抗生素佐劑與抗生素聯(lián)用的抑菌作用研究進(jìn)展

朱浩 張嚴(yán)偉 劉潤 梁艷 楊奕 徐天樂 楊章平

（1. 揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，揚(yáng)州 225000；2. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225000；3. 江蘇省農(nóng)墾集團(tuán)有限公司， 南京 210019；4. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225000）

自1929年亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來，國內(nèi)外研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)了多種抗生素，抗生素極大地減少了由細(xì)菌感染引起的死亡，然而抗生素的過度使用和濫用不可避免地導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)［1-2］。近年，來自人類、動(dòng)物和其他來源的新型多藥耐藥基因不斷被鑒定出，包括編碼新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶基因（NDM），MCR基因和耐藥基因Tet（X3/X4），這些基因分別介導(dǎo)了對碳青霉烯類藥物、可樂定和替加環(huán)素的抗性［3］。新型耐藥基因?qū)е赂嗟亩嘀啬退幮裕∕DR）細(xì)菌出現(xiàn)，成為全球公共衛(wèi)生安全的一大難題［4］。1970年以來，隨著新型抗生素的開發(fā)進(jìn)度愈加緩慢以及耐藥基因的不斷涌現(xiàn)，抗生素治療的選擇愈發(fā)困難［5］。因此，尋找具有創(chuàng)新性，成本效益性的策略來解決細(xì)菌耐藥性問題成為目前迫切的需要，而抗生素增效劑則是一種很好的選擇［6］。

開發(fā)抗生素佐劑作為一種新的策略來減緩耐藥性細(xì)菌的傳播或降低細(xì)菌耐藥性，已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，已有報(bào)道表明抗生素佐劑與抗生素聯(lián)合使用能有效增強(qiáng)現(xiàn)有抗生素對耐藥菌的抗菌活性，提高殺菌效果［7］。本文概述了目前關(guān)于細(xì)菌病原體耐藥的主要分子機(jī)制，這是確定有效藥物組合的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。另外，描述了涵蓋所有典型分類的藥物組合策略及其作用機(jī)制。

1 細(xì)菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制

抗生素發(fā)現(xiàn)的益處會(huì)被抗生素耐藥性的出現(xiàn)逐漸抵消［8-9］。目前絕大多數(shù)人認(rèn)為抗生素耐藥性是一種獲得性生物現(xiàn)象，是因?yàn)樵谂R床環(huán)境和農(nóng)業(yè)過程中頻繁和過度使用抗生素［10］。迄今為止，抗生素耐藥性已發(fā)展成為全球公共衛(wèi)生面臨的最大挑戰(zhàn) 之一［11-12］。

細(xì)菌對抗生素的耐藥分為固有耐藥和獲得耐藥［13］。固有耐藥是由細(xì)菌染色體基因決定的，可以通過細(xì)菌染色體基因突變等方式產(chǎn)生。除固有耐藥外，細(xì)菌還可以通過水平基因轉(zhuǎn)移（如接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)）或染色體突變獲得耐藥基因，從而獲得對抗生素的耐藥。如圖1所示，抗生素耐藥性可以通過3種不同的機(jī)制來實(shí)現(xiàn)，包括通過水解酶或化學(xué)修飾酶使抗生素失活，抗生素靶標(biāo)修飾，以及通過上調(diào)主動(dòng)外排和下調(diào)OM（細(xì)胞外膜）通透性來預(yù)防抗生素在細(xì)胞內(nèi)的積累［14-15］。

圖1 細(xì)菌耐藥機(jī)制示意圖Fig. 1 Schematic diagram of bacterial drug resistance mechanism

2 抗生素佐劑協(xié)同抗生素對殺傷耐藥細(xì)菌的增效作用

2.1 植物源天然產(chǎn)物

2.1.1 生物堿類 生物堿是從一類從植物中分離出來的含氮雜環(huán)化合物，具有數(shù)量多，結(jié)構(gòu)多樣復(fù)雜等特點(diǎn)［16］。從中藥黃連中提取的總生物堿已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以與環(huán)丙沙星聯(lián)用顯著增強(qiáng)環(huán)丙沙星對沙門氏菌的抗菌作用［17］。黃連總生物堿中包含的物質(zhì)很多，例如小檗堿；小檗堿又稱黃連素，是黃連抗菌的主要有效成分［18］，Laudadio等［19］發(fā)現(xiàn)與妥布霉素單獨(dú)使用相比，小檗堿與妥布霉素聯(lián)合應(yīng)用對銅綠假單胞菌臨床分離株的抑制活性顯著增加，小檗堿可

