馬尾松MAPK級聯途徑應答信號物質基因的表達分析

陳虎 楊章旗 孫爽 李鵬 徐慧蘭

（1. 廣西壯族自治區林業科學研究院 國家林業和草原局馬尾松工程技術研究中心 廣西馬尾松工程技術研究中心 廣西優良用材林資源培育重點實驗室，南寧530002；2. 廣西師范大學，桂林541001）

植物為抵御自然界的非生物脅迫，進化出響應脅迫信號的復雜調節機制。植物從感知到作出響應，進化出生理、生化、代謝互相作用的復雜調控機制以適應和抵御非生物脅迫，蛋白磷酸化和去磷酸化途徑發揮了關鍵作用［1］。植物中主要蛋白激酶包括蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），依賴Ca2+不依賴CaM蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases，CDPK），同時依賴Ca2+和CaM蛋白激 酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinases，CaMK）和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）。其中，MAPK的磷酸化通過絲氨酸/蘇氨酸殘基激活參與了細胞內信號傳遞，在生物體內普遍存在［1-3］。MAPK級聯途徑按照順序組成典型的MAPKKK（MAP-3K）-MAPKK（MAP2K）-MAPK 級聯信號途徑發揮功能，部分MAPK 級聯系統上游還存在MAPKKKK （MAP4K）［4］。

MAPKs蛋白是一種酸性蛋白，大量實驗證實ABA（abscisic acid）、SA（salicylic acid）、ET（ethy- lene）、IAA（auxin）等植物激素能夠引起MAPKs 活性提高，MAPKs 通過調節蛋白磷酸化產生現有的生理反應，不同激素信號在不同的級聯反應中起作用，通過蛋白激酶或蛋白磷酸化調節信號分子活性，并級聯放大后與轉錄因子作用響應脅迫［4-6］。目前，擬南芥中發現20 個MAPK 基因、10 個MAP3K 基因、60 個MAP2K 基因，水稻中有13 個MAP2K 基因和17 個MAPK 基因，這些基因在脅迫、JA（jasmonic acid）誘導發育、防御反應中發揮著不同的功能［7-8］。如MKK3 參與調控植物MKKs 由細胞質到細胞核的轉運，且依賴JA 信號途徑進行防御響應［9］，MPK3/6 和MdRaf5 過量表達可提高擬南芥抗凍和抗旱 能力［6］。

馬尾松（Pinus massoniana）是我國南部重要用材樹種，也是松脂主要來源樹種，是林業支柱產業之一［10］。極端天氣和病蟲害使馬尾松林受到嚴重影響，雖然目前有關馬尾松響應非生物脅迫生理和分子有一定研究［11］，但MAPK 級聯途徑基因調控信號分子響應馬尾松非生物脅迫機理還不清楚。本研究以前期大量轉錄組數據為基礎，篩選相關MAPK 級聯途徑基因，并對其進行生物信息學分析、功能預測和信號物質處理下基因表達模式研究，為解析馬尾松響應非生物脅迫調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 選用長勢良好、高度一致、未受蟲害、無機械損傷健康馬尾松半年生全同胞幼苗作為實驗材料。苗木培育及處理在廣西馬尾松良種培育中心（廣西南寧，108°35′E，22°92′N）進行。

1.1.2 材料處理 根據課題組前期開展外源信號物質對馬尾松幼苗松針揮發物的影響獲得的試驗結果（試驗結果另外發表），采用75 mg/L ABA，75 mg/L ABA +100 mg/L CaCl2、50 mg/L SA、50 mg/L SA+100 mg/L CaCl2、100 mg/L MeJA（methyl jasmonate）、100 mg/L MeJA +100 mg/L CaCl2、150 mg/L GA（gibberellin）、150 mg/L GA+100 mg/L CaCl2、100 mg/L CaCl2溶液，溶于50 mmol/L磷酸緩沖液，pH 8.0，以蒸餾水處理為對照處理。使用前加入1% tween-20，將溶液均勻噴施在馬尾松幼苗，每天噴施1 次，每處理噴施200 mL，每處理苗木6株，連續處理5 d，分別在停止噴施第1、3、5天將6株同一部位成熟針葉進行等量混合采集，立即放入液氮保存備用。ABA、SA、MeJA、GA由Sigma-Aldrich 生產，純度＞95%。

