海甘藍（Crambe abyssinica）葉綠體基因組特征及其系統發育研究

錢方 高作敏 胡利娟 王洪程

（貴州師范大學生命科學學院，貴陽 550001）

海 甘 藍（Crambe abyssinica Hochst. ex R.E.Fr.）是十字花科（Brassicaceae）海甘藍屬（Crambe）的一年生草本植物，主要分布在地中海、西伯利亞和中亞等地區［1］。海甘藍種子中的芥酸（erucic acid）含量高達55%-62.5%，而芥酸是重要的工業用油，可用于機械潤滑、脫膜劑和燃料橡膠添加劑，又可用作化妝品、香料、高級工程塑膠等化工原料［2］。此外，芥酸還可進一步衍生為芥酸醜胺、山崳酸等，這些衍生物在醫藥、農業、工業等行業均具有廣泛的應用前景，因此海甘藍被認為是一種新型的、可再生工業油用資源，受到越來越廣泛的重視［3-5］。此外，海甘藍還具有抗旱、抗病等特點［2］，科研人員曾嘗試將海甘藍的優異性狀轉移到蕓薹屬（Brassica）作物中，以提高蕓薹屬作物的品質和豐富蕓薹屬種質資源［6-7］。因此闡明海甘藍在十字花科植物中的系統發育位置及與十字花科重要經濟作物的親緣關系，將為海甘藍的遺傳改良及優良性狀轉育到蕓薹屬作物的可能性提供有力的分子支撐。

葉綠體（chloroplast，cp）是綠色植物進行光合作用的場所，擁有獨立的遺傳物質［8］。關于其起源，被廣泛接受的是“內共生起源學說（endosymbiotic theory）”［9］。在高等植物中，細胞核（nucleus，nr）、葉綠體和線粒體（mitochondria，mt）各自擁有自己的一套遺傳物質，即核基因組（nuclear genome，nrDNA）、葉 綠 體 基 因 組（chloroplast genome，cp genome）以及線粒體基因組（mitochondrial genome，mtDNA）［10］。葉綠體基因組一般是以共價雙鏈閉合環的形式存在，只有極少數部分為線型或多聚體形式。通常葉綠體基因組大小為120-160 kb，編碼110-130個基因［11-12］，由兩個單拷貝區（large single copy，LSC；small single copy，SSC）和兩個反向重復區（inverted repeat，IRa和IRb）組成的典型四分體結構。其中IRa和IRb區方向相反，序列相同。相比于核基因組與線粒體基因組，葉綠體基因組的結構和編碼區基因相對保守［13］，進化速率適中，介于核基因組和線粒體基因組之間［14］，因此葉綠體基因組被廣泛應用于物種間的系統進化關系研究［15-17］。

自1986年首次完成地錢（Marchantia polymorpha）和煙草（Nicotiana tabacum）的葉綠體基因組測序以來［18-19］，越來越多的植物葉綠體基因組數據被公布于公共基因組數據庫中。目前在GenBank數據庫中公布了數千物種的葉綠體基因組信息，但尚未有海甘藍葉綠體基因組系統的研究發表，且海甘藍在十字花科植物中的系統發育地位亦不明晰。本研究通過Illumina測序平臺對海甘藍的葉綠體基因組進行測序和組裝，并對海甘藍及其近緣物種的葉綠體基因組進行系統比較。此外，還根據海甘藍與已報道的50個十字花科物種葉綠體基因組進行了系統發育分析，確定了海甘藍在十字花科植物中的系統發育位置。

1 材料與方法

1.1 材料

海甘藍種子經水引發后種植于貴州師范大學生命科學學院光照培養室，光照條件為16 h/8 h的光照/黑暗周期，生長溫度為22℃/16℃的光照/黑暗周期。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、測序和組裝 待幼苗生長至五葉期時，收集幼嫩的葉片，通過植物DNA提取試劑盒（天根）提取總DNA。DNA經過純化后，構建400 bp的文庫，然后通過二代測序平臺（Illumina HiSeq X-Ten）進行高通量測序。數據過濾以后，以擬南芥（Arabidopsis thaliana；NC_000932.1）葉綠體基因組為參考基因組，通過BLASR軟件（默認參數）比對出與葉綠體基因組相關的reads，然后使用NOVOPlasty v3.7 軟件進行組裝（默認參數）［20］。通過 GeSeq軟件進行基因預測［21］，采用人工比對近緣物種（擬南芥）進行校正。最后，通過軟件OGDRAW［22］繪制海甘藍葉綠體基因組的物理圖譜。測序產生的原始數據（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/；Submission ID：SUB9605680；BioProject ID：PRJNA728550）和組裝完成的葉綠體基因組信息（GenBank accession number：MZ153236）均上傳至NCBI（National Center for Biotechnology In-formation）數據庫。