以作為妥布霉素的佐劑增強(qiáng)抑菌作用。除了從黃連中提取的生物堿被證實(shí)是抗生素佐劑，從胡椒中提取的生物堿已經(jīng)被證實(shí)，例如胡椒堿。胡椒堿是一種廣譜抗驚厥藥［20］，但是Mgbeahuruike等［21］發(fā)現(xiàn)胡椒堿還可以作為抗生素佐劑，增強(qiáng)四環(huán)素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，能夠用來治療金黃色葡萄球菌感染。

2.1.2 多酚類 多酚是一種廣泛存在于自然界中的植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性［22］。ECG（表兒茶素沒食子酸酯）和EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）是從茶葉中提取的酚類物質(zhì)，能增強(qiáng)苯唑西林、頭孢呋辛、美羅培南對 MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）和MSSA（甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌）的抑菌作用［23-24］。黃腐酚是啤酒花中特有的一類酚類物質(zhì)，具有抗癌作用［25］，Bocquet等［26］發(fā)現(xiàn)黃腐酚可以作為佐劑增強(qiáng)環(huán)丙沙星、慶大霉素和惡唑西林的抑菌效果。除此之外，目前還發(fā)現(xiàn)一些水果果渣的酚類物質(zhì)也是潛在的抗生素佐劑，例如葡萄果渣酚類提取物可以提高四環(huán)素對大腸桿菌的殺菌效果［27］。部分多酚類物質(zhì)例如ECG，EGCG等，雖然已經(jīng)被證實(shí)與抗生素聯(lián)用可以恢復(fù)耐藥菌株對抗生素的敏感性，但是其自身性質(zhì)不穩(wěn)定，聯(lián)用效果容易受到外界環(huán)境的影響，所以目前很難應(yīng)用到臨床來治療細(xì)菌感染。

2.1.3 黃酮類 黃酮類化合物廣泛存在于各種藥用植物中，是許多中草藥的活性成分，對多種耐藥菌株具有抗菌活性［28］。黃岑苷、槲皮素、楊梅素等黃酮類化合物已經(jīng)被證實(shí)能夠與抗生素聯(lián)合應(yīng)用有效提高耐藥菌株對抗生素的敏感性。槲皮素是具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，廣泛存在于許多植物的莖皮、花、葉、芽、種子、果實(shí)中［29］。Kim等［30］發(fā)現(xiàn)槲皮素與氨芐青霉素聯(lián)合對MRSA表現(xiàn)出部分協(xié)同作用，槲皮素可以作為氨芐青霉素的佐劑提高對MRSA的抗性。楊梅素在楊梅等植物中廣泛存在，到目前為止，楊梅素已經(jīng)被證明具有多種生物學(xué)功能［31］，Lin等［32］評估了楊梅素和頭孢西丁聯(lián)合使用治療產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)楊梅素與頭孢西丁聯(lián)用對產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌有增效增效作用。此外，黃岑苷是從黃芩根中提取分離出來的一種黃酮類化合物［33］，同樣具有顯著的生物活性，具有抑菌和抗炎作用，黃芩苷也能提高氨芐青霉素、阿莫西林、甲氧西林、頭孢噻肟的抑菌效果，具有恢復(fù)β-內(nèi)酰胺類抗生素對耐-β內(nèi)酰胺金黃色葡萄球菌和其他耐β-內(nèi)酰胺金黃色葡萄球菌療效的潛力［34］。

