途徑工程改造谷氨酸棒桿菌產(chǎn)莽草酸

聶立斌 易鈴欣 鄧妍 盛琦 吳曉玉 張斌

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)利用工程實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045）

莽草酸是一種多烯類芳香族天然產(chǎn)物，也是合成高附加值化學(xué)品的平臺(tái)化合物［1］。21世紀(jì)，為了應(yīng)對(duì)頻繁爆發(fā)的禽流感疫情，瑞士羅氏制藥首先將莽草酸作為關(guān)鍵手性原料合成抗禽流感藥物磷酸奧司他韋（商品名：達(dá)菲），使得該化合物備受人們關(guān)注［2］。并且，莽草酸及其衍生物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用同樣極為廣泛。藥理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，莽草酸在抗病毒、抗菌抗炎、抗腫瘤和治療心血管疾病方面具有突出作用［3-4］。另外，由于具備獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，莽草酸在食品、化工［5］等領(lǐng)域也有一定的應(yīng)用，是化學(xué)合成食品防腐劑、有機(jī)酸等的重要原料［6］。目前，莽草酸的生產(chǎn)方法主要有植物提取法［7-8］、化學(xué)合成法［9-13］以及微生物發(fā)酵法［8，11］。其中，植物提取法存在原料供應(yīng)不穩(wěn)定的問題，常受產(chǎn)地、氣候等條件影響，因而不能滿足工業(yè)上對(duì)莽草酸的產(chǎn)能需求。化學(xué)合成法也是存在原料有限、合成步驟復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、易造成環(huán)境污染等問題，因而限制了該方法的應(yīng)用。與前兩種莽草酸合成方法相比，微生物發(fā)酵法具有操作工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品立體專一性好、不受產(chǎn)地氣候條件影響等優(yōu)勢(shì)，是一種極具潛力的莽草酸生產(chǎn)方法，開發(fā)高產(chǎn)莽草酸的重組菌成為一個(gè)研究熱點(diǎn)科學(xué)問題。

目前，已報(bào)道產(chǎn)莽草酸的基因工程菌有：大腸 桿 菌（Escherichia coli）［14-17］、枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis）［18-19］、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freund）［20-23］、谷 氨 酸 棒 桿 菌（Corynebacterium glutamicum）［24-27］以 及 巨 大 芽 孢 桿 菌（Bacillus megaterium）［28］。雖然可用于合成莽草酸的菌種較多，但目前已投產(chǎn)的莽草酸生產(chǎn)菌種均集中于E. coli。已有研究表明，羅氏制藥公司有33%左右的莽草酸是通過重組大腸桿菌發(fā)酵合成，而多數(shù)依然需要依靠植物提取法［29］，說明E. coli在生產(chǎn)性能和安全性方面具有一定的局限性。作為重要的工業(yè)微生物，谷氨酸棒桿菌相較于E. coli具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，是FDA認(rèn)證的生物安全（generally recognized as safe，GRAS）菌種［30］，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)各種食品級(jí)化合物，同時(shí)也被積極開發(fā)用于發(fā)酵產(chǎn)莽草酸。例如，Kogure等［24］以野生型谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌種，進(jìn)行了質(zhì)粒表達(dá)大腸桿菌來源抗反饋抑制的aroG和內(nèi)源性的aroBDE，再輔助優(yōu)化磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑以及PTS葡萄糖攝取等遺傳改造，所獲得重組菌在添加苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、抗生素等多種營(yíng)養(yǎng)元素分批補(bǔ)料發(fā)酵條件下的莽草酸產(chǎn)量達(dá)到141 g/L。劉暢等［26］基于C. glutamicum的LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ShiR構(gòu)建了一種莽草酸生物傳感器。該傳感器可以定量監(jiān)測(cè)胞內(nèi)莽草酸濃度識(shí)別高產(chǎn)菌種，有較大的潛力應(yīng)用于產(chǎn)莽草酸重組菌的高通量篩選。盡管通過改造C. glutamicum已獲得莽草酸產(chǎn)量較高的重組菌，但是在改造過程中使用的表達(dá)質(zhì)粒不利于工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)，添加抗生素和誘導(dǎo)劑會(huì)大幅增加下游分離純化的成本。為了克服這個(gè)問題，本研究利用插入強(qiáng)啟動(dòng)子和染色體整合表達(dá)相結(jié)合的方式對(duì)莽草酸合成代謝途徑進(jìn)行改造。首先，敲除aroK基因?qū)崿F(xiàn)莽草酸的積累；其次，通過插入強(qiáng)啟動(dòng)子的策略過表達(dá)關(guān)鍵限速酶AroG，增加莽草酸代謝途徑的代謝通量；最后，在敲除qsuB基因的同時(shí)，整合表達(dá)E. coli來源抗反饋抑制突變的AroG，構(gòu)建了一株遺傳穩(wěn)定的產(chǎn)莽草酸重組菌種，涉及的遺傳改造策略可以為今后莽草酸菌種的選育提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和引物 本研究使用的谷氨酸棒桿菌C. glutamicum CICC 20189購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，E. coli DH5α為實(shí)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒和引物列于下表。本實(shí)驗(yàn)所用的菌種如表1所示、質(zhì)粒如表2所示、引物如表3所示。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的菌種Table 1 Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli strains used in this study

