一種用于PCR的番茄DNA快速粗提方法

申恒 劉思慧 李躍 李敬濤 梁文星

（1. 青島農業大學植物醫學學院 山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，青島 266109；2. 青島農業大學理學與信息技術學院， 青島 266109）

隨著分子生物學的發展，對于植物的研究上升到分子水平。聚合酶鏈式反應（PCR）可用于體外擴增DNA，在生物學、醫學及植物病理學等領域已經得到了廣泛應用。在對植物進行分子生物學鑒定時，離不開分離基因組DNA，但研究目的不同，對DNA的質量要求也不同。目前提取DNA的方法主要有CTAB法、微波法、SDS法、尿素法、乙酸銨等［1-4］，其中CTAB提取法可以穩定高質量的提取基因組，提取質量較高［2-3］，但其步驟繁瑣，需要有機溶劑反復抽提，提取過程需在通風櫥進行，對提取環境和使用藥品有一定要求，對人體健康也有一定風險［5］。當需要提取的DNA樣品份數較多時，使用傳統的CTAB提取法提取DNA的步驟繁瑣，消耗大量研究時間，效率較差。而有些研究對DNA的提取質量要求不高，微量DNA就可通過PCR擴增，達到實驗目的［6］。Zou等［7］開發了一種試紙條快速提取純化DNA的方法，但目前還未商業化開發，所用試紙條也需要特殊處理，且在高通量篩選轉化子時，是否會存在提取純化DNA不穩定的情況從而影響檢測結果也有待確定。最近的研究也報道了使用其它不同類型的膜材料快速提取核酸［8-14］，包括氧化鋁、基于纖維素的FTA濾膜，和基于二氧化硅的濾膜，這些方法雖然便捷簡單但是目前仍然需要特定的配套材料，在常規實驗室條件下利用的不多。因此，探索一種更加實用、快速、便捷、穩定、高效的粗提DNA方法仍然十分有必要。

本研究旨在優化一種實驗室條件下可簡單、高效、快速的提取植物DNA方式，并作為模板進行PCR擴增的方法。NaOH可以使植物細胞處于強堿環境下，使細胞裂解暴露DNA［15-16］。而利用高速離心可除去蛋白等雜質，取上清液以 TE緩沖液中和，提供緩沖環境，防止核酸被破壞［17］。本實驗以番茄為材料，采取優化的NaOH法提取植物組織DNA，并比較 CTAB法與NaOH-Tris法提取DNA的異同，同時測定提取DNA的濃度，并以其為模板進行PCR 擴增，通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶比較兩種方法提取DNA的質量差別，以此確定優化的NaOH法提取DNA可穩定、有效的進行后續PCR分析。同時將NaOH提取DNA的方法應用于番茄轉化子的快速篩選鑒定。此外，本研究還對番茄不同組織也進行了DNA提取及PCR檢測，證明了該方法對植物粗提DNA用于PCR檢測的組織材料具有廣泛適用性。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用植物材料為番茄（Solanum lycopersicum cv. Alisa Craig［AC］）。將植物種子種植于草炭土∶蛭石比例為3∶1的土壤中，在28℃相對濕度為60%，光暗交替（光照16 h）的溫室內培養4周左右。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集 取新鮮健康番茄植物的葉片大約0.05 g，或者根、莖、葉柄等組織0.15 g組織，放入2 mL離心管中，加入 1粒直徑 5 mm 鋼珠或磁珠，蓋上蓋，放入液氮中冷凍，之后用全自動樣品快速研磨儀（JXFSTPRP-48）快速研磨 90-120 s，至粉狀。