2.1.4 揮發(fā)油類 植物中揮發(fā)性油類一般分為萜烯類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含氮和硫化合物［35］。香菜精油是以壓碎的成熟種子為原料，采用蒸餾法提取出來的揮發(fā)性油類物質(zhì)，目前已知的是其具有皮膚以及生理心理療效，但Duarte 和Aelenei發(fā)現(xiàn)，香菜精油與慶大霉素對大腸桿菌ATCC 25922和鮑曼不動(dòng)桿菌有協(xié)同抑菌作用，香菜精油增加了大腸桿菌對慶大霉素和環(huán)丙沙星的敏感性［36-37］。Elalfi等［38］發(fā)現(xiàn)慶大霉素與黃連葉精油聯(lián)用時(shí)，黃連素精油顯著增強(qiáng)慶大霉素的活性，重新恢復(fù)革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性表皮葡萄球菌對慶大霉素的敏感性。揮發(fā)油類具有揮發(fā)性和難溶性，由于溶劑的影響，聯(lián)用效果不穩(wěn)定。

2.2 動(dòng)物源天然產(chǎn)物

2.2.1 高分子糖類 目前，高分子糖類中研究最廣泛的是殼聚糖，殼聚糖是一種天然聚陽離子多糖，無毒無害，廣泛存在于甲殼類動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物中［39］。Mu等［40］發(fā)現(xiàn)殼聚糖聯(lián)合氨基糖苷類抗生素如阿米卡星，對單增李斯特菌生物膜的抑制或破壞效果優(yōu)于單獨(dú)使用抗生素，強(qiáng)調(diào)了殼聚糖/阿米卡星聯(lián)合應(yīng)用可能有助于提高抗生素的有效性。Tin等［41］發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖與磺胺甲惡唑聯(lián)用對銅綠假單胞菌有協(xié)同抑菌作用。殼聚糖具有無毒無污染，生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)殼聚糖及其衍生物作為抗生素佐劑擁有良好的前景。

2.2.2 抗菌肽 抗菌肽是宿主非特異性免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體的肽類活性物質(zhì)，是天然免疫的效應(yīng)分子［42］。劉倚帆等［43］發(fā)現(xiàn)牛乳鐵蛋白肽和昆蟲類抗菌肽天蠶素 A與金霉素聯(lián)用對4種細(xì)菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門氏菌和銅綠假單胞菌）表現(xiàn)為協(xié)同抑菌作用，天蠶素A與牛乳鐵蛋白肽是兩種效果良好的抗生素佐劑。Hwang等［44］也證實(shí)了抗菌肽coprisin和萬古霉素聯(lián)用對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為協(xié)同作用，在萬古霉素存在的情況下，抗菌肽coprisin的協(xié)同活性會(huì)降低菌株在較低濃度下的生存能力，尤其對革蘭氏陰性菌有明顯的增效作用。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽具有廣譜抗微生物活性的優(yōu)點(diǎn)，多數(shù)抗菌肽可以高效地殺死數(shù)百種微生物，所以對于抗菌肽的研究側(cè)重于其自身的抗菌特性，而不是其作為抗生素佐劑的特性。

2.3 人工合成類

一些人工合成的物質(zhì)現(xiàn)在也被發(fā)現(xiàn)可以作為抗生素佐劑，例如納米材料，合成的多肽等。納米材料中的納米銀已經(jīng)被證實(shí)可以作為慶大霉素和氯霉素的佐劑，增強(qiáng)慶大霉素和氯霉素對糞腸球菌的抑菌作用［45］。SLAP-S25是一種人工合成的多肽，在亞mic水平下，SLAP-S25與四環(huán)素、氧氟沙星、利福平、頭孢吡肟和萬古霉素之間存在協(xié)同抑菌作用，SLAP-S25可以作為一種潛在的廣譜抗生素佐劑用于治療細(xì)菌感染［46］。由于人工合成的抗生素佐劑沒有進(jìn)行安全性評價(jià)，暫時(shí)只能停留在實(shí)驗(yàn)室階段。

