黃瓜AHP基因家族的鑒定及其非生物脅迫表達分析

周國彥 銀珊珊 高佳鑫 武春成 閆立英 謝洋

（河北科技師范學院園藝科技學院 河北省園藝種質資源挖掘與創新利用重點實驗室，秦皇島 066004）

細胞分裂素是重要的植物激素之一，通過調控植物組織或細胞的分化與生長，影響植物的生長與發育［1］。細胞分裂素還通過抑制植物中葉綠素、核酸、蛋白質等物質的分解，將必需的氨基酸、激素、無機鹽等化合物重新分配到植物的其他部位，從而阻礙植物衰老［2］。越來越多研究表明，細胞分裂素在調控植物生長發育和逆境響應等方面發揮重要的作用［3-4］。

組氨酸磷酸轉運蛋白（histidine phosphotransfer proteins，AHP）是細胞分裂素信號轉導途徑的正向調控蛋白［5］。在細胞質中，受體組氨酸蛋白激酶（histidine kinases，HK）與細胞分裂素結合后自磷酸化，AHP上保守的組氨酸位點自動識別來自HK的磷酸基團，并將磷酸基團從細胞質轉移至細胞核上的系列反應調節因子（response regulators，RR），激活下游相關基因完成細胞分裂素信號轉導過程，從而調控植物的生長發育［6］。據報道，擬南芥中有6個AHP基因家族成員，其中AHP2、AHP3和AHP5響應鹽、干旱脅迫，其三重突變體ahp2，3，5對鹽和干旱的耐受性顯著增強［7］；水稻中有5個AHP基因家族成員，其中OsAHP1和OsAHP2的RNAi轉基因株表現出對鹽敏感且對干旱耐性增強的特性［8］；小麥中有4個AHP基因家族成員，其中TaAHP4響應鹽、干旱和脫落酸脅迫且為抑制表達［9］。

黃瓜是重要的世界性蔬菜之一［10-11］。聯合國糧食及農業組織（FAO）2020年統計，我國黃瓜栽培面積與產量躍居全球第一，占比分別為全球56.4%和81.2%。黃瓜是喜溫不耐高溫、抗旱能力弱、不耐弱光的蔬菜作物。當光照強度低于外界自然光照的1/2時，其同化量基本不增加，影響最終產量和效益［12］。因此，低溫弱光、高溫、干旱等非生物脅迫是限制黃瓜高效生產和品質育種的重要因子［13-15］。AHP作為細胞分裂素信號轉導通路的重要調控者，在逆境脅迫響應方面發揮著重要作用［16］。然而，關于黃瓜AHP基因家族鑒定及其在系列非生物脅迫下基因表達情況鮮見報道。

本研究對黃瓜AHP基因家族進行鑒定，系統分析其進化關系、基因結構、順式作用元件及其在非生物脅迫下表達模式，為進一步探究黃瓜AHP基因的功能和提高植物的非生物脅迫耐受性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2021年4-7月在河北科技師范學院園藝實驗樓人工氣候室內進行。將黃瓜‘津研四號’（購于山東魯蔬種業有限責任公司）播種于草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1混合基質的營養缽中，置于溫室中培養（晝/夜溫度為25℃/16℃，光照14 h/黑暗8 h）。將25 d苗齡的幼苗進行不同脅迫處理：干旱（3 d，50%田間持水量）、高溫（42℃，48 h）、低溫弱光（3 d，光照強度2 klx，晝/夜溫度為12℃/8℃，7 d）。采用完全隨機設計，每種處理3次重復，混合取樣，-80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 黃瓜AHP基因家族成員鑒定 利用Pfam在線軟件（http://pfam.xfam.org/）檢索擬南芥AHP蛋白，獲取AHP結構特征序列的種子文件PF01627，隨后通過HMMER 3.0軟件以該種子文件為索引在黃瓜數據庫（http://cucurbitgenomics.org/，V3版本）中檢索，獲得與該蛋白結構特征相匹配的序列，即為黃瓜AHP家族候選成員［17］。利用NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線網站Blastp驗證已獲得的黃瓜AHP家族候選成員，具有AHP結構域的候選蛋白即為黃瓜AHP家族成員，將編碼這些蛋白質的基因定為CsAHP基因。