1.2.2 重復序列分析 通過在線軟件REPuter（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld）對海甘藍葉綠體基因組進行長重復序列分析［23］，重復序列包含同向重復（forward）、反向重復（reverse）、互補重復（complement）和回文重復（palindromic）。參數設置如下：最大重復長度（maximum computed repeats）設置為1 000，最小重復長度（minimal repeat size）設置為30，漢明距離（Hamming distance）設置為3（表示一對重復序列的相似度不能小于90%），其余均為默認參數。

通 過 在 線 軟 件MISA（https://webblast.ipkgatersleben.de/misa/）檢測海甘藍葉綠體基因組的簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）［24］，參數設置如下：單核苷酸（mononucleotide）、二核苷酸（dinucleotide）、三核苷酸（trinucleotide）、四核苷酸（tetranucleotide）、五核苷酸（pentanucleotide）、六核苷酸（hexanucleotide）的重復次數分別設置為10、5、4、3、3和3，其余均為默認參數。

1.2.3 密碼子偏好性分析 通過CodonW1.4.2（http://downloads.fyxm.net/CodonW-76666.html）軟 件對海甘藍葉綠體基因組進行密碼子偏好性分析，為了減小誤差，選擇長度不小于300 bp的編碼基因（53個），同時對海甘藍葉綠體蛋白編碼基因的相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）進行了計算，所有參數均為默認值。

1.2.4 葉綠體基因組的比較分析 為分析海甘藍葉綠體基因組與近緣物種之間的差異，通過在線軟件mVISTA（http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml）中的Shuffle-LAGAN模型［25］比較海甘藍與5個近緣物種：克拉里克海甘藍（Crambe kralikii）、甘藍型油菜（Brassica napus）、白菜（Brassica rapa）、蘿卜（Raphanus sativus）和擬南芥的葉綠體基因組序列差異；此外，還使用在線軟件IRscope（https://irscope.shinyapps.io/irapp/）比較海甘藍及上述5個近緣物種的IR邊界（LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC）信息。

通過MUMmer v3.0軟件檢測了海甘藍與其5個近緣物種中的SNPs（單核苷酸多態性）和InDels（插入/缺失），以海甘藍葉綠體基因組為參考，maxgap=500，mincluster=100，其余為默認參數。

1.2.5 分子進化與系統進化分析 為評估海甘藍葉綠體基因組中蛋白編碼基因（protein-coding genes，PCGs）的同義（synonymous，Ks）和非同義（nonsynonymous，Ka）替換率，我們通過MAFFT［26］比對了海甘藍與其5個近緣種（克拉里克海甘藍、甘藍型油菜、白菜、蘿卜和擬南芥）的75個共有編碼基因序列，采用KaKs_calculator 2.0［27］計算了75個共有編碼基因的Ka/Ks值。

同時，為闡明海甘藍與十字花科其他物種的系統發育關系，我們從GenBank數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/organelle/）中下載了十字花科的50個物種的葉綠體基因組全序列，以Aethio- nema cordifolium 和 Aethionema grandiflorum 為外類群，采用MAFFT軟件比對葉綠體基因組全序列，使用MEGA7.0［28］基于Tamura-Nei模型的最大似然法（maximum likelihood，ML）構建系統發育樹，bootstrap值設置為1 000，以此推斷各節點的支持率。