1.2.2 DNA提取方法

1.2.2.1 CTAB法 （1）在植物粉末中加入1mL 2% CTAB 的提取液（2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% β-巰基乙醇，pH8.0），加入研磨珠，劇烈振蕩，于65℃水浴加熱40 min，期間每隔20 min左右搖動1次，充分混合樣品與提取液。（2）將樣品于室溫下12 000 r/min，離心7 min，吸上清（約0.7 mL）在通風廚中加入等體積的氯仿，反復顛倒，充分混勻后室溫下12 000 r/min，離心10 min。（3）吸上清液（約0.5 mL）于新的離心管中，加入等體積的異戊醇輕搖混勻，置于-20℃冰箱 20-30 min。（4）室溫下12 000 r/min，離心10 min，棄上清液，留沉淀。（5）用75%乙醇洗沉淀2次，自然風干DNA。（6）DNA干燥后，加入40 μL ddH2O 溶解DNA，然后保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2.2 NaOH法 在粉末中加入500 μL 不同濃度（0.25 mol/L，0.5 mol/L或0.75 mol/L）的NaOH顛倒混勻，靜置不同時間（0、5、10、20、40、及60 min）后，室溫下12 000 r/min離心10 min。取10 μL上清液轉移到新鮮管中，加入90 μL的TE buffer（100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA）中和，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3 DNA濃度測定 應用核酸蛋白測定儀（BioPhotometer D30），將提取的植物DNA樣品做適當稀釋后測量DNA含量。

1.2.4 PCR擴增以及電泳檢測 本研究選取番茄的SlPR1基因（F：5′-ATGCAAAATTCACCCCAAGAC-3′；R：5′-GTAAGGACGTTGTCCGATCC-3′）或SlActin基因序列（F：5′-TTGCTGACCGTATGAGCAAG-3′；R：5′-GTCTGGTCCATCCATTGTCC-3′）進行擴增。實驗采用20 μL反應體系，基因組DNA取2 μL作為模板，利用1.1×T3 Super PCR Mix（TSE030）聚合酶按照產品推薦的標準程序進行擴增。反應結束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對反應體系進行電泳，經過紫外投射顯示電泳結果進行分析。

1.2.5 利用堿裂解法對番茄轉基因植株進行PCR 鑒定 實驗室構建了基于CRISPR-Cas9的PR1基因雙靶點編輯載體，采用農桿菌介導的轉化對番茄子葉進行轉化，并在篩選標記培養上，進行篩選，獲得T0代基因編輯轉化子。隨后對獲得的植物轉化子移栽到土壤中，生長4周左右，取新鮮葉片，利用NaOH-Tris的方法進行粗提DNA，然后利用SlPR1基因進行擴增，檢測基因編輯情況，驗證轉化子。PCR 反應結束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對反應體系進行電泳，經過紫外投射顯示電泳結果進行分析。

2 結果

2.1 DNA提取流程比較

在樣品基本一致的前提下，獲得液氮研磨的粉狀組織后，利用NaOH法提取的DNA的用時較短，約0.5 h，而利用CTAB法提取DNA用時較長，累計約2.5 h。NaOH法提取DNA不僅節約時間，且所用危險試劑數量少，無需使用氯仿及異丙醇等有機試劑抽提，毒性低，對人身更加安全，因此本研究將開發簡單的NaOH法進行番茄基因組提取及PCR檢測（表1）。

表1 NaOH法及CTAB法提取番茄DNA的比較Table 1 Comparison of NaOH and CTAB method for extracting S. lycopersicum DNA

2.2 不同NaOH濃度提取番茄基因組

通過利用不同NaOH濃度提取的番茄DNA進行條件篩選，結果（圖1）顯示番茄用0.25 mol/L NaOH提取的量約520 μg/mL，用0.5 mol/L NaOH提取的量約為810 μg/mL，用0.75 mol/L NaOH提取的量約740 μg/mL。結果說明，本研究所用不同濃度NaOH均可以提取番茄基因組，但利用0.5 mol/L的NaOH提取濃度最高，因此推薦0.5 mol/L的NaOH進行番茄基因組提取。

圖1 不同NaOH濃度提取番茄基因組的核酸定量檢測Fig. 1 Quantitative detection of extracted genomic DNA from S. lycopersicum with different NaOH concentrations

2.3 不同NaOH處理時間提取番茄基因組PCR檢測

通過利用0.5 mol/L的NaOH濃度提取的番茄DNA進行處理條件篩選，結果（圖2）顯示NaOH處理5-20 min PCR檢測條帶清晰，最佳NaOH處理時間為10 min。隨著時間延長，條帶減弱，結果說明NaOH處理5 min后可以進行中和，均可以提取番茄基因組，但NaOH處理10 min效果最好，因此推薦NaOH的最佳處理時間為10 min。

