超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14中藥抑制劑的篩選及蕓香苷抑酶作用研究

趙子玉 王春光 呂建存 李繼開 張鐵

（河北農業大學動物醫學院 中獸醫學院，保定 071001）

抗菌藥物是當今獸醫臨床用于預防和治療動物細菌感染性疾病的主要手段，保障了現代化養殖業的持續發展。但是由于人類對抗生素的濫用，使得細菌耐藥現象日益嚴重，對人類和動物健康造成了嚴重危害，因此受到了廣泛關注［1-3］。細菌耐藥性的產生機制主要包括細菌細胞膜通透性的改變、細菌生物膜的形成、抗生素作用靶位的改變、主動外排機制和滅活酶或鈍化酶的產生等［4］。在這些耐藥機制中，滅活酶β-內酰胺酶的產生最為常見，占比高達80%［5］。

β-內酰胺酶最早發現于1940年，至今已超過500多種［6］。β-內酰胺酶是耐藥細菌針對β-內酰胺類抗生素分泌的一類酶，可以與內酰胺類抗生素的β-內酰胺環相結合，破壞甚至裂解β-內酰胺環，從而使其失去抗菌活性［7］。其主要有兩種分類方法，一種是Bush分類法［8］，另一種是Ambler分類法［9］。最具有代表性的為超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）［10］，其主要存在于革蘭氏陰性桿菌中的腸桿菌科細菌中，代表菌種為大腸桿菌和肺炎克雷伯菌［11］，銅綠假單胞菌也有產ESBLs的報道［12］。目前世界各地已發現超過200余種的ESBLs，且具有明顯的區域性特征［13］。根據編碼基因的同源性，ESBLs可分為CTX-M型、SHV型、TEM型、OXA型和其他型。據報道顯示，CTX-M型是我國產ESBLs菌株的主要基因型［14-15］，可能與我國臨床治療細菌感染時應用頭孢噻肟多且量大有關［16］。CTX-M型ESBLs根據氨基酸序列的同源性可分為6組，主要代表為CTX-M-14型［17］，其屬于CTX-M-9亞群，在全世界也呈現流行趨勢［18-19］。

目前已經研發出多種β-內酰胺酶抑制劑，常見的抑酶劑有克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等［20-21］，其本身具有較弱的抗菌活性，可以抑制β-內酰胺酶，因此常與β-內酰胺類抗生素聯合應用增強抗生素的耐藥性。但隨著這些抑酶劑與抗生素復合制劑的應用，新的耐藥菌株也逐漸出現［22-23］。因此需要尋找一種新型的β-內酰胺酶抑制劑，使細菌恢復對β-內酰胺類抗生素的敏感性。眾所周知，中藥歷史悠久，具有種類多、安全、不易產生耐藥性等特點，在細菌耐藥性研究中具有一定的優勢。且中藥內不含酰胺鍵，不容易被ESBLs破壞，可以很好的抑制β-內酰胺酶的活性［24］，因此從中藥中尋找一種β-內酰胺酶抑制劑不失為一種解決β-內酰胺酶耐藥性的好辦法。

本試驗構建了超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14的原核表達載體，通過計算機虛擬篩選從中藥單體數據庫中得到了一個較好的CTX-M-14中藥抑制劑—蕓香苷，聯合抑菌試驗證明蕓香苷與頭孢噻肟鈉具有聯合抑菌作用，并通過酶動力學試驗測定抑酶劑蕓香苷與克拉維酸的抑酶作用與抑酶方式。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌E320（本實驗室測序并保存的多重耐藥大腸桿菌菌株，NCBI登錄號：CP020933）、大腸桿菌ATCC25922購自美國組織細胞收藏中心（ATCC）、pET-28a（+）空質粒載體購自武漢淼靈生物科技有限公司、His-Tagged Protein Purification Kit 試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司、DH5α、BL-21購自上海昂羽生物技術有限公司、EcoR I、Xho I限制性核酸內切酶、Q5超保真DNA聚合酶購自NEB、IPTG購自索萊寶生物科技有限公司、蕓香苷購自上海源葉生物科技有限公司、頭孢硝噻吩（Nitrocefin）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、苯唑西林鈉、氨芐西林鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉購自北京酷來搏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建與表達

1.2.1.1 CTX-M-14的基因克隆與鑒定 根據CTX-M-14的基因設計引物，以E320、ATCC25922的DNA為模版，98℃ 30 s，98℃ 10 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 2 min，4℃保存，共35個循環，進行PCR，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果是否存在876 bp的條帶。