2 結果

2.1 海甘藍葉綠體基因組特征

本研究基于Illumina HiSeq X-Ten測序平臺，以擬南芥葉綠體基因組信息為參考進行組裝和注釋，得到了全長為153 754 bp 的海甘藍葉綠體基因組（圖1）。海甘藍葉綠體基因組呈典型的四分體結構，由一對長度為26 176 bp的IR區（IRa和IRb）以及將它們分開的長度分別為83 622 bp的LSC區和17 780 bp的SSC區組成。在該葉綠體基因組中，4種堿基數量的百分比含量為T（32.28%）＞A（31.35%）＞ C（18.51%）＞ G（17.86%），GC堿基含量占堿基總數的36.37%（表1），遠低于AT堿基含量（63.63%）。在LSC、SSC和IR區中，GC含量分別為34.14%、29.29%和42.36%，AT含量分別為65.86%、72.71%和60.64%。在IR區中，其GC含量的百分比明顯高于其它兩個單拷貝區。

海甘藍葉綠體基因組中一共注釋到111個基因，其中蛋白編碼基因78個，tRNA基因29個，rRNA基因4個，大多數基因都是單拷貝，只有19個基因為雙拷貝（表1，圖1）。在LSC和SSC區中，分別包含81和13個基因（包含雙拷貝）；在兩個IR區中，一共檢測到36個基因，rRNA基因全部位于IR區。在這111個基因中，大多數基因都與光合作用相關，部分基因與自身復制相關，只有極少部分的基因（ycf類）功能尚未明確（表2）。此外，共有18個基因含有內含子，其中15個基因（petB，petD，atpF，ndhA，ndhB，trnA-UGC，trnG-GCC，trnI-GAU，trnKUUU，trnL-UAA，trnV-UAC，rps16，rpl16，rpl2和rpoC1）含有1個內含子，3個基因（rps12，clpP和ycf3）含有2個內含子，其中rps12是一個5′端位于LSC區，3′端位于IR區的反式剪接基因。

圖1 海甘藍葉綠體全基因組圖譜 Fig.1 Circle gene map of the C. abyssinica cp genome

2.2 重復序列和SSR分析

在海甘藍葉綠體基因組中，我們共檢測到41個長度范圍在30-42 bp的長重復序列，其中包括13個正向重復、23個回文重復、3個倒置重復和2個互補重復（附表1）。這些重復序列分布較為廣泛，大部分位于基因間區（intergenic spacer，IGS）和內含子區域，有18個重復序列（8個正向重復和10個回文重復）位于ndhA、petD、psaB、psbJ、rrn4.5S、trnS-UGA、ycf2和ycf3基因上；最大的長重復序列（回文重復，42 bp）位于IGS區（psbE-petL），rrn4.5S、ycf2和ycf3基因上均檢測到4個重復序列；此外，3個倒置重復和2個互補重復存在于trnS-GCU和trnGUCC基因的IGS區域。

表1 海甘藍葉綠體基因組的詳細特征Table 1 Detailed characteristics of the chloroplast genome of C. abyssinica

在海甘藍的葉綠體基因組中，共鑒定到13種不同類型的59個SSR位點（附表2），包含 40個單核苷酸、10個二核苷酸、3個三核苷酸、4個四核苷酸和2個五核苷酸重復，大多數的SSRs位于IGS區域，也有部分SSR在基因上被檢測到。所有的單核苷酸重復均表現為A或T類型，其中最長的單核苷酸（T）長度為21 bp；所有的二核苷酸重復為AT或TA類型，其中最長的二核苷酸重復（AT）長度為18 bp；三核苷酸（AAG、GGT和TAT）和四核苷酸重復（AAAT、ACTT、CAAA和TAAA）的長度均為12 bp；五核苷酸重復（AACAT和ATATA）為15 bp；未檢測到六核苷酸重復。

表2 海甘藍葉綠體基因組基因功能總結Table 2 Summary of assembled gene functions of C. abyssinica chloroplast genome

2.3 密碼子偏性分析

通過對海甘藍葉綠體基因組中的53個蛋白編碼序列（＞300 bp）進行密碼子偏性分析，發現此53個蛋白編碼基因全長為63 795 bp，包含21 265個密碼子。在這些密碼子中，有2 232個（10.50%）密碼子編碼亮氨酸（leucine，Leu），而僅有244個（1.15%）密碼子編碼半胱氨酸（cysteine，Cys）（附表3），表明在海甘藍葉綠體基因組中使用最多和最少的氨基酸分別是亮氨酸和半胱氨酸。RSCU分析顯示，在海甘藍葉綠體基因組中，UUA和CUC分別是使用頻率最高和最低的密碼子，其中有30種密碼子的RSCU值大于1，這些密碼子使用頻繁，此外這RSCU＞1的密碼子中，除編碼亮氨酸的UUG之外，其余29種密碼子的第3位均為A/U結尾。

