蟲草菌絲通過抑制TLR4/NF-κB信號通路與血管生成素樣蛋白4對肝纖維化小鼠模型的保護作用

張霖璋， 張定棋， 徐 瑩,2b， 楊海琳， 戚勝蘭， 張聰聰， 陳佳美, 劉 平, 劉 偉

1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院， 肝病研究所， 肝腎疾病病證教育部重點實驗室， 上海市中醫臨床重點實驗室，上海 201203； 2 上海中醫藥大學 a.交叉科學研究院， b.教學實驗中心， 上海 201203

肝纖維化是慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病與自身免疫性肝病等多種慢性肝病后期共有的病理變化[1]。肝纖維化是一種可逆的創傷修復反應，其特征是肝臟受到損傷后活化的肝星狀細胞(HSC)分泌大量的細胞外基質[2]，但臨床上尚缺乏有效逆轉肝纖維化的生物或化學藥物[3]。近年來有學者[4-7]研究發現中藥及復方在肝纖維化治療方面顯示了良好的臨床效果，如扶正化瘀膠囊/片、復方鱉甲軟肝片、安絡化纖丸以及下瘀血湯等。

現代藥理學研究[8]表明蟲草菌絲具有調節免疫功能、抗癌、保護肝腎等廣泛的藥理活性。課題組前期研究[9]發現蟲草菌絲對肝纖維化小鼠具有顯著改善作用，主要表現在能夠抑制HSC的活化、逆轉肝竇內皮細胞去分化等方面。Toll樣受體4(TLR4)/核轉錄因子-κB(NF-κB)信號主要介導炎癥反應，近年成為探究肝臟炎癥反應機制的研究熱點[10-11]。已知血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)參與了人體多種的病理生理過程，如脂代謝、糖代謝、腫瘤發生及血管生成等[12]。課題組前期試驗發現蟲草菌絲顯著下調肝纖維化小鼠肝組織中ANGPTL4的表達，但是否調控TLR4/NF-κB信號通路尚不清楚。因此，本研究擬通過探究蟲草菌絲對CCl4肝纖維化小鼠模型肝組織ANGPTL4表達及TLR4/NF-κB信號通路的影響，探討蟲草菌絲抗肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性C57/BL6J小鼠60只，SPF級，購自上海吉輝實驗動物有限公司，體質量(20±2)g，動物生產許可證編號：SCXK(滬)2012—0014，實驗動物使用許可證編號：SYXK(滬)2021—0005。小鼠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，環境溫度(22±2)℃，日照時長和黑暗時長各12 h，所有小鼠均自由飲水進食。

1.1.2 藥物與試劑 蟲草菌絲(江西國藥中藥飲片有限公司，批號17040268)；扶正化瘀方(上海現代制藥股份有限公司，批號190608)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、羥脯氨酸(HYP)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20200716、A030-1)；α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、ANGPTL4抗體(Abcam公司，貨號ab32575、ab196746)；TLR4、CD163(Proteintech公司，貨號19811-1-AP、16646-1-AP)；NF-κB、P-NF-κB(Cell Signaling Technology公司，貨號8242、3033)；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.1.3 主要儀器 CR21G型冷凍高速離心機(日本日立公司)，Eclipse TS100-F型熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，JK-6型生物組織攤烤片機(武漢俊杰電子有限公司)，Step One PlusTM型實時熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)，1-15K型高速冷凍離心機(美國Sigma公司)，Odyssey掃描儀及雙色紅外激光成像系統(美國LI-COR公司)。

