信息數(shù)據(jù)庫(kù)[12]；（b）廣泛參考國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)、文獻(xiàn)和網(wǎng)站，進(jìn)一步對(duì)植物源化妝品原料中所含功效性化學(xué)成分結(jié)構(gòu)建庫(kù)[13]；（c）分析生理學(xué)作用靶點(diǎn)蛋白[14]；（d）通過(guò)藥物與靶點(diǎn)作用模型，預(yù)測(cè)和篩選化合物的功效性成分，構(gòu)建功效原料化合物庫(kù)[15]；（e）通過(guò)生物化學(xué)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)所預(yù)測(cè)的功效進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步進(jìn)行人體功效評(píng)價(jià)，證實(shí)所需植物源化合物的功效性成分[16]。可用于計(jì)算機(jī)輔助篩選的軟件詳見(jiàn)表1。

表1 計(jì)算機(jī)輔助篩選軟件Table 1 Computer-aided screening software

2.2 細(xì)胞生物學(xué)層面快速評(píng)價(jià)化妝品安全與功效

自2010年歐洲議會(huì)通過(guò)了修訂關(guān)于動(dòng)物替代實(shí)驗(yàn)3R原則以來(lái)，以細(xì)胞生物學(xué)為主的體外替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)受到化妝品研發(fā)人員的廣泛青睞。研究人員從細(xì)胞水平出發(fā)，利用分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、生理學(xué)等方法深入地探究化妝品與細(xì)胞作用機(jī)理。相對(duì)動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)對(duì)象可控性更強(qiáng)，成本更低，速度更快，也更易獲得微觀細(xì)胞生理指標(biāo)數(shù)據(jù)，可以為體外實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)提供良好的補(bǔ)充和完善[17-18]。因此，通過(guò)對(duì)體外動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)建立細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)化妝品原料或成品的安全性和功效性，有望成為化妝品開(kāi)發(fā)與研究領(lǐng)域的重要手段。

目前針對(duì)化妝品功效進(jìn)行的細(xì)胞生物學(xué)評(píng)價(jià)方法主要有MTT，酶聯(lián)免疫等。例如，Xiong等[19]采用MTT法和酶聯(lián)免疫法聯(lián)合對(duì)人參提取物刺激成纖維細(xì)胞增殖、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的透明質(zhì)酸進(jìn)行研究，判斷皮膚的老化情況從而對(duì)化妝品的抗衰功效進(jìn)行研究。在化妝品的美白評(píng)價(jià)方面，Chen等[20]通過(guò)體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞或者按人體皮膚中的比例混合來(lái)培養(yǎng)黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞以模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)和代謝過(guò)程，然后采用MTT比色法與細(xì)胞圖像分析技術(shù)檢測(cè)藥用植物中黃酮、皂苷等活性成分對(duì)黑素生成量或?qū)谒丶?xì)胞增殖抑制作用影響等，來(lái)進(jìn)行美白祛斑評(píng)價(jià)；Fang等[21]通過(guò)測(cè)定黑色素形成過(guò)程中酪氨酸酶、氧化酶和多巴色素互變酶的mDNA和DNA的表達(dá)水平及酪氨酸酶的合成量來(lái)評(píng)價(jià)藥用植物的美白功效。此外，對(duì)化妝品的保濕性能則可以通過(guò)測(cè)試體外培養(yǎng)的皮膚角質(zhì)細(xì)胞中透明質(zhì)酸(HA)、緊密連接蛋白(Claudins)、天然保濕因子(NMF)、水通道蛋白(AQPs)等指標(biāo)的使用前后變化來(lái)評(píng)價(jià)[22]。表2中給出了目前基于細(xì)胞生物學(xué)層面的化妝品常見(jiàn)評(píng)價(jià)方法。

表2 細(xì)胞生物學(xué)方法評(píng)價(jià)化妝品的安全與功效Table 2 Safety and efficacy evaluation of cosmetics using cell biological methods