2.4 海甘藍葉綠體基因組比較分析

為了比較海甘藍與其近緣物種的葉綠體基因組差異，我們比較了海甘藍與本屬的克拉里克海甘藍、蕓薹屬的甘藍型油菜和白菜、蘿卜屬（Raphanus）的蘿卜以及模式作物擬南芥的葉綠體基因組基本信息（表3），海甘藍與其5個近緣種的葉綠體基因組高度相似，6個物種的葉綠體基因組全長范圍在152 860 bp（甘藍型油菜）-154 478 bp（擬南芥），均為典型的四分體結構，并且GC含量也十分接近（36.29%-36.37%），除海甘藍的葉綠體基因組和丟失了2個基因（ycf15和trnfM-CAU）外，其余物種在基因組成和數量上基本一致。

表3 6種十字花科物種葉綠體基因組特征比較Table 3 Comparison of six chloroplast genomes of Brassicaceae species

以海甘藍葉綠體基因組信息為參照，利用mVISTA 中的Shuffle-LAGAN模型比較了海甘藍與其5個近緣物種（克拉里克海甘藍、甘藍型油菜、白菜、蘿卜和擬南芥）的葉綠體基因組序列差異（圖2）。6個物種的葉綠體基因組在LSC區和SSC區序列變異較大，IR區相對較為保守。物種之間的葉綠體基因組具有高度的保守性（＞90%），且編碼區、tRNA 和 rRNA 區域的變異低于非編碼區。此外，IGS變異也比較大，如trnK-UUV和rps16基因之間、rpoB和trnC-GCA基因之間、petA和psbJ基因之間、rps12和trnV-GAC基因之間、ndhF和rpl32基因之間存在較大的序列差異。值得注意的是，雖然編碼區的變異一般都較小，但是ycf1基因在此6個物種之間的變異較大。

圖2 以海甘藍為參考與其他5個近緣物種的序列比對結果Fig.2 Sequence alignment of 5 chloroplast genomes of Brassicaceae，with the annotation of C. abyssinica as reference

2.5 IR區邊界位置差異比較

通過在線網站IRscope比較分析了海甘藍6個物種的LSC、SSC和IR區的邊界位置，在此6個物種葉綠體基因組4個區域中，IR區較為保守，序列大小在26 035-26 264之間。如圖3所示，海甘藍葉綠體基因組IR邊界處與其他5個物種基本類似，LSC/IRb、IRb/SSC和SSC/IRa三個邊界分別位于rps19、ndhF和ycf1基因內，僅IRa/LSC邊界位于IGS（rpl2-trnH）。在LSC/IRb邊界處，擬南芥、蘿卜、甘藍型油菜和白菜的邊界基因rps19均有166 bp位于LSC區，113 bp位于IRb區，克拉里克海甘藍存在1 bp的微小差異，而在海甘藍中rps19基因只有93 bp位于IRb區；在IRb/SSC邊界處的ndhF基因，除甘藍型油菜外（進入IRb區36 bp），其余5個物種均有37 bp進入IRb區；在SSC/IRa 邊界，6個物種均橫跨 ycf1基因，橫跨進入SSC區的長度大小從4 274 bp-4 331 bp不等，其中，擬南芥的 ycf1 基因在 SSC 區的片段長度最大，蘿卜和海甘藍最小；僅有IRa/LSC邊界處于rpl2和trnH基因的IGS，靠近trnH基因，擬南芥、蘿卜和白菜距離trnH基因僅有3 bp，克拉里克海甘藍有4 bp，而B. napus和海甘藍距離trnH基因分別為30 bp和23 bp。

圖3 六個十字花科物種葉綠體基因組邊界序列及接頭附近基因的比較分析Fig.3 Comparative analysis of the boundaries of chloroplast genomes and adjacent genes among six Brassicaceae