1.2.2 黃瓜AHP基因家族的染色體定位與共線性分析 利用Map Inspect軟件分析AHP家族基因在染色體上的分布情況。在黃瓜基因組內進行BLASTP搜索（E＜1×10-5），利用MCScanX軟件進行共線性區塊預測（閾值≤1×10-5）［18］。

1.2.3 黃瓜AHP基因家族系統進化樹的構建 分別在黃瓜、擬南芥tair和葫蘆科數據庫（CuGenDB，http://cucurbitgenomics.org/）下載黃瓜、擬南芥、南瓜、西瓜、甜瓜、冬瓜、西葫蘆、葫蘆等蛋白數據庫，提取其AHP基因家族的蛋白序列，利用MEGA 6.0軟件，采用Neighbor-Joining方法，構建系統進化樹［19］。

1.2.4 黃瓜AHP基因順式作用元件預測 從黃瓜基因組數據庫中提取CsAHP基因5′UTR上游1 000 bp序列，提交至PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數據庫，用于基因啟動子區順式作用元件分析［20］。

1.2.5 黃瓜AHP家族成員基因結構和保守結構域分析 從黃瓜基因組數據庫中提取黃瓜AHP家族基因的DNA、CDS和氨基酸序列；利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）網站在線分析該家族共有的保守結構；利用TBtools展示基因結構和保守基序圖［21］。

1.2.6 黃瓜AHP基因的表達模式分析 樣品總RNA提取和cDNA合成分別采用RNAprep Pure Plant Kit和FastKing RT Kit（With gDNase）試劑盒（天根，中國）。利用Beacon Designer 7.0軟件進行基因引物設計，并委托中美泰和生物技術（北京）有限公司合成引物（表1）。利用實時熒光定量PCR儀（伯樂CFX96 Touch）進行實時定量聚合酶鏈反應與數據分析［22］。利用前人報道的黃瓜RNA-Seq數據信息，獲取黃瓜在鹽脅迫［23］、硅［24］、高溫/低溫/長日照/短日照［25］、開花前后［26］、正常子房與超級子房不同發育時期［27］等中AHP家族基因的表達量（每百萬reads中來自某基因每千堿基長度的reads數，RPKM）信息，再利用Cluster 3.0和Tree View軟件進行基因表達量分析。

表1 qRT-PCR引物設計Table 1 qRT-PCR primer design

2 結果

2.1 黃瓜AHP基因家族成員鑒定、染色體定位與共線性分析

在黃瓜基因組數據庫Cucumber（Chinese Long）v3 Genome中，共檢索到8條與AHP結構序列特征相匹配的蛋白序列（E-value＜0.01）。利用NCBI在線網站blastp驗證候選基因蛋白序列的保守性，鑒定結果顯示，有7條序列含有AHP結構序列特征，說明黃瓜AHP基因家族有7個成員。依據蛋白序列檢索的score值由高到低，依次將其命名為CsAHP1-CsAHP7。

染色體定位結果（圖1）顯示，這7個AHP成員不均勻分布于黃瓜6條染色體上，而第5染色體上不存在AHP基因。CsAHP1（CsaV3_6G005590.1）、CsAHP2（CsaV3_7G035290.1）、CsAHP3（CsaV3_1G039330.1）、CsAHP5（CsaV3_2G030700.1）和CsAHP6（CsaV3_4G001620.1）分別成功定位到黃 瓜Chr.6、Chr.7、Chr.1、Chr.2和Chr.4染 色 體上，基因CsAHP4（CsaV3_3G014010.1）和CsAHP7（CsaV3_3G023600.1）成功定位到黃瓜Chr.3染色體上。利用MCScanX軟件進行共線性預測（閾值≤1×10-5），發現這7個基因不存在片段重復或串聯重復等基因復制現象。

圖1 黃瓜AHP基因家族成員染色體定位分布圖Fig. 1 Chromosome location distribution map of AHP gene family members in C. sativus