1.2.1.2 重組質粒的構建與鑒定 以大腸桿菌E320為模板，設計的引物引入酶切位點。CTX-M-14 F：5′- CGGAATTCATGGTGACAAAGAGAG-3′（劃 線 為EcoR I酶切位點），CTX-M-14 R：5′- CCCTCGAGTTACAGCCCTTCG -3′（劃線為Xho I酶切位點）。根據上述PCR條件，將得到的PCR產物與pET-28a（+）分別用EcoR I和Xho I雙酶切以及膠回收，用T4連接酶過夜連接并轉化到感受態DH5α，獲取的質粒通過雙酶切進行鑒定，確定質粒構建成功后，將質粒進行測序，并與目的序列比對。

1.2.1.3 誘導表達及可溶性檢測 測序成功后將目的質粒轉化到感受態細胞BL-21中，于37℃振蕩培養至OD600達到0.6左右，取適量菌液做未誘導對照，其余的菌液加IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導表達4 h后收集菌體，處理后通過SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色進行檢測。

取誘導表達后的菌液，冰浴中超聲裂解，分別收集上清和沉淀，處理后通過SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色進行檢測，確定表達產物是在上清中以可溶性形式存在還是在沉淀中以包涵體形式存在。

1.2.1.4 重組蛋白誘導表達條件的優化 將蛋白陽性重組菌分別進行誘導時間、誘導溫度和IPTG濃度的優化。第一組優化誘導時間，終濃度1 mmol/L，37℃分別誘導3、4、5、6 h；第二組優化誘導溫度，終濃度1 mmol/L，26℃、31℃、34℃、37℃、42℃分別誘導4 h；第三組優化IPTG濃度，終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，31℃誘導4 h。處理后通過SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色進行檢測。

1.2.1.5 蛋白純化與活性的鑒定 冰浴條件下超聲破碎蛋白陽性重組菌直至菌體清亮，取出上清液，使用His-Tagged Protein Purification Kit試劑盒進行純化，使用頭孢硝噻吩（Nitrocefin）檢測酶的活性。

1.2.2 超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14中藥抑制劑的虛擬篩選

1.2.2.1 超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14和中藥單體化合物的結構處理 從PDB（Protein Data Bank，www.rcsb.org）上下載大腸桿菌超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14晶體結構（PDBID：6vnu）。在AutoDock-Tools（The Scripps Institute）中刪除水分子，加電荷、加氫原子，經處理后轉換成pdbqt格式。從ZINC數據庫（www.zinc.org）下載中藥單體化合物結構，并轉換成pdbqt格式。

1.2.2.2 超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14虛擬篩選及作用力分析 在AutoDoockTools上通過Grid Box工具找到2drd蛋白的活性口袋，用PyRx（The Scripps Institute）運行Autodock Vina完成虛擬篩選，并應用DSVisualizer（BIOVIA）進行作用力分析。

1.2.3 聯合抑菌試驗

1.2.3.1 MIC的測定 蕓香苷經DMSO溶解后加水配成50 mg/mL的準備液，采用微量肉湯二倍稀釋法，用MHB營養肉湯分別測定蕓香苷、苯唑西林鈉、氨芐西林鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉對大腸桿菌E320與蛋白陽性重組菌BL-21的最小抑菌濃度（MIC），并以ATCC25922作為質控菌株。

1.2.3.2 蕓香苷與頭孢噻肟鈉的聯合抑菌試驗 采用微量棋盤稀釋法對大腸桿菌E320、蛋白陽性重組菌BL-21進行藥物體外聯合抑菌試驗，以導入空質粒的BL-21作為空白對照，在縱橫兩個方向上以蕓香苷、頭孢噻肟鈉的MIC為初始濃度，對蕓香苷和頭孢噻肟鈉分別進行倍比稀釋，每孔加入大腸桿菌菌液使終濃度為5×105CFU/mL，37℃培養20 h，以無細菌生長的最低藥物濃度為聯合用藥MIC，計算分級抑菌濃度指數（FICI），判定聯合用藥效果。