2.6 海甘藍與其近緣物種間的分化差異分析

海甘藍與其5個近緣物種的葉綠體基因組比較保守，其編碼基因數目、基因組大小和基因組結構等方面較為相似，為檢測海甘藍與其近緣種葉綠體基因組間的分化差異，我們以海甘藍葉綠體基因組信息為參考，比較了這6種物種葉綠體基因組的SNP及InDel的數目及分布差異（圖4，附表4-9）。結果顯示，海甘藍與擬南芥之間檢測到的SNPs和InDels最 多（5 269個SNPs，671個InDels）（圖4，附表4）；與同屬的克拉里克海甘藍之間檢測到的SNPs和InDels數量最少（206個SNPs，789個InDels）（圖4，附表7）；與蕓薹屬（甘藍型油菜和白菜）和蘿卜屬（蘿卜）之間檢測到的SNPs和InDels數量較為相似（圖4，附表5-6、8）。此外海甘藍與擬南芥、甘藍型油菜、白菜、克拉里克海甘藍和蘿卜之間檢測到的SNPs和InDels位于LSC區的數量分別為4 212（70.91%）、2 061（71.07%）、2 025（70.48%）、707（71.06%）和1 913（69.92%），而位于IR區的數量僅分別為588（9.00%）、243（8.38%）、244（8.5%）、90（9.05%）和240（8.77%）（附表9）。由此可見，海甘藍葉綠體基因組在種間的變異要遠小于屬間的變異，且變異主要發生在葉綠體基因組的LSC區，在IR區的變異較小。

圖4 海甘藍與其近緣物種葉綠體基因組間的SNPs和InDelsFig.4 SNPs and InDels between C. abyssinica and its closely related species chloroplast genomes

2.7 葉綠體基因組選擇壓力與系統發育分析

本研究對海甘藍葉綠體基因組及其5個近緣種的75個蛋白編碼基因進行了Ka/Ks計算（圖5）。總體上看，平均Ka/Ks值為0.164，說明海甘藍葉綠體基因組基因受到強烈的純化選擇壓力。相比于克拉里克海甘藍，ccsA基因的Ka/Ks值為1.708，與擬南芥相比，rps14基因的Ka/Ks值為1.222，而對比于其他物種對應的ccsA和rps14基因，Ka/Ks均小于。而ndhF基因與5個物種相比，其Ka/Ks的平均值為1.459。ycf2基因與蘿卜、白菜和甘藍型油菜相比，Ka/Ks均大于1，表明ndhF和ycf2基因受到了極強的正選擇。

圖5 海甘藍與十字花科5個近緣物種葉綠體基因組中75個蛋白編碼基因的Ka/Ks值Fig.5 Ka/Ks ratios of 75 PCGs of the C. abyssinica chloroplast genome versus 5 closely related species of Brassicaceae

本研究基于海甘藍及其50個十字花科物種的葉綠體基因組，以巖芥菜屬（Aethionema）的A. cordifolium和A. grandiflorum 為外內群，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構建系統發育樹。如圖6所示，遺傳變異度為0.005，共包含49個節點，其中有46（93.88%）個節點的bootstrap值都為100，1個節點為94，僅有2個節點低于94（分別為42和56）。海甘藍與海甘藍屬、蕓薹屬、蘿卜屬、Cakile arabica、白芥屬（Sinapis）和諸葛菜屬（Orychophragmus）的物種（共14個物種）聚在一個分支上，從這14個親緣關系較近的物種來看，諸葛菜屬系統發生位置位于較遠的地方；Cakile arabica單獨為一支；海甘藍與其同屬的克拉里克海甘藍聚在一起，與白芥屬的物種構成一個分支，形成兩個姊妹類群；蕓薹屬的黑芥（B. nigra）也與白芥屬聚在一起；蘿卜屬的蘿卜與蕓薹屬的白菜、甘藍、甘藍型油菜和芥菜型油菜以bootstrap值為100聚在一個分支上。

圖6 基于51個十字花科物種葉綠體全基因組序列的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on chloroplast genome sequences of 51 Brassicaceae species