圖2 不同NaOH處理時間對番茄基因組PCR檢測Fig. 2 PCR detection of S. lycopersicum genome with different NaOH treatment time

2.4 利用NaOH法和CTAB法提取番茄DNA濃度 比較

通過利用NaOH法及CTAB法提取的DNA進行濃度檢測，結果（圖3）顯示番茄用NaOH法提取的量平均約630 μg/mL，用CTAB法提取的量平均約為2 700 μg/mL。結果說明，CTAB法提取的植物DNA的量比利用NaOH提取的量要多4倍左右，兩種方法提取的DNA的總量具有顯著性差異。但NaOH法提取的量滿足常規PCR需求，本研究提取番茄基因組可以用NaOH法提取。

圖3 不同方法提取番茄基因組的核酸定量檢測Fig. 3 Quantitative detection of extracted genomic DNA from S. lycopersicum with different methods

2.5 堿裂解法和CTAB法粗提DNA的PCR擴增結果比較

為了進一步確定上述步驟中NaOH提取的DNA滿足PCR分子檢測的質量需求，健康番茄葉片組織利用NaOH和CTAB法提取DNA后，我們利用番茄病程相關蛋白基因SlPR1檢測NaOH法提取的基因組，利用CTAB法提取的基因組作為對照。結果（圖4）表明，NaOH法提取基因組進行PCR檢測時，目標基因條帶清晰特異，基本與CTAB法提取基因組進行的PCR一致，因此可以利用NaOH法提取番茄基因組，并進行PCR檢測。

圖4 不同方法提取基因組的PCR檢測Fig. 4 PCR detection of extracted genome by different methods

2.6 堿裂解法對番茄轉化子葉片粗提DNA的PCR鑒定

為了進一步確定上述步驟中NaOH提取及PCR檢測可用于番茄轉化子的鑒定，健康番茄轉化子葉片組織利用NaOH法提取DNA后，利用番茄病程相關蛋白基因SlPR1檢測NaOH法提取的T0代轉基因番茄的基因組，理論上基因編輯成功的靶基因會因基因缺失而使靶標基因變小。PCR檢測結果（圖5）表明，目標基因SlPR1在轉化子1和4中出現清晰特異的小條帶，暗示該植株可能為雜合的轉基因番茄。

圖5 利用NaOH方法提取番茄轉化子葉片基因組并進行PCR檢測Fig. 5 PCR detection of the extracted leaf genome of S. lycopersicum transformants using NaOH method

2.7 堿裂解法對番茄轉化子葉片DNA的PCR檢測及測序鑒定

為了確定上述步驟中NaOH鑒定番茄轉化子的確定性，轉化子1號及4號葉片組織利用NaOH法和CTAB法提取DNA后，同樣利用SlPR1檢測T0代轉基因番茄的基因組，兩種方法PCR檢測結果一致，均出現了截短的小條帶，表明NaOH法提取的DNA滿足轉化子的PCR鑒定（圖6-A），對轉化子1號的PCR產物進行測序分析，發現只有在DNA剪切位點后面的序列與野生型序列不一致（圖6-B），同時在該位點以后出現套峰，由于T0代植株具有雜合現象，因此該位點后的測序結果會出現套峰，這也基本確定SlPR1確實發生了基因編輯，可進行后續進行種子分離純化。該結果說明，可以利用NaOH法提取番茄基因組，并進行轉基因番茄的PCR檢測。

圖6 番茄轉化子的PCR檢測及轉化子測序驗證Fig. 6 PCR detection and sequencing verification of S. lycopersicum transformants

2.8 堿裂解法對番茄不同組織DNA提取及PCR 檢測

利用2.3中所述的NaOH法提取健康番茄的不同組織基因組DNA，利用番茄內參基因SlActin進行PCR檢測。結果（圖7）顯示，番茄不同組織樣品的DNA提取良好，均可作為模板進行PCR檢測，且PCR特異性強。說明NaOH法可對番茄根、莖、葉等不同組織進行DNA提取，對樣品不具有組織選擇性。

圖7 番茄幼苗不同組織DNA提取及PCR檢測Fig. 7 DNA extraction and PCR detection from the different tissues of S. lycopersicum seedlings