2.4 其他類型

除了植物源、動(dòng)物源天然產(chǎn)物以及人工合成的能夠作為抗生素佐劑之外，還有一些噬菌體和治療疾病的藥物，可以作為抗生素佐劑，提高抗生素的殺菌作用。周鐵麗等［47］總結(jié)了部分噬菌體與抗生素聯(lián)用具有協(xié)同作用，比如長尾科噬菌體與頭孢曲松聯(lián)用，可以協(xié)同減少銅綠假單胞菌的生長；肌尾科噬菌體與環(huán)丙沙星聯(lián)合使用，可以降解肺炎克雷伯菌的生物膜，提高環(huán)丙沙星的抑菌效果［48-49］。Liu等［50］研究發(fā)現(xiàn)用于治療Ⅱ型糖尿病的二甲雙胍與多西環(huán)素聯(lián)用可以恢復(fù)耐藥細(xì)菌對多西環(huán)素的敏感性，二甲雙胍顯著抑制了細(xì)菌的外排泵活性并增強(qiáng)了多西環(huán)素的殺傷效果，而注入1/2 MIC的二甲雙胍和1/2 MIC的多西環(huán)素可顯著減少99%的細(xì)菌。

3 抗生素佐劑的作用機(jī)制

3.1 耐藥酶抑制劑作用

耐藥酶通過多種途徑削弱抗生素活性，如抗生素水解或修飾，或抗生素靶點(diǎn)修飾。抑制酶介導(dǎo)的耐藥已被證明是一種臨床成功的方案，可恢復(fù)特定抗生素的活性［51］。最成功的例子是β-內(nèi)酰胺酶抑制劑［52］。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑分為不可逆抑制劑和可逆抑制劑。不可逆抑制劑利用β-內(nèi)酰胺的結(jié)構(gòu)或適當(dāng)?shù)牡如摅w附著在內(nèi)酰胺酶的活性位點(diǎn)或附近，從而抑制酶的功能［53］。目前市場上只有3種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑可以作為不可逆抑制劑與抗生素聯(lián)用，分別是：奧格門汀（阿莫西林+克拉維酸）、特美汀（替卡西林+克拉維酸）、優(yōu)立新（氨芐西林+舒巴坦）和Zosyn（哌拉西林+他唑巴坦）；其中最著名的組合是奧格門汀，作用原理是克拉維酸通過與關(guān)鍵β-內(nèi)酰胺酶功能位點(diǎn)的絲氨酸殘基形成不可逆鍵，防止阿莫西林水解［54］。

可逆抑制劑是在結(jié)合到酶的臨時(shí)基礎(chǔ)上，使酶的活性最終恢復(fù)。這些藥劑都是動(dòng)態(tài)平衡的，通過簡單的稀釋抑制劑就可以減少它們的抑制作用，例如2015年發(fā)現(xiàn)的阿維巴坦和2017年發(fā)現(xiàn)的法硼巴坦［55］。由此，以β-內(nèi)酰胺酶作為靶點(diǎn)控制細(xì)菌耐藥仍是較為普遍的抗耐藥技術(shù)研發(fā)的重要途徑。

3.2 外排泵抑制劑作用

細(xì)菌通過外排泵主動(dòng)將抗生素外排，是抗生素治療失效的重要原因之一［56］。目前研究發(fā)現(xiàn)的抗生素佐劑主要通過兩種方式來影響細(xì)菌外排泵外排抗生素，第一種方式是直接破壞外排泵結(jié)構(gòu)，例如喹啉衍生物7-硝基-8-甲基-4-（2′-（哌啶乙基）-氨基喹啉［57］對大腸桿菌AcrAB外排泵具有較高的抑制活性。當(dāng)該衍生物與氯霉素聯(lián)合使用時(shí)，可以觀察到氯霉素在細(xì)胞內(nèi)的積累增加。該衍生物如何抑制流出泵的一個(gè)可能的解釋是基于大腸桿菌的TolC外排泵結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)顯示了一個(gè)直徑為35?的內(nèi)部通道。由于烷基氨基喹啉的直徑為20?，對泵的抑制可能發(fā)生在內(nèi)膜的載體上或泵的內(nèi)部與外部通道的交界處，破壞了泵的結(jié)構(gòu)。