表2 本實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒 Table 2 Plasmids used in this study

表3 本實(shí)驗(yàn)所用的引物 Table 3 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 LB培養(yǎng)基（g/L）：5 g 酵母粉，10 g 胰蛋白胨，10 g NaCl；LBG培養(yǎng)基（g/L）：5 g 酵母粉，10 g 胰蛋白胨，10 g NaCl，2% 葡萄糖。種子培養(yǎng)基（g/L）：10 g 酵母粉，30 g 玉米漿，4 g （NH4）2SO4，0.25 g MgSO4，1 g KH2PO4，1 g K2HPO4， 0.01 g FeSO4，0.01 g MnSO4，5% 葡萄糖，pH 7.2。發(fā) 酵培養(yǎng)基（g/L）：3 g 尿素，4 g 蛋白胨，10 g 酵母粉，0.5 g KH2PO4，0.5 g K2HPO4，0.02 g FeSO4，MnSO4，100 μL（0.5 g/L）生物素，200 μL（1 g/L）硫胺素， 8% 葡萄糖，pH 7.4。感受態(tài)培養(yǎng)基（g/L）：5 g 酵母 粉，10 g 胰蛋白胨，10 g NaCl，3% 甘氨酸，0.1% 吐溫80。LBHIS培養(yǎng)基（g/L）：5 g 酵母粉，10 g 胰蛋白胨，10 g NaCl，37.5 g 腦心浸出液肉湯，182 g山梨醇；LBS培養(yǎng)基（g/L）：5 g 酵母粉，10 g 胰蛋白胨，10 g NaCl，10% 蔗糖。

1.2 方法

1.2.1 谷氨酸棒桿菌莽草酸合成代謝途徑的代謝工程改造 根據(jù)莽草酸合成代謝途徑，選擇aroK，aroG 以及qsuB三個(gè)基因作為目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行遺傳改造，如圖1所示。借助常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建pK18-△aroK，pK18-ParoG，pK18-SaroG，pK18-△qsuB，pK18-△qsuB-SaroGE.coli和pK18-△qsuBParoGE.coli五個(gè)重組質(zhì)粒。谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性重組子的篩選參考前期研究文章［31］。

1.2.2 谷氨酸棒桿菌重組菌的培養(yǎng) 重組菌的培養(yǎng)及搖瓶發(fā)酵，步驟如下：（1）取重組菌劃線至 LB 平板，30℃ 活化 24 h。（2）用接種環(huán)挑取三環(huán)經(jīng)LB 平板活化的菌泥接種于10 mL LBG培養(yǎng)基中，30℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 12 h。（3）按照 10% 接種量（初始 OD600值一致），接種于種子培養(yǎng)基（葡萄糖補(bǔ)料和菌液接種后總體積為20 mL），置于搖床 30℃，250 r/min 培養(yǎng) 12 h到達(dá)對(duì)數(shù)期。（4）按照 10% 接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖補(bǔ)料和菌液接種后總體積為20 mL），30℃，250 r/min 培養(yǎng) 72 h。（5）每隔 12 h 取樣 100 μL，對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行定。