FICI=MIC（蕓香苷聯合用藥）/MIC（蕓香苷單用）+MIC（頭孢噻肟鈉聯合用藥）/MIC（頭孢噻肟鈉單用）

判定標準：FICI≤0.5判定為協同作用，0.5＜FICI≤1判定為相加作用，1＜FICI≤2判定為無關作用，FICI＞2判定為拮抗作用。

1.2.4 酶動力學測定

1.2.4.1 米氏常數（Km）與最大反應速率（Vmax）的測定 選取頭孢噻肟鈉作為底物進行測定，將蕓香苷溶解在含0.1 mmol/L的Na2CO3中配成10 mg/mL的溶液備用，將β-內酰胺酶CTX-M-14加入到PBS中，含抑制劑組將加入抑制劑終濃度為1 mmol/L，調節pH 7.0，溶劑對照組加入等量的0.1 mmol/L的Na2CO3，空白對照組加入等量的PBS，置于37℃中溫浴5 min，頭孢噻肟鈉溶液pH調整為7.0，并置于37℃中溫浴5 min，然后根據頭孢噻肟鈉濃度（10、20、30、40、50 μm/L）將頭孢噻肟鈉加入到上述溶液中并迅速轉移到比色皿中，通過紫外分光光度計監測5 min內236 nm處吸光度值的變化。選取初始反應吸光度值變化與時間呈線性關系的區段，計算水解的初速度V0，并根據方程V=Vmax/（Km+S）進行非線性擬合，分別得出Km與Vmax。

1.2.4.2 抑制常數Ki的測定 選取頭孢噻肟鈉作為底物進行測定，分別將0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、5 μm的克拉維酸或蕓香苷與含有β-內酰胺酶CTX-M-14的PBS混合，調節pH 7.0，置于37℃中溫浴5 min，然后轉移至比色皿中，分別加入50、100 μm的頭孢噻肟鈉進行混合，迅速加入到紫外分光光度計中，檢測5 min內236 nm處吸光度值的變化，選取初始反應吸光度值變化與時間呈線性關系的區段，計算水解的初速度V0，以Dixon做圖， 求出Ki。

1.2.4.3 抑酶保護率的測定 選取頭孢噻肟鈉作為底物進行測定，在含有β-內酰胺酶CTX-M-14的PBS中加入蕓香苷或克拉維酸至終濃度為2 mmol/L，調節pH 7.0，溶劑對照組加入等量的0.1 mmol/L的Na2CO3，空白對照組加入等量的PBS，置于37℃中溫浴5 min，然后加入與抑制劑質量比為1∶1的頭孢噻肟鈉，空白對照組加入頭孢噻肟鈉至終濃度為4 mmol/L，測定其236 nm處的OD值后繼續置于37℃溫浴30 min，再次測定其OD值，每組重復3次，根據OD值的變化，計算抑酶保護率。

抑酶保護率（%）=（對照組OD值的變化量-試 驗組OD值變化量）/對照組OD值的變化量×100%

2 結果

2.1 PCR擴增凝膠電泳

使用CTX-M-14這對引物對E320和ATCC25922進行PCR擴增，結果（圖1）顯示，E320攜帶CTX-M-14基因，出現約876 bp的條帶，ATCC25922未擴增到CTX-M-14基因。

圖1 PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig. 1 Gel electrophoresis of PCR amplified product

2.2 重組質粒酶切鑒定結果

將提取的重組質粒用EcoR I和Xho I進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，在750 bp與1 000 bp之間有與CTX-M-14相同大小條帶，證明構建成功（圖2）。

圖2 轉化后質粒經雙酶切Fig. 2 Double enzyme digestion of transformed plasmid

2.3 DNA測序結果

重組質粒經序列分析，與GenBank中CTX-M-14基因相同。測得核苷酸序列與GenBank中CTX-M-14對照，如圖3所示。

圖3 CTX-M-14測序結果比對圖Fig. 3 Alignment of CTX-M-14 sequencing results

2.4 CTX-M-14型ESBLs重組蛋白的誘導表達及可溶性檢測

重組菌誘導后樣品約在28 kD左右有明顯的融合蛋白條帶，而重組菌未誘導樣品無明顯特異性條帶，如圖4-A所示。裂解后的上清和沉淀中均出現一條28 kD左右的明顯的融合蛋白條帶，如圖4-B所示。

圖4 重組蛋白的表達檢測Fig. 4 Expression detection of recombinant protein

2.5 誘導條件的優化

結果顯示重組蛋白在31℃、IPTG濃度在0.6 mmol/L時誘導4 h為最佳條件，如圖5所示。

圖5 蛋白表達條件的優化Fig. 5 Optimization of protein expression conditions

2.6 重組蛋白純化及活性鑒定

重組蛋白經蛋白純化試劑盒純化的SDS-PAGE結果見圖6-A；對CTX-M-14重組蛋白活性鑒定中，加入β-內酰胺酶CTX-M-14的頭孢硝噻吩紙片從黃色變為紅色，而對照仍呈黃色，說明重組蛋白存在活性，如圖6-B所示。