2.2 黃瓜AHP基因家族系統進化分析

為揭示黃瓜AHP蛋白與模式作物擬南芥及葫蘆科其他物種的AHP蛋白親緣關系，利用MEGA7.0軟件對黃瓜（Cs）、擬南芥（At）、南瓜（Cmo）、西瓜（Cla）、甜瓜（MEL）、冬瓜（Bhi）、西葫蘆（Cp）、葫蘆（Lsi）的AHP蛋白序列構建系統進化樹。結果 （圖2）顯示，黃瓜、擬南芥和葫蘆科AHP家族蛋白可以分為4個大的亞群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ），其中Ⅱ類亞群（16個成員）中，黃瓜CsAHP2和CsAHP7分別與冬瓜Bhi09M000375和甜瓜MELO3C030799.2.1 親緣關系最近，Ⅲ類亞群（7個成員）中，黃瓜CsAHP5與甜瓜MELO3C030319.2.1親緣關系最近；Ⅳ類亞群（31個成員）中，黃瓜CsAHP1、CsAHP3、CsAHP4、CsAHP6分別與冬瓜Bhi12M001571、甜瓜MELO3C015359.2.1、擬南芥AT3G21510.1（AtAHP1）、冬瓜Bhi01M002749親緣關系最近；而Ⅰ類亞群（2個成員）中沒有黃瓜AHP家族成員。

圖2 黃瓜、擬南芥和葫蘆科AHP家族成員進化樹分析Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of AHP family members in C. sativus，Arabidopsis thaliana and Cucurbitaceae

2.3 黃瓜AHP基因順式作用元件分析

為預測黃瓜AHP基因的調控方式，利用PlantCARE軟件對該基因家族啟動子區的序列進行順式作用元件分析。結果（圖3）顯示，黃瓜AHP基因家族成員含有CAAT-box、TATA-box、光響應（13種，I-box、LAMP-element、TCT-motif、GATA-motif、TCCC-motif、MRE、GT1-motif、AAAC-motif、G-box、ACE、ATCT-motif、Box 4、AE-box）、低溫響應（1種，LTR）、干旱響應（1種，MBS）、激素響應（8種，TGA-element、TATC-box、TCA-element、ABRE、CGTCA-motif、TGACG-motif、P-box、TGA-box）、厭氧響應（2種，ARE、GC-motif）、玉米蛋白代謝響應（1種，O2-site）和防御與應激（1種，TC-rich repeats）等29種作用元件。

圖3 黃瓜AHP家族基因啟動子序列順式作用元件分析Fig. 3 Analysis of cis-acting element in promoter sequence of AHP family gene in C. sativus

黃瓜AHP基因家族7個成員均含有光響應作用元件，CsAHP1、CsAHP2和CsAHP3含有赤霉素響應作用元件，CsAHP2、CsAHP3和CsAHP6含有脫落酸響應作用元件，CsAHP2、CsAHP4和CsAHP5含有生長素響應作用元件，CsAHP2和CsAHP5含有茉莉酸甲酯響應作用元件，CsAHP5和CsAHP7含有干旱脅迫響應作用元件，CsAHP1和CsAHP7含有低溫脅迫響應作用元件。

2.4 黃瓜AHP家族成員基因結構和保守結構域 分析

基因結構分析（圖4）顯示，黃瓜CsAHP1、CsAHP2、CsAHP3、CsAHP4、CsAHP5和CsAHP7均含有6個外顯子，而CsAHP6僅含有5個外顯子。黃瓜AHP家族蛋白含8個保守motif，其中CsAHP1、CsAHP2、CsAHP7均 含Motif1-Motif6，CsAHP3含Motif1-Motif3和Motif5-Motif7，CsAHP4含Motif1-Motif5，CsAHP6含Motif1-Motif3、Motif5、Motif7-Motif8。

圖4 黃瓜AHP家族基因結構與保守結構域分析Fig. 4 Gene structure and conservative domain analysis of AHP family in C. sativus

2.5 黃瓜AHP基因在發育和非生物脅迫下的表達模式分析

利用前人發表的黃瓜表達譜數據庫，提取鹽脅迫、硅脅迫、高/低溫且長/短日照脅迫、不同開花時期、超級子房與正常子房等非生物脅迫和發育時期的AHP家族基因表達譜信息（RPKM值）。結果 （圖5）表明，鹽脅迫下CsAHP1、CsAHP3和CsAHP4顯著下調表達，尤其CsAHP4在對照和處理組中基因表達量的差異倍數達15倍；高溫長日照/短日照和低溫長日照/短日照條件下，基因表達模式相近，均為CsAHP1和CsAHP4高，其余表達量都低；硅脅迫下CsAHP3顯著上調表達，其余都下調表達且差異不顯著；CsAHP1在開花期較其他CsAHPs基因表達量最高，開花前6 d，CsAHP3表達量最高；CsAHP7在正常子房和超級子房開花前1 d表達量均為最高，CsAHP1在正常子房和超級子房開花期表達量最高。