1.2.3 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定 細(xì)胞生長(zhǎng)情況測(cè)定：取每隔 12 h 的樣品稀釋至適當(dāng)倍數(shù)用酶標(biāo)儀測(cè) OD600nm。采用HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液中莽草酸的含量，具體操作過程如下：（1）取稀釋的發(fā)酵液，12 000 r/min，10 min離心。完成后將上清轉(zhuǎn)移，去除菌體。（2）用 0.22 μm 的水系濾頭對(duì)稀釋液進(jìn)行過濾，注入進(jìn)樣瓶中。（3）色譜條件為色譜柱：Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶0.4% 磷酸溶液（6∶94，V/V）；流速：0.5 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：213 nm；進(jìn)樣體積：20 μL；進(jìn)樣時(shí)間：10 min。（4）標(biāo)品的制備：精密稱取莽草酸對(duì)照品0.102 6 g，用100 mL去離子水溶解、定容至刻度，配制成濃度為1.026 mg/mL莽草酸對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密吸取上述儲(chǔ)備0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL置于10 mL的容量瓶中，用去離子水稀釋，配成濃度為10.26、20.52、30.78、41.04、51.30 μg/mL莽草酸對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果

2.1 敲除aroK基因使谷氨酸棒桿菌CICC 20189積累莽草酸

為了構(gòu)建產(chǎn)莽草酸菌種，首先就必須敲除aroK基因阻斷莽草酸的分解途徑，實(shí)現(xiàn)莽草酸的積累。因此，本研究首先采用同源重組的方法對(duì)aroK基因進(jìn)行敲除，通過常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建aroK基因敲除質(zhì)粒pK18-△aroK。再采用電轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒pK18-△aroK導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌CICC 20189對(duì)其進(jìn)行遺傳改造。經(jīng)過兩次同源重組、蔗糖致死篩選得到的重組菌種進(jìn)行PCR鑒定，未擴(kuò)增出條帶的菌種即為陽(yáng)性敲除子。根據(jù)圖2-A的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，有4個(gè)雙交換菌種和陰性對(duì)照未擴(kuò)增出檢測(cè)條帶，而原始菌種能擴(kuò)增出檢測(cè)條帶，說明這4株菌的aroK基因被成功的敲除了，即獲得4株aroK基因敲除菌種，命名為SKA01。

圖2 aroK基因缺失株的構(gòu)建及發(fā)酵性能評(píng)價(jià)Fig.2 Construction and fermentation evaluation of aroKdeleted strain

為了評(píng)估重組谷氨酸棒桿菌SKA01的發(fā)酵性能，本研究選取其中一株aroK基因敲除菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)莽草酸的性能評(píng)價(jià)。發(fā)酵結(jié)果如圖3-B和3-C所示，相較于原始菌種，重組菌在出峰時(shí)間6.68 min顯示較明顯的液相峰，并且這個(gè)峰與莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)熱出峰時(shí)間高度重合，說明重組菌SKA01積累的產(chǎn)物是莽草酸。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)重組菌SKA01的莽草酸產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其發(fā)酵48 h和72 h的莽草酸產(chǎn)量分別為1.05 和1.16 g/L，相對(duì)原始菌種分別提高了20倍和9.54倍。