2.3 斑馬魚(yú)模型成為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的主要替代

斑馬魚(yú)經(jīng)濟(jì)低廉，飼養(yǎng)空間小，單次產(chǎn)卵數(shù)量大，胚胎透明，不需要解剖即可在顯微鏡下進(jìn)行觀察，是一種高通量的模式生物。更為重要的是，斑馬魚(yú)的皮膚也和人類(lèi)皮膚一樣分為表皮、真皮、下表皮等幾個(gè)部分，皮膚發(fā)育也和人類(lèi)皮膚發(fā)育有較大相似之處，因此，可以通過(guò)建立斑馬魚(yú)模型來(lái)替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停鳛榧?xì)胞與人體評(píng)價(jià)之間的重要過(guò)渡，為化妝品的安全和功效評(píng)估提供重要的依據(jù)。目前，斑馬魚(yú)模型已經(jīng)開(kāi)始用于動(dòng)植物提取物、抗菌劑、防曬劑等化妝品成分安全性的評(píng)價(jià)中。

在化妝品的安全性評(píng)估方面，可以用斑馬魚(yú)的胚胎來(lái)驗(yàn)證化妝品的急性胚胎毒性。將斑馬魚(yú)胚胎暴露化妝品中，觀察死亡率、畸形率、畸形形態(tài)以及胚胎的孵化率，通過(guò)計(jì)算半數(shù)致死濃度（LC50）、半數(shù)致畸濃度（EC50）、致畸指數(shù)（TI）等指標(biāo)來(lái)探討其對(duì)斑馬魚(yú)胚胎和幼魚(yú)的急性毒性[23]。Liu等[24]利用斑馬魚(yú)體內(nèi)模型檢測(cè)球形紅細(xì)菌提取物（LycogenTM）的生物毒性，結(jié)果顯示濃度高達(dá)100 μmol/L的LycogenTM不會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生毒性。也可以對(duì)斑馬魚(yú)整體觀察評(píng)價(jià)，觀察斑馬魚(yú)各器官如心臟、腦部、鰭、身體水腫、出血、著色等毒性反應(yīng)情況（見(jiàn)圖2），統(tǒng)計(jì)毒性發(fā)生率，驗(yàn)證供試品對(duì)斑馬魚(yú)的胚胎毒性情況[25]。