1.2 動物分組造模與藥物干預 60只C57/BL6J雄性小鼠適應性飼養1周后，隨機分為正常組10只和模型組50只。模型組小鼠按2 mL/kg體質量腹腔注射15% CCl4-橄欖油，每周一、三、五造模，造模6周；正常組小鼠按2 mL/kg體質量腹腔注射空白橄欖油。在第4周首日，將模型組小鼠隨機分為模型對照組，蟲草菌絲低、中、高劑量組，扶正化瘀方組；每組10只。造模第4周首日開始給藥，蟲草菌絲低、中、高劑量組分別口服給予400、800、1600 mg/kg蟲草菌絲溶液，扶正化瘀方組口服給予2000 mg/kg扶正化瘀方溶液，以上藥物均以0.3%羧甲基纖維素鈉配制；正常組和模型組小鼠灌胃給予等體積0.3%羧甲基纖維素鈉。各組藥物干預均為1次/d，灌胃體積為10 mL/kg，連續3周。取材前禁食不禁水12 h，小鼠麻醉后取血和肝臟，處理后用于后續實驗。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 血清轉氨酶和TBil檢測 將血清樣本各取150 μL送至上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科處協助檢測，檢測ALT、AST活性和TBil水平。

1.3.2 肝臟病理染色 選取肝大葉最厚一塊，切取0.5cm×0.5cm×0.5cm肝組織1塊，置于10%中性甲醛緩沖溶液固定72h，常規脫水、包埋、切片，HE和SR染液染色，將封好的片子使用數據掃描切片機自動掃描，并采用Image Analysis對SR染色陽性面積進行定量分析處理。

1.3.3 肝組織HYP含量 稱取(50±2)mg肝組織，使用堿水解法作肝組織中的HYP含量檢測，實驗操作步驟參照試劑盒說明書操作。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR) 稱取肝組織50 mg，加trizol 1 mL提取總RNA，具體操作步驟按說明書進行，應用NanoVue濃度檢測儀，檢測RNA濃度。使用逆轉錄試劑盒對總RNA進行逆轉錄，得cDNA。取384 孔PCR板加樣，Real-time PCR法檢測對應指標，采用2-ΔΔCt法計算各mRNA表達量。

1.3.5 免疫組化檢測α-SMA、Col-Ⅰ、ANGPTL4蛋白表達 免疫組化操作參照試劑盒說明書進行檢測，α-SMA，1∶1000；Col-1，1∶800；ANGPTL4，1∶150，二抗1∶10 000，并采用Image Analysis對組織染色陽性面積進行定量分析。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot) 稱取肝組織40～60 mg，加1 mL蛋白裂解液，4 ℃、65 Hz高速勻漿180 s，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，抽取上清液800 μL置1.5 mL離心管，再次離心30 min，抽取上清液600 μL置1.5 mL離心管，按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作進行蛋白濃度測定并加上樣緩沖液。制膠，電泳，轉膜，封閉，一抗孵育過夜、二抗室溫孵育1 h，α-SMA(1∶1000)，ANGPTL4(1∶1000)，NF-κB(1∶1000)，P-NF-κB(1∶1000)、TLR4(1∶1000)，CD163(1∶1000)，GAPDH(1∶5000)，二抗(1∶10 000)。掃描目的條帶，并與GAPDH條帶對比分析進行統計。

2 結果

2.1 對CCl4肝纖維化小鼠血清肝功能的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST、TBil均顯著升高(P值均<0.01)；與模型組比較，蟲草菌絲低劑量組血清AST下降明顯(P<0.05)，中劑量組血清AST和高劑量組血清ALT、AST均下降明顯(P值均<0.01)，高劑量組血清TBil下降明顯(P<0.05)，扶正化瘀方組血清ALT、AST下降明顯(P值均<0.01)(表2)。

表2 各組小鼠血清生化結果比較

2.2 對CCl4肝纖維化小鼠肝組織病理學及HYP含量的影響 肝組織病理染色結果見圖1。HE染色結果顯示，正常組肝臟肝小葉結構清晰，無炎性細胞浸潤；模型組小鼠肝小葉結構嚴重破壞，可見存在大量的炎性細胞浸潤；各藥物組均有不同程度改善，其中以蟲草菌絲高劑量組改善效果最為顯著。SR染色結果顯示，正常組小鼠僅在匯管區可見少量膠原纖維；模型組小鼠肝組織以匯管區為中心出現大量膠原沉積；與模型組相比，各藥物組膠原沉積均有不同程度地減少，其中以蟲草菌絲高劑量組的效果最為顯著。HYP和SR半定量結果見表3。與正常組相比，模型組HYP含量顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，蟲草菌絲高劑量組和扶正化瘀方組HYP含量均顯著下降(P值均<0.05)。SR半定量結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肝組織膠原面積顯著增加(P<0.01)；蟲草菌絲中、高劑量組和扶正化瘀方組膠原面積較模型組均顯著下降(P值均<0.05)。