2.2 利用插入強(qiáng)啟動(dòng)子的策略強(qiáng)化表達(dá)aroG提高莽草酸的產(chǎn)量

為了進(jìn)一步提升重組菌發(fā)酵產(chǎn)莽草酸的性能，本研究繼續(xù)對(duì)莽草酸合成途徑關(guān)鍵基因aroG進(jìn)行強(qiáng)化表達(dá)。為了避免引入質(zhì)粒，本研究選擇插入強(qiáng)啟動(dòng)子Psod和PNCgl0824的策略強(qiáng)化表達(dá)aroG基因。通過常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建啟動(dòng)子整合重組質(zhì)粒pK18-ParoG和pK18-SaroG，再將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒導(dǎo)入上一步獲得的產(chǎn)莽草酸重組菌種SKA01，對(duì)其進(jìn)行遺傳改造。經(jīng)過兩次同源重組獲得雙交換子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以啟動(dòng)子引物和同源下臂引物擴(kuò)增，能擴(kuò)增出條帶即是插入了啟動(dòng)子的陽(yáng)性重組菌，而擴(kuò)增不出條帶的即是回復(fù)突變株。檢測(cè)結(jié)果如圖3-A和3-B箭頭所示，通過蔗糖致死篩選和PCR驗(yàn)證成功獲得2株插入PNCgl0824啟動(dòng)子的C. glutamicum 20189（△aroK，ParoG）和5株插入Psod啟動(dòng)子的20189（△aroK，SaroG）重組菌種，分別將其命名為SKA02和SKA03。為了評(píng)估重組菌發(fā)酵產(chǎn)莽草酸的性能，各選取SKA02和SKA03的其中一個(gè)重組菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵性能評(píng)價(jià)。發(fā)酵結(jié)果如圖3-C和3-D所示，重組菌SKA02和SKA03發(fā)酵72 h的莽草酸產(chǎn)量分別達(dá)到6.71 g/L和4.48 g/L，與對(duì)照菌種SKA01相比，分別提高了177.2%和85.1%。并且，重組菌SKA02和SKA03的生長(zhǎng)速度與出發(fā)菌種SKA01相當(dāng)，說明通過插入強(qiáng)啟動(dòng)子Psod和PNCgl0824的策略強(qiáng)化表達(dá)aroG基因?qū)w生長(zhǎng)沒有影響。

圖3 重組谷氨酸棒桿菌SKA02和SKA03的PCR鑒定及搖瓶發(fā)酵性能評(píng)價(jià)Fig.3 PCR identification and shake flask fermentation evaluation of recombinant strain C. glutamicum SKA02 and SKA03

2.3 阻斷競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑促進(jìn)莽草酸的積累

3-脫氫莽草酸脫水酶（DHS dehydratase，encoded by qsuB）是原兒茶酸合成代謝途徑的第一個(gè)酶，也是關(guān)鍵限速酶。敲除qsuB基因可以阻斷原兒茶酸合成代謝途徑，使碳代謝流更多地流向莽草酸的合成代謝。為了提高重組谷氨酸棒桿菌的莽草酸發(fā)酵性能，本研究同樣通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了qsuB基因敲除質(zhì)粒pk18-△qsuB，利用同源重組的方法對(duì)qsuB基因進(jìn)行了敲除。經(jīng)歷兩次同源重組獲得雙交換子進(jìn)行PCR鑒定，驗(yàn)證結(jié)果如圖4-A所示，箭頭指示獲得3個(gè)未能擴(kuò)增出檢測(cè)條帶的陽(yáng)性重組子，其基因組上qsuB基因被成功敲除，命名為SKA04。為了評(píng)估敲除qsuB基因?qū)铣擅Р菟岬挠绊懀狙芯咳∑渲幸恢曛亟M菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵性能評(píng)價(jià)。發(fā)酵結(jié)果如圖4-B和4-C所示，重組菌SKA04發(fā)酵72 h的莽草酸產(chǎn)量達(dá)到6.47 g/L，與出發(fā)菌種相比提高了19.6%，而菌體生長(zhǎng)量與原始菌種相當(dāng)。

圖4 重組谷氨酸棒桿菌SKA04的構(gòu)建及發(fā)酵性能評(píng)價(jià)Fig.4 Construction and fermentation evaluation of recombinant C. glutamicum strain SKA04