圖5 黃瓜非生物脅迫與不同發育時期AHP家族基因表達模式分析Fig. 5 Expression pattern analysis of AHP family in abiotic stress and different developmental stages of C. sativus

進一步利用qRT-PCR技術分析黃瓜AHP家族基因在干旱、高溫和低溫弱光脅迫下相對表達量情況。結果（圖6）發現，CsAHP1和CsAHP3均在干 旱、高溫脅迫下較對照顯著上調表達，CsAHP1、CsAHP2和CsAHP5在低溫弱光脅迫下較對照顯著上調表達。以上數據說明黃瓜AHP家族基因響應干旱、高溫和低溫弱光等非生物脅迫且推測該家族基因成員間可能存在功能冗余現象。

圖6 在干旱、高溫和低溫弱光脅迫下黃瓜AHP家族基因qRT-PCR分析Fig. 6 qRT-PCR analysis of AHP family gene under drought，high temperature，and low temperature and low light stress in C. sativus

3 討論

近些年，隨著高通量測序技術迅猛發展，重要性狀的基因大數據的公開，利用生物信息學技術將相關數據信息進行有效整合，將為挖掘重要性狀相關基因及其功能研究提供理論基礎［28］。本研究運用生物信息學手段，分別從黃瓜、南瓜、西瓜、甜瓜、冬瓜、西葫蘆、葫蘆和擬南芥基因組數據庫鑒定到7（Cs）、8（Cmo）、7（Cla）、7（MEL）、7（Bhi）、7（Cp）和6（Lsi）個基因家族成員，且黃瓜AHP家 族成員與葫蘆科中冬瓜、甜瓜的親緣關系較近。葫蘆科作物與十字花科的擬南芥（6個）和蘿卜（6個）成員個數相當，說明AHP家族具有保守性［29］。

為了探究黃瓜AHP基因的調控網絡機制，本研究對黃瓜AHP家族基因啟動子序列進行順式作用元件分析。結果顯示，黃瓜AHP基因家族7個成員均含有光響應作用元件，且CsAHP1和CsAHP7含有低溫脅迫響應作用元件。qRT-PCR分析發現CsAHP1在低溫弱光脅迫下較對照顯著上調表達，說明CsAHP1響應低溫弱光脅迫。侯凌燕［30］研究發現擬南芥AHP1-5缺失可以提高植物的抗凍能力，與本研究結果相近，可能是因為低溫弱光下CsAHP1表達量增多造成植株出現脅迫癥狀。本研究中，在干旱、高溫脅迫下CsAHP1和CsAHP3較對照顯著上調表達，鹽脅迫下CsAHP1、CsAHP3和CsAHP4顯著下調表達，與擬南芥AHP2、AHP3、AHP5響應鹽、干旱脅迫相一致［7］，但與水稻OsAHP1、OsAHP2響應鹽和干旱脅迫的表達模式相反［9］，說明其參與響應黃瓜逆境脅迫的生物學過程。

進一步利用基因表達譜與qRT-PCR分析黃瓜AHP家族基因的表達情況，結果顯示CsAHP1和CsAHP4均響應鹽脅迫、高/低溫/長/短日照，CsAHP3響應鹽脅迫、硅脅迫，暗示著CsAHP1、CsAHP3和CsAHP4參與調控逆境脅迫響應機制。在蘿卜中研究發現RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5響應鹽脅迫且均為上調表達［31］，與本研究結果相反，其可能原因是不同物種對鹽脅迫的響應不同。本研究還鑒定到CsAHP7在正常子房和超級子房開花前1 d表達量均為最高，而CsAHP1在正常子房和超級子房開花期表達量最高，說明CsAHP1和CsAHP7可能參與黃瓜開花調控過程。綜上推測，CsAHP1可能通過參與細胞分裂素信號轉導途徑調控黃瓜提前開花響應植物逆境脅迫，使植物提前進入生殖生長階段。

4 結論

鑒定到的7個黃瓜AHP基因家族成員與葫蘆科物種及十字花科蘿卜、擬南芥的AHP家族具有很強的保守性；基因啟動子序列中含有光響應、低溫響應、干旱響應、激素響應和防御應激與脅迫響應等多種順式作用元件；黃瓜AHP基因家族與植物發育和非生物脅迫響應有著密切的關系。