1.2 方法

1.2.1 基因序列獲得 本研究篩選確定的7個MAPK級聯途徑基因cDNA序列來源于課題組前期馬尾松抗蟲［12］、側枝發育［13］及逆境脅迫（干旱、低溫、鉛脅迫）轉錄組數據，以差異基因中NCBI對基因的表述進行檢索，去除重復序列和非全長cDNA序列，最終獲得7個MAPK級聯途徑基因，包括MAPK基因4個，MAP2K、MAP3K、MAP4K基因各1個（表1）。

1.2.2 RNA提取、逆轉錄 RNA采用天根公司的多酚多糖植物RNA試劑盒提取，M-MLV逆轉錄酶進行逆轉錄，具體步驟按說明書進行，RNA提取和cDNA逆轉錄完成后分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外分光光度計檢測濃度，將所有cDNA濃度稀釋至50 μg/μL。

1.2.3 生物信息學分析 BioXM2.6預測基因氨基酸序列；Expasy（https://www.expasy.org/）分析基因亞細胞定位、等電點、蛋白分子量、二級結構等，在NCBI檢 索 同 源 序 列，Geneious（https://www.geneious. com/）軟件進行進化樹聚類，NCBI、Motif Scan 軟件進行功能結構域分析，string（https://stringdb.org/cgi） 和QuickGO（https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）進行蛋白互作和基因功能預測，KEGG（https://www.kegg.jp/）和T-Coffee進行代謝途徑分析和氨基酸序列比對。

1.2.4 基因表達分析 用primer 5軟件設計熒光定量引物，以PmCYP基因［14］作為內參（表1）。根據SYBR Premix Ex Taq II（Prefect real-time）試劑盒說明書進行熒光定量PCR體系構建和擴增程序（Light Cycle 480II PCR儀），進行3次技術重復，根據2-ΔΔCt法計算相對表達量，用Excel進行作圖，SPSS軟件進行方差分析。

表1 熒光定量所用基因引物Table 1 Primer used in the qRT-PCR

2 結果

2.1 基因生物信息學分析

在前期轉錄組數據基礎上，篩選并鑒定出PmMAP4K、PmMAP3K、PmMAP2K基 因 各1個，PmMAPK2、PmMAPK6、PmMAPK9、PmMAPK15等MAPK基因4個。分析表明，7個基因核酸序列開放閱讀框長度在1 014-2 748 bp，氨基酸序列在337-915 aa，分子量在37.62-100.62 kD，等電點在5.12-9.22，PmMAPK9、PmMAPK15、PmMAP2K等電點偏堿性；7個基因均無跨膜結構，亞細胞預測均在細胞核內；都存在Ser、Thr、Tyr磷酸化位點，以PmMAP4K磷酸化位點最多，其次是PmMAP3K，PmMAP2K最少（表2）。

表2 MAPKs蛋白生物信息學分析Table 2 Bioinformatics analysis of MAPKs protein in P. massoniana

基因結構域分析表明，MAPK的4個基因均含有其特有的MAPK結構域，PmMAP4K、PmMAP3K、PmMAP2K基因則含有其特有的PmMAP4K（299-544 aa）、PmMAP3K（40-303 aa）、PmMAP2K（56-323 aa）結構域，7個基因均含有SPS1和PknB兩個結構域，PmMAPK15和PmMAP2K基因還單獨含有BREX-PgiW結構域（表3）。

表3 MAPKs蛋白功能結構域分析 Table 3 Analysis functional domain of MAPKs protein in P. massoniana