另一種方式是通過抑制編碼外排泵的基因的表達(dá)。Salaheen等［58］研究酚類藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum）和黑莓（Rubus fruticosus）果渣提取物（BPE）對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的治療作用及其機(jī)制。BPE中原兒茶酸、香豆酸、香草酸、咖啡酸、沒食子酸等5種主要酚酸以及粗品BPE完全抑制了MRSA體外生長，探究作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)BPE通過下調(diào)金黃色葡萄球菌外排泵（norA、norB、norC、mdeA、sdrM和sepA）基因的表達(dá)恢復(fù)了甲氧西林對MRSA的作用。然而，有研究指出，杜洛西汀與氯霉素聯(lián)用后促進(jìn)了大腸桿菌的多重耐藥性，其中包括外排泵的活性增加［59］。因此，對外排泵相關(guān)基因的抑制作用不一定確保細(xì)菌在長期抗生素壓力的情況仍能維持一定藥物敏感性。

3.3 細(xì)菌膜通透性改變

大多數(shù)抗生素在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，這需要它們通過細(xì)胞膜滲透到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。疏水性抗生素通過脂質(zhì)雙分子層擴(kuò)散，而親水性抗生素僅通過細(xì)菌孔進(jìn)入。因此，膜組成、膜脂和孔都影響膜的通透性，并影響細(xì)菌對抗生素的敏感性［60］。

一些佐劑已被發(fā)現(xiàn)能夠通過耗散細(xì)菌膜電位（ΔΨ），進(jìn)而上調(diào)跨膜質(zhì)子梯度，來促進(jìn)細(xì)菌對抗生素的攝取，從而克服內(nèi)在耐藥性［61］。例如，止瀉藥洛哌丁胺被確定為半合成四環(huán)素類抗生素米諾環(huán)素的一種佐劑。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，洛哌丁胺降低了質(zhì)子動(dòng)力（PMF）的電組分（Δψ），為了對抗這種影響并維持ATP合成水平，細(xì)菌增加了內(nèi)膜的pH梯度（ΔpH），這又反過來促進(jìn)了細(xì)菌對米諾環(huán)素的 攝取［62］。

部分佐劑也可通過調(diào)控相關(guān)膜蛋白基因的方式，增加細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)抗生素在細(xì)胞內(nèi)的積累，從而提高抗生素的作用效果。例如Dhara等［63］通過觀察肉桂醛與頭孢他啶聯(lián)合對大腸桿菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合作用 6 h 后細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜破裂、細(xì)胞質(zhì)流失；研究促進(jìn)孔蛋白基因（ompC、ompF、ompK35和 ompK36）的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，肉桂醛提高了孔蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平，從而提高了細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性，促進(jìn)抗生素流入細(xì)胞內(nèi)，呈現(xiàn)出明顯的協(xié)同抗菌作用。

4 總結(jié)與展望

目前已發(fā)現(xiàn)較多物質(zhì)可作為抗菌增效劑，這些物質(zhì)與抗生素聯(lián)用呈現(xiàn)協(xié)同或部分協(xié)同作用，抗菌增效劑可以通過改變細(xì)菌膜的通透性、改變抗生素的靶標(biāo)、抑制細(xì)菌外排泵活性和抑制抗生素水解等作用機(jī)制來增強(qiáng)抗生素的抗菌活性。但是，目前研究模式太過單一，大部分研究停留于找到抗菌增效劑，證明其與抗生素有協(xié)同作用，但沒有具體闡釋抗菌增效劑的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中也只針對一種或者幾種耐藥菌，而聯(lián)合試驗(yàn)也只針對一種抗生素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠系統(tǒng)全面。聯(lián)合治療面臨的挑戰(zhàn)是能否在體內(nèi)發(fā)揮協(xié)同作用，具體涉及到許多關(guān)鍵決定因素，如復(fù)雜的藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)。此外，聯(lián)用藥物的協(xié)同作用可能伴有毒副作用增強(qiáng)。因此，需要在臨床試驗(yàn)之前進(jìn)行系統(tǒng)的毒理學(xué)評價(jià)。

盡管面臨挑戰(zhàn)和困難，但是在抗生素開發(fā)受限且細(xì)菌耐藥性增加的大環(huán)境下，聯(lián)合療法，特別是抗生素增效劑的選擇，無疑是治療耐藥細(xì)菌感染的一個(gè)新途徑。此外，值得關(guān)注的是，聯(lián)合治療的耐藥發(fā)展要比單藥治療慢，所以聯(lián)合治療在未來治療細(xì)菌感染具有極大開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。