黃芪甲苷通過調控宿主核糖體翻譯開關抑制HBV復制的機制

常 凱， 王艷艷， 那琬琳， 劉晨霞， 葉雨笙， 江忠勇， 劉 媛

1 中國人民解放軍西部戰區總醫院 檢驗科， 成都 610083；2 四川省疾病預防控制中心 微生物檢驗所， 成都 610041；3 成都市郫都區人民醫院， 成都醫學院第三附屬醫院 檢驗科， 成都 611730；4 成都市第七人民醫院 檢驗科， 成都醫學院附屬腫瘤醫院， 成都 610041

目前經國家食品藥品監督管理局批準用于治療乙型肝炎的藥物主要包括核苷酸類似物及IFNα兩大類[1]。核酸類似物可減少HBV復制，但對共價閉合環狀DNA(cccDNA)的影響很小，具有需要長期服藥、停藥后易反彈、患者依從性不佳等問題[2]。干擾素雖在一小部分受者中可能導致功能性治愈(HBsAg丟失)，但副作用較大且抑制病毒復制作用有限[3-4]。

中藥黃芪為豆科多年生草本植物膜夾黃芪和蒙古黃芪的干燥根[5]。黃芪的主要成分為黃芪皂苷、黃芪多糖、氨基酸以及微量元素等[6]。其臨床常用于治療肺心病、充血性心力衰竭、病毒性心肌炎、腎臟病和糖尿病等[7-8]。近年國內外對黃芪甲苷的研究越來越多[9]，主要具有調節免疫、缺血保護、抗炎、抗病毒等作用，對HBV、人腺病毒等多種病毒具有抑制作用[10]。黃芪甲苷作為黃芪皂苷的重要一員，在已有的臨床和基礎研究中都表現出保護肝臟細胞和抗HBV活性，在體外細胞培養中，黃芪對HBsAg及HBeAg的分泌有較好的抑制作用[11]；黃芪注射液聯合或單獨使用，抗病毒和免疫調節療效均呈劑量依賴性，在聯合恩替卡韋使用中具有很好的抗HBV感染作用，不僅可以很好的抑制HBV復制，而且可以在停藥后延緩HBV反彈，其機制包括JAK-STAT通路和細胞因子的調控[12]。在抗HBV作用中黃芪最主要的單體活性成分是黃芪甲苷，然而其具體的護肝基礎和抗病毒機制仍不明確[13]。

線粒體翻譯起始因子2(mitochondrial translation initiation factor 2，MTIF2)和核糖體蛋白L10(ribosomal protein L10，RPL10)作為調控線粒體翻譯步驟的明星分子，在諸多的病毒宿主翻譯機制中扮演重要作用。MTIF2為翻譯起始因子IF-2，多存在與線粒體和細胞質，是經典翻譯因子GTPase家族中IF-2亞家族成員[14]。MTIF2是蛋白質合成起始的基本成分之一，能夠保護甲硫酰-tRNA不被自發水解，并促進其結合到30S核糖體亞基[15]。同時也參與GTP在70S核糖體復合物的水解[16]。在宿主精子細胞中的研究[17]發現，當干擾翻譯起始因子時，HBV和X基因的轉錄水平明顯降低。RPL10為核糖體大亞基的組成單元，然而在核糖體構成中并非所有的核糖體蛋白成員均需參加[18]。在已有研究中，包括HIV在內的多種病毒復制的翻譯調控均與RPL10有關，本課題組前期對臨床高HBV和無HBV攜帶的肝癌組織樣本進行TMT全蛋白組學定量分析發現,RPL10與HBV復制關系密切，且干擾其表達后能明顯抑制HBV復制，因此推斷宿主RPL10可能是特異性參與病毒翻譯的核糖體蛋白。

基于以上研究，本研究擬用黃芪甲苷刺激人正常肝細胞L-02和攜帶HBV的Hep3B細胞，探討其生物活性和抑制HBV復制的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人正常肝細胞L-02，人肝癌細胞系 Hep3B(含HBV基因組)，購于成都諾和生物科技有限公司。