圖6 重組蛋白純化及活性鑒定Fig. 6 Purification and activity identification of recombinant protein

2.7 超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14抑制劑的虛擬篩選

經過篩選共得到12個結合能低于-9.8 kcal/mol的中藥單體，其中結合能最高的是rhein diglucoside（大黃酸二葡萄糖苷），為-11.5 kcal/mol，其次是agastachin（藿香素）、glycyrrhizin（甘草酸）、timosaponin A3（知母皂苷A3）、biepiasterolide（雙表白術內酯）、sennidin A（森尼丁A）、rutin（蕓香苷）、ciwujianoside（刺五加皂苷）、galloylpaeoniflorin（沒食子酰芍藥苷）、acaciin（刺槐甙）（表1）。考慮到毒性、溶解性和價格等因素，我們選取了rutin（蕓香苷）來做后續的研究。

表1 Autodock Vina虛擬篩選的部分中藥成分評分結果Table 1 Scoring results of some Chinese herbal medicinal ingredients screened virtually by AutoDock Vina

2.8 蕓香苷配體與超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14作用力分析

通過Autodock Vina軟件對中藥單體與超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14進行分子對接模擬，結果顯示多種中藥單體能很好的與超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14結合。本試驗選取蕓香苷進行了分子間作用力分析，蕓香苷與超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14對接部位形成多個氫鍵和范德華力（圖7）。其結 合 作 用 力 為-9.9 kcal/mol，與Ser274、Ser237、Ser70、Ser130、Asn170、Asn132、Asn104、Arg276、Thr216、Thr235形成氫鍵，與Gly238形成范德華力。

圖7 蕓香苷與超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14作用力分析Fig. 7 Interaction analysis of rutin with extended-spectrum β-lactamases CTX-M-14

2.9 MIC的測定

E320對苯唑西林鈉、氨芐西林鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉為耐藥，對頭孢呋辛為敏感；重組蛋白陽性菌BL-21對苯唑西林鈉、氨芐西林鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉為耐藥，對頭孢他啶、頭孢呋辛為中度敏感，且對頭孢噻肟鈉耐藥極其顯著（表2）。

表2 大腸桿菌E320、重組蛋白陽性菌BL-21的MICTable 2 MIC of E. coli E320 and recombinant protein positive BL-21

2.10 蕓香苷和頭孢噻肟鈉的聯合抑菌試驗

通過微量肉湯二倍稀釋法測得蕓香苷、頭孢噻肟鈉對菌株E320的MIC分別為2.5 mg/mL、1 024 μg/mL，蕓香苷與頭孢噻肟鈉聯合抑菌時，兩者具有協同作用（FICI=0.236）；通過微量肉湯二倍稀釋法測得蕓香苷、頭孢噻肟鈉對CTX-M-14蛋白陽性重組菌的MIC分別為2.5 mg/mL和＞1 024 μg/mL，蕓香苷與頭孢噻肟鈉聯合抑菌時，兩者具有協同作用（FICI≤0.3125）；通過微量肉湯二倍稀釋法測得蕓香苷、頭孢噻肟鈉對導入空白質粒pET-28a（+）的BL-21的MIC分別為2.5 mg/mL、8 μg/mL，蕓香苷與頭孢噻肟鈉聯合抑菌時，兩者具有無關作用（FICI=1.5）（表3）。

表3 蕓香苷和頭孢噻肟鈉聯合抑菌試驗Table 3 Combined antibacterial test of rutin and cefotaxime sodium

2.11 酶動力學參數

根據擬合線性方程得出，β-內酰胺酶CTX-M-14的Km為7.13，Vmax為21.33；溶劑對照組的Km為7.11，Vmax為20.97；加入蕓香苷后的Km為8.76，Vmax為17.63；加入克拉維酸的Km為8.45，Vmax為17.79，加入抑制劑后相比空白對照Km均變大，Vmax均變小。根據Dixon作圖得出蕓香苷的Ki為11.38，克拉維酸的Ki小于蕓香苷為3.78（表4）。

表4 酶動力學參數Table 4 Enzyme kinetic parameters

2.12 抑酶保護率

蕓香苷組的OD值平均變化量為0.35，克拉維酸組的OD值平均變化量為0.32，空白對照組的OD值平均變化量為0.82，溶劑對照組變化量為0.81，根據計算得出克拉維酸的抑酶保護率為60.98%，蕓香苷的抑酶保護率為57.31%（表5）。