2.2 聚類分析

將MAPK途徑7個基因與火炬松（Pinus taeˉ da）、北美云杉（Picea sitchensis）等林木和植物進行氨基酸序列對比并構建進化樹。結果（圖1）表明，所有基因未按樹種進行分組，是按基因類型進行分類，馬尾松與火炬松和北美云杉距離最近。MAPKs基因聚在1組，PmMAP2K和PmMAP4K聚在1組，PmMAPK3K基因單獨1組。7個基因典型催化氨基酸序列進行分析發現，4類基因均含有D（I/L/V）K的活性基序，4個MAPKs基因均含有T（E/D）YVxTRWRAPE（L/V）基 序，PmMAPK2和PmMAPK6含有TEY基序，屬于MAPK家族A類，而PmMAPK9和PmMAPK15含有TDY基序，屬于MAPK家族D類。PmMAP2K含有典型VGTxxYMSPER基序，以及S/T-X5-S/T保守序列。PmMAP3K含 有G（T/S）Px（W/Y/F）MAPEV和GTxx（W/Y）MAPE基序，不含GTPEFMAPE（L/V）和Raf-like結構域，屬于MEKK-like亞類。PmMAP4K含有保守TFVGTPxWMAPEV基序（圖2）。

圖1 馬尾松與其他物種MAPK途徑基因進化樹分析Fig.1 Phylogenetic relationship of P. massoniana and other plants MAPK genes

圖2 馬尾松MAPKs基因氨基酸序列比對Fig. 2 Alignment of amino acid sequences of MAPKs in P. massoniana

2.3 功能預測

馬尾松與擬南芥MAPK同源蛋白進行互作網絡分析，7個基因均成功與擬南芥匹配，PmMAP4K、PmMAP3K、PmMAP2K、PmMAPK2、PmMAPK6、PmMAPK9、PmMAPK15分 別 對 應 擬 南 芥SIK1、NP3、MKK9、MPK9、MPK6、MPK4、MPK16。一級 互作網絡MAPKs和MAP2K基因直接互作（圖3- A），二級互作中MAP3K在MAPK代謝途徑中也直接互作（圖3-B），三級互作中除MAPK代謝途徑內部互作外與WRKY家族基因開始互作（圖3-C）。

在 互 作 網 絡 中，MPK4（PmMAPK2）/ MPK6（PmMAPK6）是調節生物和非生物脅迫應答基因表達的信號通路，介導ABA 依賴的CAT1表達對干旱和鹽脅迫的響應。NP3（PmMAP3K）和MPK4（PmMAPK2）通過調節MAP65-1等微管相關蛋白磷酸化狀態參與皮質微管組織和穩定，參與根毛發育，獲得抵抗SAR和SA負調節介導的防御反應。MPK6（PmMAPK6）通過磷酸化WKRY，介導乙烯ACS2和ACS6響應脅迫。MPK4（PmMAPK2）與PTP1互作，抑制SA生物合成來調節生物防御反應，MKS1和MPK6（PmMAPK6）與WKRY相互作用。MKK9（PmMAP2K）與MPK6（PmMAPK6）互作調控乙烯生物合成響應鹽脅迫。MPK9（PmMAPK6）參與ABA 信號途徑。SIK1（PmMAPK4K）未與其他基因直接互作，從PmMAP4K單獨互作圖顯示（圖3-D），與5個酪蛋白激酶（casein kinase1-like protein），以酸性蛋白作為底物進行磷酸化，SQN為旋轉異構酶基因與HSPs類蛋白調控，RAPTOR1調控滲透脅迫。

圖3 馬尾松與擬南芥相關MAPKs基因互作網絡分析Fig. 3 Interaction network analysis of MAPKs proteins identified in P. massoniana and Arabidopsis

通過GO和KEGG預測基因功能，PmMAPK、PmMAP3K、PmMAP4K可以激活絲氨酸和色氨酸，PmMAP2K還可以激活絡氨酸，第二步活性和磷酸化行使功能，最后行使分子功能。MAPK信號途徑中，整個過程是磷酸化過程，在經典MAP激酶途徑鈣離子化到PPP3C，再磷酸化到NFAT-2基因行使功能。