圖2 斑馬魚(yú)胚胎毒性表型圖Figure 2 Zebrafish embryotoxicity phenotype

斑馬魚(yú)模型也可以用在化妝品的功效評(píng)價(jià)方面。例如，斑馬魚(yú)皮膚中的黑色素調(diào)控機(jī)制與人類(lèi)高度一致，且生成速度快，肉眼能在顯微鏡下清晰觀察，配合圖像處理技術(shù)即可對(duì)化妝品減少黑色素的程度和體內(nèi)酪氨酸酶活性進(jìn)行定量分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)美白功效的評(píng)價(jià)[26]。Cha等[27]通過(guò)斑馬魚(yú)模型研究發(fā)現(xiàn)兩種海藻植物腔昆布（EC）和裂葉馬尾藻（SS）的提取物有抑制酪氨酸酶活性的作用，有望作為化妝品的美白劑。Lin等[28]選用斑馬魚(yú)體系評(píng)價(jià)紅車(chē)軸草中提取出的鷹嘴豆素A的體內(nèi)安全性和黑色素抑制效應(yīng)，證實(shí)88 mol/L鷹嘴豆素A不具有毒性，且其黑素抑制和酪氨酸酶抑制效應(yīng)較為明顯。在化妝品修復(fù)功效評(píng)價(jià)方面，斑馬魚(yú)成體組織、器官和魚(yú)鰭均有可再生性，切斷熒光標(biāo)記斑馬魚(yú)的尾鰭后，斑馬魚(yú)炎癥模型在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)即可建立，且尾鰭面積大易操作與觀測(cè)，因此斑馬魚(yú)成體尾鰭組織被廣泛運(yùn)用檢測(cè)護(hù)膚品的修復(fù)功效[29]。Cheng等[30]等利用斑馬魚(yú)模型評(píng)估了紫草樹(shù)葉提取物對(duì)UV引起皮膚損傷的化學(xué)防護(hù)能力，證實(shí)紫草提取物具有降低吸收紫外線(xiàn)和降低ROS濃度的能力，從而減少UV介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并據(jù)此認(rèn)為紫草樹(shù)葉提取物有開(kāi)發(fā)作為UV保護(hù)劑的潛力。斑馬魚(yú)模型在補(bǔ)水保濕功效評(píng)價(jià)方面也有重要的用途。一般傳統(tǒng)保濕功效評(píng)價(jià)方法為用皮膚角質(zhì)儀測(cè)量面部不同部位皮膚含水率、用水分儀測(cè)量經(jīng)皮失水率及用皮脂儀測(cè)量評(píng)估皮脂分泌量。儀器依賴(lài)性強(qiáng)，對(duì)志愿者要求高。在這方面，斑馬魚(yú)表皮就表現(xiàn)出優(yōu)良的性能，超出魚(yú)皮的滲透壓耐受范圍將會(huì)使斑馬魚(yú)產(chǎn)生脫水現(xiàn)象，尾部面積也會(huì)變小，因此通過(guò)高滲透溶液建立斑馬魚(yú)補(bǔ)水保濕誘導(dǎo)模型后，可以用來(lái)評(píng)估化妝品的保濕功效。用熒光PCR手段檢測(cè)相關(guān)基因如AQP3等的表達(dá)量可以評(píng)估化妝品的補(bǔ)水保濕功效[31]。表3中給出了目前基于斑馬魚(yú)模型的化妝品常見(jiàn)評(píng)價(jià)方法[32-34]。

表3 利用斑馬魚(yú)模型建立的化妝品常見(jiàn)評(píng)價(jià)方法Table 3 Common evaluation methods for cosmetics established using zebrafish model

目前，斑馬魚(yú)模型除了在美白功效評(píng)價(jià)中形成了團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)外,在其他功效性評(píng)價(jià)和安全性評(píng)價(jià)中均未有固定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，這成為未來(lái)化妝品行業(yè)功效評(píng)價(jià)和安全性評(píng)價(jià)的新目標(biāo)。

3 結(jié)語(yǔ)

作為世界上植物資源最豐富的地區(qū)之一，我國(guó)擁有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的化妝品可用植物資源有待開(kāi)發(fā)[35]。以現(xiàn)代新技術(shù)，高效進(jìn)行化妝品新原料開(kāi)發(fā)，是化妝品企業(yè)在新形勢(shì)下?lián)屨际袌?chǎng)制高點(diǎn)的重要戰(zhàn)略手段。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、細(xì)胞生物學(xué)及斑馬魚(yú)模型等在藥物研發(fā)領(lǐng)域已經(jīng)被證實(shí)是強(qiáng)有力的工具手段，將其導(dǎo)入化妝品功效原料的開(kāi)發(fā)過(guò)程已經(jīng)引起了充分重視。隨著這些生物技術(shù)手段在開(kāi)發(fā)化妝品功效原料中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，傳統(tǒng)化妝品行業(yè)內(nèi)研發(fā)周期冗長(zhǎng)、目標(biāo)原料不明確、產(chǎn)品功效難以理解等問(wèn)題有望得到解決，我國(guó)植物源化妝品的安全和功效評(píng)價(jià)體系將進(jìn)一步完善。利用現(xiàn)代生物技術(shù)方法，建立統(tǒng)一的化妝品功效評(píng)價(jià)系統(tǒng)，建立完善的植物源化妝品安全與功效評(píng)價(jià)體系，這對(duì)凈化國(guó)內(nèi)化妝品市場(chǎng)、維護(hù)我國(guó)化妝品行業(yè)的健康發(fā)展，具有極為重要的意義。