3 討論

在光合植物中，葉綠體基因組以單性遺傳的方式傳遞遺傳物質，一般來說，大多數被子植物是母系遺傳（maternal inheritance），而大多數裸子植物卻為父系遺傳［12，29］。葉綠體基因組的大小范圍在120-160 kb，相對保守［30］。海甘藍葉綠體基因組全長153 754 bp，呈現出與大多數被子植物一樣的典型四分體結構［13，31］，與大多數已發表的十字花科物種葉綠體基因組相似［32-33］。此外，與海甘藍的近緣物種比較發現它們之間序列相似性很高，在LSC區和SSC區序列變異較大，編碼區比非編碼區保守。值得注意的是，雖然編碼區的變異一般都較小，但是ycf1基因在此6個物種之間的變異較大，在獼猴桃科（Actinidiaceae）和唇形科（Labiatae）中也存在序列差異較大的現象［34-35］。除海甘藍葉綠體基因組丟失了ycf15和trnfM-CAU基因外，其余物種在基因組成和數量上基本一致。在白芥和芝麻菜（Eruca sativa）中也觀察到了缺失ycf15基因的現象［36-37］，表明該基因在十字花科植物中存在廣泛的變異。

在十字花科植物葉綠體基因組中，IR區的GC含量遠高于LSC區和SSC區，這種GC含量的差異分布是被子植物的典型特征［38-39］，造成這種現象的主要原因是由于IR區含有4個高 GC 含量的 rRNA 基因［40］。植物IR區邊界處的基因種類相對保守，即在LSC/IRb處的基因大都為rpl22、rps19和rpl2基因，十字花科物種在此邊界橫跨了rps19基因，但在楊屬（Populus）的多個物種中橫跨了rpl22基因［41］，據此推測十字花科物種相較于楊屬植物IR區發生了明顯的收縮；IRb/SSC處的基因是ndhF和一個因拷貝不完整在此形成的假基因（ycf1）［10］，而在SSC/IRa邊界附近只有ycf1基因（該基因在此正常拷貝），且大多數物種此邊界均落在ycf1基因上；IRa/LSC邊界多數情況下都處于rpl2與trnH的IGS區內，而在貝母屬（Fritillaria）多個物種中，trnH基因全部位于IR區［42］，表明IR區的收縮與擴張廣泛存在于不同的科屬中，而IR區的收縮與擴張可能與葉綠體基因組的大小變化有一定的關聯，因此對不同物種間的差異進行評估可以揭示相關類群的進化演變過程。

海甘藍葉綠體基因組包含了重復序列的4種類型，大部分位于 IGS和內含子區域，對于分析葉綠體基因組堿基替換、基因組進化、基因重排以及系統發育的研究有重要的作用［43-44］。SSR廣泛存在于整個基因組中，常被用于遺傳多樣性分析、物種鑒別、連鎖作圖及分子標記輔助選擇育種等方面［45-46］。在海甘藍葉綠體基因組中檢測到59個SSRs位點，與白芥、芝麻菜和豆瓣菜（Nasturtium officinale）中檢測到的SSR類似［36-37，47］，單核苷酸均表現為A/T型，具有很強的A/T偏性，主要是原因是SSR通常由短聚腺嘌呤（polyA）或多胸腺嘧啶（polyT）重復序列組成［48］。可以基于葉綠體基因組中的重復序列和SSR位點開發用于海甘藍種類鑒別的特異性標記。

密碼子的使用偏性廣泛存在于葉綠體中，一些基因的密碼子偏性使用可以反應該物種對外界環境的選擇壓力，被廣泛認為在葉綠體基因組的重塑中起著關鍵作用［49-50］。海甘藍葉綠體基因組中密碼子使用最多的是編碼亮氨酸的密碼子（2 232，占10.50%），最少的是編碼半胱氨酸的密碼子（244，占1.15%）。RSCU分析是一種用于測量密碼子使用偏倚程度的相對直觀的方法，RSCU＞1，代表該密碼子使用更頻繁［51-52］。RSCU分析顯示，UUA和CUC分別是使用頻率最高和最低的密碼子，其中有30種密碼子的RSCU值大于1，除編碼亮氨酸的UUG之外，其余29種密碼子的第3位均為A/U結尾，表明這些密碼子的使用更加頻繁且具有很強的A/U偏性，這一現象廣泛存在于大多數被子植物中。同義和非同義核苷酸替換模式是基因進化的重要指標，常用Ka/Ks的比值評估蛋白編碼基因是否存在選擇壓力或評估基因分化率［53］。Ka/Ks＜1，表示該基因經歷了純化選擇，Ka/Ks=1，表示該基因受到中性選擇，Ka/Ks＞1，表示該基因受到正選擇。在大多數基因中，Ks核苷酸替換比Ka核苷酸替換發生得更頻繁，因此Ka/Ks值通常小于1［54］。總體上看，海甘藍葉綠體基因組平均Ka/Ks值為0.164，說明海甘藍葉綠體基因組基因受到強烈的純化選擇壓力。ndhF基因在葉綠體的發育過程中其重要作用［55］，ycf2是被子植物中報道的最大的質體基因［56］，ndhF和ycf2基因的Ka/Ks均大于1，表明ndhF和ycf2基因受到了極強的正選擇。