2.4 基因表達分析

通過熒光定量PCR技術，對馬尾松7個基因在MeJA、GA、SA、ABA以及相應加Ca2+處理下的表達模式進行研究。結果（圖4）表明，MeJA、Ca2+處 理，PmMAP4K對Ca2+處理響應最為明顯，處理第1天和第5天表達量最高，MeJA處理對PmMAP4K表達量沒有影響，說明PmMAP4K不受MeJA調控，而MeJA+Ca2+處理導致PmMAP4K表達量低于對照，說明MeJA+Ca2+負調控PmMAP4K。MAPK6表現出對Ca2+的響應，其它基因在Ca2+處理與對照相比，為下調表達。在MeJA處理第1天和第3天除PmMAPK9和PmMAP4K表達量下調，其它基因表達量均高于對照，而在MeJA+Ca2+處理第5 天除PmMAP4K外，均表現顯著上調表達（P＜0.05）。

圖4 馬尾松MAPK級聯途徑基因在MeJA處理下表達模式Fig. 4 Expressions of MAPKs genes in response to MeJA treatments in P. massoniana

在GA和Ca2+處理下，PmMAP4K對處理表達量最高，在處理第5天時GA處理PmMAP4K表達量達到最高值，而GA+Ca2+處理PmMAP4K表達量顯著低于其它處理?？傮w上Ca2+處理沒有引起基因上調表達，反而表達量下降，GA處理使基因表達量上調，尤其是在處理第5天，GA+Ca2+處理與GA處理表達量下降，但總體高于對照（圖5）。

圖5 馬尾松MAPK級聯途徑基因在GA處理下表達模式Fig. 5 Expressions of MAPKs genes in response to GA treatments in P. massoniana

在ABA和Ca2+處理下，Ca2+處理誘導了PmMAP4K和PmMAPK6基因上調表達，其它基因則下調表達。ABA處理7個基因均上調表達，除PmMAPK6基因外，其它基因表達量達到最大值，而Pm-MAPK6基因則是在ABA+Ca2+處理下，表達量最高（圖6）。

圖6 馬尾松MAPK級聯途徑基因在ABA處理下表達模式Fig. 6 Expressions of MAPK genes in response to ABA treatments in P. massoniana

在SA和Ca2+處理下，Ca2+處理同樣誘導了PmMAP4K和PmMAPK6基因上調表達，其它基因則下調表達。在整個處理過程中，SA和SA+Ca2+處理7個基因均表現上調表達，但SA+Ca2+處理基因表達量總體低于SA處理，而高于對照和Ca2+處理（圖7）。

圖7 馬尾松MAPK級聯途徑基因在SA處理下表達模式Fig. 7 Expressions of MAPKs genes in response to SA treatments in P. massoniana

3 討論

通過生物信息學、同源序列、進化聚類分析對7個馬尾松MAPK基因進行分析。進一步確定了7個基因所屬成員，4個MAPK基因均含有MAPK基因特有的TxY基序，該基序是決定MAPK活性的關鍵［15］，并根據TEY和TDY分為2類。D（I/L/V）K活性部位基序在4類基因中都有體現，也是MAPK基因所特有的。

典型MAPK級聯途徑由3個保守結構域組成，但最新研究發現部分MAP3K被MAP4K磷酸化所激活，MAP4K具有N末端催化結構域，并具有TFVGTPxWMAPEV［16］。目前已在多個植物中發現MAP2K，在植物激素信號和響應脅迫信號轉導中發揮作用［17］。PmMAP4K基因具有MAP4K特有功能結構域，并未與MAP3K基因直接互作，而是與酪蛋白激酶等互作，而酪蛋白激酶以酸性蛋白為底物，PmMAP4K基因為酸性蛋白，還與參與滲透脅迫的基因互作。PmMAP4K基因對Ca2+處理響應明顯，MeJA、GA、SA、ABA 以及與Ca2+共同作用都誘導了PmMAP4K基因的快速表達，推測PmMAP4K是通過激素信號和Ca2+調控響應馬尾松非生物脅迫。