2.4 引入抗反饋抑制AroG提高莽草酸產(chǎn)量

為了進(jìn)一步提升莽草酸的生物合成量，本研究利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pK18-△qsuB-ParoGE.coli和pK18-△qsuB-SaroGE.coli，再利用同源重組的方法在谷氨酸棒桿菌染色體上整合表達(dá)AroG。結(jié)果如圖5-A和5-B所示，通過PCR篩選獲得7株P(guān)aroGE.coli基因整合重組菌和2株 SaroGE.coli基因整合重組菌，分別命名為SKA05和SKA06。為了評(píng)估獲得重組菌的發(fā)酵性能，本研究各選取其中一株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)果如圖7所示，重組菌SKA05和SKA06發(fā)酵72 h的莽草酸產(chǎn)量分別達(dá)到7.61 g/L以及6.98 g/L。與對(duì)照菌種相比，莽草酸的產(chǎn)量分別提高了40.7%以及29.0%。

圖5 重組谷氨酸棒桿菌SKA04、SKA05和SKA06的構(gòu)建及搖瓶發(fā)酵性能評(píng)價(jià)Fig. 5 Construction and shake flask fermentation evaluation of recombinant C. glutamicum strain SKA04，SKA05，and SKA06

3 討論

谷氨酸棒桿菌體內(nèi)，莽草酸激酶（Shikimate kinase，encoded by aroK）主要功能是催化莽草酸的磷酸化生成3-磷酸莽草酸，然后進(jìn)一步代謝生成分支酸、苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族化合物。本文研究結(jié)果表明敲除aroK基因，阻斷莽草酸的分解代謝途徑可以使谷氨酸棒桿菌CICC20189的發(fā)酵液積累莽草酸，此結(jié)果與前人的研究一致［24］。并且，由于本研究選擇的出發(fā)菌種是一株產(chǎn)苯丙氨酸的谷氨酸棒桿菌，該菌體內(nèi)莽草酸合成途徑的代謝通量?jī)?yōu)于其他模式菌種，從而獲得的莽草酸產(chǎn)量高于其他菌種。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SKA01發(fā)酵48 h和72 h的莽草酸產(chǎn)量相差不大，發(fā)酵后期莽草酸的產(chǎn)量基本趨于穩(wěn)定，這很可能是由于菌種SKA01體內(nèi)存在關(guān)鍵限速酶的表達(dá)量不足、代謝流量不夠集中、莽草酸途徑存在反饋抑制調(diào)控等諸多限制莽草酸產(chǎn)量提升的因素有關(guān)。想要進(jìn)一步提升重組菌發(fā)酵產(chǎn)莽草酸的性能，就需要進(jìn)行更多的遺傳改造，解除這些限制因子的抑制作用。

莽草酸合成途徑的起始步驟是3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合成酶（DAHP synthase，encoded by aroG）催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤蘚糖-4-磷酸（E4P）生成3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸。該酶是C. glutamicum莽草酸途徑的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)量的高低直接決定著整個(gè)莽草酸合成途徑的代謝通量，采取適當(dāng)?shù)牟呗蕴岣遖roG的表達(dá)量是構(gòu)建莽草酸高產(chǎn)菌種的關(guān)鍵步驟。目前，提高aroG基因表達(dá)量主要依靠質(zhì)粒介導(dǎo)的加強(qiáng)表達(dá)。例如，Kogure等［24］通過質(zhì)粒介導(dǎo)表達(dá)大腸桿菌來源的aroG，可以使莽草酸的產(chǎn)量從原來的10.2 mmol/L提升至18.9 mmol/L。但是引入質(zhì)粒強(qiáng)化表達(dá)aroG在菌種遺傳穩(wěn)定性方面存在缺陷。近年來，通過啟動(dòng)子工程強(qiáng)化表達(dá)關(guān)鍵基因在C. glutamicum的代謝工程改造方面得到廣泛應(yīng)用［32-36］。本研究通過插入強(qiáng)啟動(dòng)子Psod和PNCgl0824的策略強(qiáng)化表達(dá)菌種SKA01的aroG基因，發(fā)現(xiàn)分別插入這兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子均可以顯著提高莽草酸的產(chǎn)量?？梢?，莽草酸代謝途徑的第一步反應(yīng)是控制其代謝通量的關(guān)鍵，通過啟動(dòng)子工程提高關(guān)鍵限速酶AroG的表達(dá)量對(duì)提升重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)莽草酸的性能是一種行之有效的策略。同時(shí)，選用不同的啟動(dòng)子對(duì)莽草酸產(chǎn)量的提高幅度有顯著的差異，篩選關(guān)鍵限速酶AroG最佳表達(dá)量對(duì)構(gòu)建產(chǎn)莽草酸重組菌種十分重要。