1.1.2 藥物及試劑 黃芪甲苷(美國Sigma-Aldrich)；胎牛血清(紐西蘭 Gibco公司)；DMEM培養基、PBS、青霉素鏈霉素雙抗(美國Gbico 公司)； Cell Counting Kit(CCK-8)(日本同仁)；細胞凋亡Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit購于上海碧云天；總RNA提取試劑盒、HBV核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購于中山大學達安基因股份有限公司。TransScript Green Two-Step qRT -PCR SuperMix 試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；HBsAg診斷試劑盒(酶聯免疫法)、HBeAg診斷試劑盒(酶聯免疫法)購于北京萬泰生物藥業股份有限公司。肝細胞外泌相關蛋白生化檢測試劑盒購于北京九強生物技術股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將人正常肝細胞L-02分別接種于6孔板和96孔板中，接種濃度為每孔1×104cell/mL，待18 h細胞貼壁后，分別加入含不同濃度黃芪甲苷的培養基(0、5、10和20 μg/mL，設復孔)培養24 h；將人肝癌細胞Hep3B置于T25培養瓶，細胞濃度為1×105/mL，分別添加黃芪甲苷濃度為0、5、10和20 μg/mL的培養基孵育細胞24 h。按實驗指標檢測要求分別收獲培養細胞和上清液備用。所用培養基為DMEM高糖培養基，含1%青鏈霉素雙抗和10%胎牛血清；培養條件為CO2濃度5%，溫度37 ℃和濕度36%。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活性 L-02細胞96 孔板培養24 h后吸出上清液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，再加入90 μL培養基，放入CO2培養箱內孵育3 h，使用酶標儀測定450 nm處的吸光度。各濃度黃芪甲苷對L-02細胞的抑制率=(對照組OD值-用藥組OD值)/(對照組OD值-調零孔OD值)[19]。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡和死亡 將人正常肝細胞L-02 6孔板培養24 h 后處理消化和洗滌細胞，再加入5 μL AnnexinV-FITC，室溫，避光，輕輕混勻避光10 min；加入5 μL PI室溫避光孵育5 min，加入PBS適量，輕輕混勻后應用流式細胞儀檢測細胞凋亡；用 70%的冰乙醇固定 24 h，PI 染色后流式細胞儀檢測[20]。判斷壞死細胞為(FITC+/PI+)；而凋亡細胞為(FITC+/PI-)。

1.2.4 生物化學法檢測L-02細胞外泌蛋白 將人正常肝細胞L-02 6孔板培養24 h 后分別收集培養液，1500 r/min離心5 min，取上清進行AFP、AST、ALT和ALP的外泌蛋白檢測。將各組待檢培養液置于Beckman Coulter AU5800生化儀進行檢測，分析各蛋白外泌水平。

1.2.5 生物信息學分析 調取TCGA數據庫和GEO數據庫資料集GSE65359、GSE84044和GSE58208，獲得乙型肝炎患者的RNA測序數據原始計數和相應的臨床信息。使用R套裝軟件ConsensusClusterPlus (v1.54.0)進行一致性分析，分析最佳聚類個數。重復100次抽取總樣本的80%，clusterAlg =“hc”, innerLinkage=‘ward.D2’。聚類熱圖均由R 套裝軟件pheatmap (v1.0.12)分析，基因表達熱圖保留方差在0.1以上的基因。通過R套裝軟件 survival 和 survminer進行實現，以上所有分析方法均由R v4.0.3實現。

應用HCCDB數據庫分別分析RPL10和MTIF2的生存曲線，應用TCGA數據庫分析RPL10和MTIF2聯合生存曲線。

1.2.6 HBV標志物檢測 Hep3B在不同黃芪甲苷濃度作用下培養24 h后，收集上清液。酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測上清液中的HBsAg和HBeAg水平；熒光定量PCR(qPCR)法檢測上清液中HBV DNA水平。

1.2.7 逆轉錄熒光定量PCR(qRT -PCR)法基因檢測

Hep3B在不同黃芪甲苷濃度作用下培養24 h后，分別收集上清液和細胞，并分別提取RNA，檢測上清液中HBV RNA水平；檢測細胞中MTIF2和RPL10基因轉錄水平。所用引物見表1，由InvitrogenTM合成。采用2-△△ct法計算基因相對表達水平。

表1 RT-PCR引物列表

2 結果

2.1 黃芪甲苷對細胞生長的影響 根據黃芪甲苷濃度的不同，分為0、5、10和20 μg/mL 4組。黃芪甲苷濃度20 μg/mL組處理24 h和48 h相較未處理組細胞生長活性均顯著提高(P值均<0.05)，黃芪甲苷濃度20 μg/mL組處理72 h相較10 μg/mL組生長活性提高(P<0.05)，黃芪甲苷濃度5 μg/mL組處理72 h相較未處理組生長活性提高(P<0.05)(表2)。4組內各時間段間比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