葉綠體基因組的遺傳方式是母系遺傳，堿基替代率與基因組結構重排事件低，因此常被用于探究物種系統發育關系的重要工具［36-37，47，57-58］。一些研究以較高bootstrap值的系統進化樹闡明了十字花科部分植物的親緣關系，如Du等［37］在對白芥親緣關系解析時構建的系統進化樹中57（73.08%）個節點的bootstrap值都為100，以此揭示了白芥與蕓薹屬和蘿卜屬植物之間密切的親緣關系；此后Zhu等［36］在解析芝麻菜親緣關系時，同樣構建的系統發育樹中42（77.78%）個節點的bootstrap值都為100，闡明了芝麻菜與蕓薹屬之間的親緣關系較近。本研究基于海甘藍及其近緣物種的葉綠體基因組全序列構建的系統發育樹中，46（93.88%）個節點的bootstrap值都為100，這些結果都證實了基于葉綠體基因組信息揭示物種分類地位的可靠性。Warwick等［59］基于葉綠體限制酶位點多態性、核糖體內轉錄間隔區和葉綠體trnL內含子序列對十字花科進行系統發育分析，發現海甘藍與黑芥之間有著密切的親緣關系，本研究中以較高節點bootstrap值支持了海甘藍與蕓薹屬和蘿卜屬之間的密切關系。在該進化樹中海甘藍與海甘藍屬、蕓薹屬、蘿卜屬、Cakile arabica、白芥屬和諸葛菜屬的物種（共14個物種）聚在一個分支上，從這14個親緣關系較近的物種來看，諸葛菜屬系統發生位置位于較遠的地方，相比于其他5個屬的物種是親緣關系較遠的類群；海甘藍屬與白芥屬的物種構成一個分支，形成兩個姊妹類群；有趣的是，蕓薹屬的黑芥也被聚在了白芥屬內，這在之前的許多系統發生研究上發現了相同的現象［36-37，47］；蘿卜屬的蘿卜與蕓薹屬的白菜、甘藍、甘藍型油菜和芥菜型油菜聚在一個分支上，表現出與蕓薹屬的親密關系。基于此，關于蘿卜與蕓薹屬的遠緣雜交研究得以展開［60］。這些結果表明海甘藍屬、蕓薹屬、蘿卜屬、Cakile、白芥屬和諸葛菜屬有著類似的祖先，或者在物種形成過程中，這些物種之間的母系遺傳信息發生了交流。

4 結論

通過Illumina HiSeq 測序平臺從頭組裝了海甘藍的完整葉綠體基因組，全長為153 754 bp，呈典型的四分體結構，一共注釋到111個基因（78個蛋白編碼基因、29個tRNA基因和4個rRNA基因）；密碼子偏好性分析表明海甘藍偏愛使用A/U結尾的密碼子；共檢測到41個重復序列和59個SSR位點，以單堿基重復A/T為主；除ndhB和ycf2基因外，其余蛋白編碼基因普遍存在純化選擇壓力；此外，系統發育分析發現，海甘藍與蕓薹屬作物親緣關系密切，與白芥屬植物形成姊妹類群。本研究結果為今后海甘藍優異性狀的轉移、親緣關系解析以及遺傳多樣性分析提供了分子依據。

文章所有附圖附表數據請到本刊網站下載（http://biotech.aiijournal.com）。