2.9 堿裂解法提取植物DNA及PCR流程

根據以上實驗結果，番茄基因組DNA提取及PCR檢測主要包括以下流程（圖8）：取番茄的任何組織（根、莖、葉、葉柄、頂稍等）適量；通過液氮進行組織破碎；利用0.5 mol/L NaOH法快速提取DNA，然后利用TE緩沖液中和；進行PCR檢測。

圖8 番茄組織DNA提取及PCR檢測簡單流程Fig. 8 Schematic diagram illustrating the process of DNA extraction and PCR detection from S. lycopersicum tissues

3 討論

提取植物基因組DNA，是對植物進行分子生物學研究的重要的環節。有關植物DNA的提取方法很多，常采用CTAB提取法、SDS提取法等化學法破除細胞壁，再與有機溶劑抽提相結合的方式［2，18-19］。 這些方法所提取的DNA質量高，穩定性好，但步驟繁瑣，耗時長，在樣本所需量較大時，耗費大量研究時間，效率低。在后續許多研究中，部分實驗對DNA的質量要求并非極其嚴格，可通過RCR對基因實現擴增即可達到研究目的。因此本研究提出了一種用NaOH和Tris pH8.0快速粗提植物DNA的方式，并將其與傳統CTAB法做對比。用兩種方式提取DNA的過程：（1）在耗時方面，CTAB法多次離心靜置，反復用有機溶劑抽提，其中還包括短時間的低溫儲藏，完成提取需2.5-3 h，耗費時間長。在樣本需求量大時，提取時長增加。NaOH-Tris法，操作簡單，省去有機溶劑反復抽提和低溫下冷藏靜置，更無需在通風櫥內操作，節省了大量時間。除去抽真空干燥處理，完成提取只需0.5 h，耗時較少。（2）在試劑方面，CTAB法所使用藥品復雜多樣，所需的氯仿異丙醇等藥物均具有一定毒性，易對環境造成污染，對實驗室有一定要求。而本實驗提出的方法使用藥品單一，所用NaOH和Tris屬于實驗室常備藥品，成本低，安全系數高。（3）在操作方面，CTAB法步驟繁瑣，在提取過程中易出現操作失誤而導致DNA提取質量差，NaOH-Tris法步驟單一，減少了過程出錯的風險。（4）通過電泳條帶的亮度比較，經過PCR擴增，兩種方式所提DNA質量并無太大差別，均可滿足常規PCR檢測。利用NaOH法提取DNA進行分子檢測在苔蘚、真菌及動物細胞等物種中都展開了一系列應用［15-16，20-21］，體現了NaOH法在DNA提取過程中的優勢。

此外，本研究利用該方法對植物轉化子進行篩選鑒定，進一步確定了NaOH方法在提取DNA過程中的穩定性，實驗室目前也利用該方法成功鑒定了植物幾十個轉化子，獲得多個突變體，但有關該方法的具體操作流程并沒有報道。同時，為了進一步分析該方法對其它植物組織DNA提取的普適性，我們還提取了根、莖、葉柄等組織，并進行了PCR鑒定。這些結果表明該方法也能夠對植物多種不同組織實現穩定的DNA提取，并應用于基因克隆及PCR檢測，近年來，實驗室常使用該方法提取其它植物DNA并進行基因克隆，目的基因從200-2 000 bp均能實現穩定克隆，說明該方法提取的DNA質量完整性較好，不會因為對DNA損傷影響PCR擴增。然而，本方法使用的NaOH是一種強堿，對DNA會造成一定損害，因此NaOH在使用過程中時間不宜過長，且盡量不要劇烈混合，盡可能保證細胞破碎加入NaOH后10 min內完成離心，并最終以TE buffer （100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA）中和［17］，否 則可能因為長時間的堿性條件使基因組DNA片段慢慢斷裂，嚴重破壞DNA完整性，導致無法進行有效基因克隆。而EDTA的加入，可以螯合Ca2+和Mg2+等二價金屬離子，抑制部分DNase的活性和抑制微生物生長，以便延長提取DNA的保存期限。

4 結論

用NaOH和Tris提取植物DNA是一種安全、廉價、簡單、快速、高效的DNA提取方法，可用于常規基因克隆及轉基因植物的快速篩選鑒定，利用該方法可進一步節約實驗時間及成本，具有廣泛的應用前景和利用價值。