代謝工程育種的研究過程中，競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑的分流往往是限制目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量提升的重要因素。通常情況下，切斷競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑在一定程度上可以為目標(biāo)產(chǎn)物的合成提供更多的碳代謝通量。本文通過敲除qsuB基因切斷合成原兒茶酸的競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑，使更多的3-脫氫莽草酸流向莽草酸的合成代謝途徑。結(jié)果也表明qsuB基因敲除重組菌SKA04的莽草酸產(chǎn)量與對(duì)照相比得到了19.6%的顯著提升，說明敲除qsuB基因可以在不影響菌體正常生長(zhǎng)的情況下，較好地促進(jìn)谷氨酸棒桿菌體內(nèi)莽草酸的生物合成。在此基礎(chǔ)上，為了解除莽草酸對(duì)其合成途徑關(guān)鍵酶AroG的反饋抑制作用，本研究引入了源自E. coli、具有抗莽草酸反饋抑制特性的AroG［24］，構(gòu)建了aroGE.coli的陽(yáng)性基因整合菌種，并添加了Psod 和PNCgl0824兩種不同的啟動(dòng)子調(diào)控其表達(dá)量。根據(jù)搖瓶發(fā)酵的過程監(jiān)控結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵的前48 h中，SKA04、SKA05和SKA06三株重組菌的莽草酸產(chǎn)量相近，而在72 h時(shí)莽草酸的產(chǎn)量出現(xiàn)了明顯的差異。這主要是因?yàn)閮H敲除qsuB基因在發(fā)酵前期產(chǎn)量趨于平穩(wěn)，而引入E. coli來源、具有抗莽草酸反饋抑制特性的AroG在發(fā)酵后期可進(jìn)一步提高莽草酸的產(chǎn)量。同時(shí)產(chǎn)量的增幅又受到不同啟動(dòng)子的調(diào)控，插入PNCgl0824啟動(dòng)子的菌種相比于其他重組菌種發(fā)酵終點(diǎn)的莽草酸產(chǎn)量較高。這一結(jié)果充分證實(shí)了利用啟動(dòng)子工程和染色體工程相結(jié)合，阻斷競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑以及引入抗反饋抑制，是提高重組谷氨酸棒桿菌產(chǎn)莽草酸性能的一種有效策略。

4 結(jié)論

本研究通過阻斷莽草酸途徑、解除反饋抑制以及阻斷競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑的方法成功實(shí)現(xiàn)了莽草酸的過量積累。在C. glutamicum中運(yùn)用啟動(dòng)子工程強(qiáng)化表達(dá)莽草酸途徑的關(guān)鍵限速酶AroG，大幅提高了莽草酸的產(chǎn)量。同時(shí)，將啟動(dòng)子工程和染色體工程相結(jié)合改造C. glutamicum的莽草酸途徑，在阻斷競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑的同時(shí)又成功引入了E. coli來源、具有抗莽草酸反饋抑制特性的AroG，進(jìn)一步提高了莽草酸的產(chǎn)量。此外，本研究基于染色體工程對(duì)C. glutamicum的莽草酸途徑進(jìn)行遺傳改造，在顯著提高莽草酸產(chǎn)量的同時(shí)避免了抗生素和誘導(dǎo)劑的使用，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。