表2 黃芪甲苷對人正常肝細胞L-02細胞生長活性的影響

2.2 黃芪甲苷對細胞死亡和凋亡的影響 在不同黃芪甲苷濃度0、5、10和20 μg/mL處理L-02細胞24 h后，4組間細胞死亡率、凋亡率及死亡率+凋亡率均無統計學意義(P值均>0.05)(表3)。

表3 黃芪甲苷對L-02細胞凋亡的影響

2.3 黃芪甲苷對人正常肝細胞L-02外泌成分的影響

在不同黃芪甲苷濃度0、5、10和20 μg/mL處理L-02細胞24 h后，L-02細胞外泌AFP、ALT、AST和ALP水平變化各有不同(表4，圖1)。5、10和20 μg/mL 3個處理組AFP、AST水平均較未處理組顯著增高(P值均<0.05)。10和20 μg/mL 2個處理組ALT水平分別均較未處理和5 μg/mL兩組顯著降低(P值均<0.05)；20 μg/mL組ALT水平較10 μg/mL組顯著降低(P<0.05)。

表4 不同濃度的黃芪甲苷處理對L-02外泌蛋白的影響

2.4 黃芪甲苷對HBV的影響

2.4.1 黃芪甲苷參與HBV復制機制的生物信息學分析

應用基因功能分析軟件GeneMANIA分析黃芪甲苷調控基因RPL10和MTIF2參與的生物學功能[21]。結果表明,RPL10和MTIF2基因在生物學功能上高度連鎖，主要參與3項重要生物功能：翻譯起始(錯誤發現率FDR=2.01×10-12),病毒基因表達(FDR=1.12×10-10),核糖體亞基(FDR=1.47×10-11)。表明黃芪甲苷所調節的基因主要是通過核糖體翻譯起始調控影響HBV復制(圖2a)。

基于上述研究及前人的基礎[22]，構建了黃芪甲苷參與HBV復制的可能作用機制(圖2b)。即專一性寄生于肝細胞核內的cccDNA提供pgRNA在內的所有病毒mRNA的轉錄模板，pgRNA和mRNA可借助宿主細胞翻譯出多種用于病毒包裝的蛋白，在胞質中組裝形成核衣殼復合體用于形成新的病毒中間體。在該過程中，黃芪甲苷可調控RPL10和MRIF2分別參與核糖體大亞基的組成和翻譯起始。影響中間體裝配成成熟的病毒Dane顆粒釋放入血或重新補充核內的cccDNA。

注：與0 μg/mL組比較，＊ P<0.05；與5 μg/mL組比較，# P<0.05。

注：a,RPL10&MTIF2蛋白互作分析圖；b,黃芪甲苷參與HBV復制的分子機制示意圖。

2.4.2 RPL10 & MTIF2調控HBV復制的生物信息學分析 調取TCGA和GEO數據庫中HBV相關資料集GSE65359、GSE84044和GSE58208，對RPL10 & MTIF2調控HBV復制的相關基因(RPL10、RPS13、RPL28、RPL29、RPL24、RPL3、RPL10L、MTIF2、EIF4A3、MAGOH、MRPL16、RSL24D1、LRPPRC)進行富集分析。使用R套裝軟件Consensus Cluster Plus (v1.54.0) 進行一致性分析，聚類個數為4時，表現出理想的聚類效果(圖3a)。聚類熱圖均由R套裝軟件pheatmap (v1.0.12)分析，表明在功能上明顯分為兩類，且在基因表達水平的趨勢一致(圖3b)。

調取肝癌數據庫中HBV感染的肝癌患者資料351例，分析RPL10的表達差異對患者預后的影響：發現較低表達RPL10患者，RPL10表達水平高的患者預后較差(圖3c)。在對MTIF2的表達差異對患者預后的分析中，調取肝癌數據庫資料212例：發現較低表達MTIF2患者，MTIF2表達水平高的患者預后較差(圖3d)。

分析145例TCGA資料集中HBV感染的肝癌患者資料(圖3e)，RPL10 和 MTIF2同時高表達的患者預后較差(P=0.039 2，95%CI:0.362～0.975。在不同樣本風險分值對應的生存時間和生存狀態散點圖分布中可以看出，RPL10 和 MTIF2的表達水平越高，死亡病例數越高(圖3f)。而在無HBV感染的肝癌患者中，不存在上述現象，因此說明：RPL10 和 MTIF2主要是通過影響HBV發揮其效力。

注：a, 一致性聚類結果熱圖；b,相關基因表達聚類熱圖；c,RPL10基因生存曲線分析；d,MTIF2基因生存曲線分析；e,RPL10和MTIF2基因聯合生存曲線分析；f,不同樣本Risk score對應的生存時間和生存狀態散點分布圖。