Ca2+作為植物重要的胞內第二信使，是植物對多種逆境響應抗性信號傳遞途徑信號調控的主要因子，參與植物體內多種刺激-反應的生理過程，Ca2+通過與CDPKs等鈣蛋白結合形成鈣信號系統參與植物抗逆過程，并且與植物激素信號密切相關［18］。升高的CDPK信號影響應激誘導的MAPK激活，說明CDPK和MAPK通路不能獨立發揮作用，這兩種通路協同激活控制著對生物和非生物脅迫反應特異性［5］。除PmMAP4K對Ca2+正響應，其它基因在Ca2+單獨處理下未見上升表達，而與激素共同處理表達量均得到提高，可能同時受Ca2+和CaM的CDPK和MAPK調控激素完成響應，并且乙烯依賴的非生物脅迫過程CDPK和MAPK存在相互作用［5］，MAP2K作為成員數最少的 MAPK 級聯家族，能激活多個MAPK，且各種信號轉導途徑之間交聯可能集中在MKK水平上［1］，與本研究基因互作預測結果相一致。

大部分激素可通過與胞內其他信號分子互作調節下游防御基因表達，進而引發傷害部位的防御反應［18］，或運送到“全身”引發系統抗性［19］。MAPK級聯信號轉導途徑通過參與植物激素信號合成等途徑響應多種非生物脅迫［6］。MAPKs啟動子含有ABA、SA、MeJA等響應元件，MAPK級聯途徑基因與激素信號元件共同調控表達，在抗逆中發揮作用［20］。MAPK基因與高鹽及冷脅迫有關，并通過調節SA和JA提高植株抗逆性［21］。MAPK基因是茉莉酸信號轉導途徑的正調控因子［22］。馬尾松MAPK基因在多種激素處理后上調表達，而有些植物表達下降［23］，說明不同植物在同一信號途徑中存在不同作用或調控模式。

目前，研究表明MKK6-MPK6在細胞核相互作用，與防御信號轉導相關聯，PmMAPK6與MPK6同源，并與PmMAP2K互作，說明PmMAP2K在上游調控PmMAPK6的活性參與脅迫反應［24］。ABA處理激活OsMAPK5正向調控干旱、鹽脅迫提高抗性［4，25］。擬南芥AtMPK4、AtMPK6被低溫、鹽等多種脅迫誘導激活［2］。MAPK3/6/10、MAPK3/6在多種植物中被證實與環境和激素應答相關，如響應鹽脅迫、損傷、JA、SA等［24，26］。MAPK4作用于磷酸化MSK1底物，使底物與特定的WRKY轉錄因子偶聯參與SA、ABA、JA等途徑［26-27］，擬南芥WRKY33與MAPK互作參與抗逆脅迫。

MAPK1被報道參與生長素誘導［28］、響應JA［29］、ABA、SA［30］、鹽脅迫等［31］，說明MAPKs作為 MAPKs級聯最下游組分，在植物生物及非生物脅迫中具有重要意義［32］。GA調控MAP激酶，ABA和GA參與MAP激酶的轉錄過程相反［33］，SA誘導的蛋白激酶SIPK屬MAPK家族，并誘導了ET合成［16］，已有研究證實MEKK-like（PmMAP3K）負調控應激反應，MKK3（PmMAP2K）參與植物MKKs由細胞質到細胞核轉運過程，MKK3被報道受病原體誘導，并且依賴于JA信號途徑進行防御響應［9］，馬尾松PmMAP3K在所有處理下表達量均低于對照，PmMAP2K響應了所有信號分子誘導，與現有研究一致。

4 結論

本研究成功獲得馬尾松MAPK 級聯途徑7個基因，不同類型基因均具有該家族典型的結構域，7個基因均響應MeJA、GA、SA、ABA、Ca2+處理表達。PmMAP4K基因對Ca2+處理響應明顯，其次是PmMAP2K基因，MeJA+Ca2+處理MAPK基因表達量高于單獨MeJA處理，而GA、SA、ABA處理基因表達與之相反。馬尾松MAPK基因以不同調控方式與信號物質途徑互作應答非生物脅迫。