表5 抑酶保護率Table 5 Inhibition rate of enzyme

3 討論

分子對接是通過計算模擬的方式解決了實驗過程中效率低下的問題。Autodock Vina作為AutoDock的第二代分子對接軟件，對接的精度較第一代AutoDock更高，且操作簡易，可進行并行計算，對接速度較AutoDock具有很大優勢。蕓香苷，又名蘆丁，是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于各種藥用植物中，其化學成分獨特、生物活性廣泛，引起了國內外學者的關注［25］，其具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用［26-27］。研究顯示黃酮類化合物具有一定的抗菌活性［28］，Danciu等［29］還發現蕓香苷可以顯著降低金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等的致病力。本研究通過Autodock Vina軟件對中藥單體與超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14進行分子對接模擬，結果顯示多種中藥單體與超廣譜β-內酰胺酶CTX-M-14受體有好的結合作用。本研究選取蕓香苷為研究對象，結果顯示蕓香苷與CTX-M-14受體多個氨基酸殘基形成了疏水作用力，并且還與對接部位形成多個氫鍵，說明蕓香苷與CTX-M-14蛋白的結合很穩定。

序列比對分析結果與CTX-M-14相同，且蛋白大小相同，證明重組蛋白菌可以正確表達出CTX-M-14。頭孢硝噻吩是具有顯色特征的一種頭孢菌素，可以用來檢測β-內酰胺酶活性。β-內酰胺酶可以水解頭孢硝噻吩β-內酰胺環上羰基碳和氮基間的酰胺鍵，該過程可以使頭孢硝噻吩顯現紅色［30］，結果顯示頭孢硝噻吩變為紅色，說明重組蛋白菌表達出的β-內酰胺酶CTX-M-14具有活性。

陽性蛋白重組菌BL-21對苯唑西林鈉、氨芐西林鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉顯示為耐藥，并且對頭孢噻肟鈉的耐藥性最為顯著，可知CTX-M-14對頭孢噻肟鈉的水解能力最好，與文獻中報道相似［31］。因此對酶動力參數試驗選用頭孢噻肟鈉作為底物。蕓香苷使用DMSO溶劑不會對試驗結果產生影響［32］，其本身對大腸桿菌的抗菌活性較弱，但與抗生素頭孢噻肟鈉聯合應用時出現了協同作用，可增強頭孢噻肟鈉對大腸桿菌的敏感性，提高了抗菌活性，且E320和CTX-M-14蛋白陽性重組菌呈協同作用，而蕓香苷與頭孢噻肟鈉聯合應用對導入空白質粒pET-28a（+）的大腸桿菌呈無關作用，且蕓香苷與CTX-M-14蛋白有很好的結合作用，一定程度上可以說明蕓香苷是通過抑制β-內酰胺酶CTX-M-14的活性從而降低對頭孢噻肟鈉的耐藥性，表明中藥單體蕓香苷可作為β-內酰胺酶抑制劑的前體，可能通過結構改造而變成抑制作用良好、毒副作用低的β-內酰胺酶抑制劑。

米氏常數（Km）是酶動力學的經典且重要的參數，代表酶與底物的親和力，Km越小親和力越大，在加入抑制劑后，Km值明顯增大，說明抑制劑會抑制酶與底物的結合，從而起到抑制作用，且克拉維酸的增大量比蕓香苷大，說明克拉維酸的抑制作用比蕓香苷好。Vmax代表酶對底物的最大水解速度，可以反映β-內酰胺酶對酶的穩定性，在加入抑制劑后Vmax變化不大，說明這兩種抑制劑均為競爭性抑制劑［33］。Km/Vmax這一比值稱之為水解效率，可以綜合反應底物與酶的親和力［34］，抑制劑組Km/Vmax均大于空白對照組，說明這兩種抑制劑與酶的親和力大于底物頭孢噻肟鈉。抑制常數Ki是反應酶與抑制劑復合物的解離常數，越小說明抑制作用越強，蕓香苷的Ki大于克拉維酸的Ki值，說明克拉維酸的抑制作用優于蕓香苷，與Km的結果一致。抑酶保護率結果中克拉維酸的抑酶保護率也大于蕓香苷的抑酶保護率，說明克拉維酸的抑制作用優于蕓香苷。

4 結論

蕓香苷具有成為新型中藥β-內酰胺酶抑制劑的潛質，它與β-內酰胺類抗生素聯合應用時可以增強β-內酰胺類抗生素對大腸桿菌的敏感性，通過競爭性抑制β-內酰胺酶的活性，從而提高β-內酰胺類抗生素的抗菌活性。