2.4.3 黃芪甲苷對pgRNA、病毒抗原、RPL10、MTIF2表達的影響 在不同黃芪甲苷濃度0、5、10和20 μg/mL處理Hep3B細胞24 h后，Hep3B細胞HBV DNA和pgRNA水平變化各有不同(表5、圖4)。 3個處理組HBV DNA、pgRNA、HBsAg、HBeAg、RPL10和MTIF2水平與未處理組比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

注：與0 μg/mL組比較，＊P<0.05。

表5 黃芪甲苷對HBV復制裝配中相關基因及蛋白表達的影響

3 討論

為了快速的在宿主體內進行增殖和復制，HBV通過激活宿主細胞多種信號通路搶奪mRNA翻譯資源[23]。同時，該搶奪過程又會受到各種約束，如翻譯系統不兼容，翻譯起始、延伸和終止受阻等等。因此明確HBV掠奪翻譯系統的方式方法，阻斷病毒對宿主信號通路的激活調控是阻斷HBV復制的重要策略之一[24]。本研究首先對黃芪甲苷處理正常肝細胞所產生的影響進行了研究，發現其可促進正常肝細胞增殖，損傷較小。又進一步應用黃芪甲苷處理HBV細胞模型Hep3B，發現黃芪甲苷能夠有效抑制MTIF2和RPL10的表達，一方面通過抑制翻譯起始減少病毒組裝所需蛋白的翻譯；另一方面減少特異性核糖體大亞基的組裝，降低用于合成病毒所需蛋白的核糖體形成，進而影響HBV復制。

黃芪甲苷處理正常肝細胞實驗中，20 μg/mL黃芪甲苷在72 h內能促進L-02細胞生長，5、10和20 μg/mL黃芪甲苷處理24 h能促進L-02細胞AFP和AST分泌，降低ALT水平，但對細胞凋亡和ALP分泌影響較小。表現出促進正常肝細胞增殖的作用。這與胡雅夢等[25]的80 μg/ml以下黃芪甲苷對L-02細胞增殖無影響的報道不一致，但該報道也說明黃芪甲苷能夠提高輻射損傷后L-02細胞的增殖能力,抑制輻射所致的胞內ROS和MDA含量升高。劉麗等[26]在急性肝損傷小鼠模型的研究中發現黃芪甲苷能夠有效降低血清ALT和AST的含量，具有促進肝細胞生長保護肝臟的功效。與本研究結果基本一致，部分結果的差異可能由于實驗模型的差異導致。但總體的結論都證明黃芪甲苷具有促進肝細胞生長和保護肝臟的功效，表明其對正常肝細胞的刺激和損傷作用較小，具有良好的臨床應用基礎。

應用生物信息學調取數據庫大樣本臨床資料分析發現：RPL10 和 MTIF2主要是作用HBV發揮其效力影響肝癌患者預后，且RPL10 和 MTIF2的表達水平越高，死亡病例數越高，預后越差。由于該研究僅基于HBV所致的肝癌數據庫統計得出，因此對于單純感染HBV的非腫瘤患者預后情況有待進一步研究。

乙型肝炎與肝實質細胞的增殖密切相關，HBV DNA隨機整合頻率增加能夠引起遺傳紊亂，進而導致細胞的惡性增殖[27]。而HBV的復制廣泛依賴于宿主細胞的翻譯系統[28]。本研究表明5～20 μg/mL黃芪甲苷在Hep3B細胞中能有效降低HBV DNA和pgRNA的相對表達水平，抑制HBsAg和HBeAg合成，抑制宿主RPL10和MTIF2基因mRNA表達。同時生物信息學分析表明關鍵基因RPL10 和 MTIF2的表達水平越高，死亡病例數越高，預后越差，提示高水平RPL10和MTIF2提示預后差的原因可能與HBV復制調控相關。

縱觀整個抗病毒領域，HBV、HIV和呼吸道病毒是新藥研發的主戰場，雖然臨床藥物種類繁多，但是有效率仍然不容樂觀。在近兩年多發的大型公共衛生事件下更凸顯出這一短板，因而闡明傳統中草藥對病毒基因宿主內翻譯調控機制的作用，在未來開發或改進抗病毒藥物以及在新發病原體的應對中具有重要意義。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：常凱、王艷艷負責課題設計，資料分析，撰寫論文；常凱、王艷艷、那琬琳、劉晨霞、葉雨笙、江忠勇參與實驗實施與修改論文；常凱、劉媛負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。