表3 HYP含量和SR陽染面積

2.3 對CCl4肝纖維化小鼠α-SMA和Col-Ⅰ表達的影響 免疫組化結果見圖2。正常組于匯管區少量表達α-SMA；半定量結果顯示，模型組較正常組α-SMA表達明顯增多(P<0.01)(表4)；蟲草菌絲高劑量組改善效果最佳(P<0.05)(表4)，可見纖維間隔帶明顯變窄。正常組小鼠肝組織內Col-Ⅰ少量表達于小靜脈壁，半定量結果示模型組較正常組Col-Ⅰ表達明顯增多(P<0.01)(表4)，可見大量膠原纖維表達于肝竇壁和纖維間隔，與模型組相比，蟲草菌絲不同劑量組肝組織內膠原表達顯著減輕，半定量結果顯示蟲草菌絲高劑量組效果最佳(P<0.05)(表4)，肝組織膠原沉積明顯減少。

Real-time PCR結果見表5，與正常組相比，模型組小鼠肝組織α-SMA、Col-Ⅰ mRNA表達水平均顯著升高(P值均<0.01)；蟲草菌絲中、高劑量組下降效果最為顯著(P值均<0.05)。

表5 α-SMA和Col-Ⅰ mRNA表達

Western Blot結果見圖3，與正常組相比，模型組小鼠肝組織α-SMA蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，蟲草菌絲高劑量組和扶正化瘀方組改善效果最為顯著(P值均<0.05)(表6)。

表6 α-SMA蛋白表達

2.4 對CCl4肝纖維化小鼠ANGPTL4及TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響 免疫組化結果見圖4。正常組小鼠肝組織內ANGPTL4少量表達于肝實質細胞周圍。半定量結果顯示，模型組較正常組ANGPTL4表達明顯增多(P<0.05)，主要表達在匯管區和膽管細胞周圍；蟲草菌絲高劑量組改善效果最佳(P<0.05)(表7)。

表7 ANGPTL4免疫組化陽染面積

注：N，正常組；M，模型組；CS(400 mg/kg)，蟲草菌絲低劑量組；CS(800 mg/kg)，蟲草菌絲中劑量組；CS(1600 mg/kg)，蟲草菌絲高劑量組；FZGY(2000 mg/kg)，扶正化瘀方組。箭頭所示為ANGPTL4蛋白的表達。

注：CS，蟲草菌絲；FZHY，扶正化瘀方。

Western Blot結果見圖5。與正常組相比，模型組小鼠肝組織ANGPTL4、TLR4蛋白均顯著升高(P值均<0.05)，P-NF-κB/NF-κB、CD163蛋白均明顯升高(P值均<0.01)；與模型組相比，高劑量組ANGPTL4、TLR4、P-NF-κB/NF-κB和CD163改善效果最為顯著(P值均<0.05)，扶正化瘀方組ANGPTL4改善效果明顯(P<0.05)(表8)。

表8 ANGPTL4、TLR4、P-NF-κB、NF-κB、CD163蛋白表達

3 討論

肝纖維化是以活化的HSC分泌大量的細胞外基質、膠原表達增多及過度沉積為特征，被認為是肝硬化和肝癌進展的關鍵因素[13]。盡管在過去的幾十年里，肝纖維化的發病機制得到了廣泛的研究，但目前還沒有有效的化學與生物藥物。本研究結果表明，蟲草菌絲能夠顯著改善CCl4誘導的小鼠肝組織的纖維化程度、血清肝功能異常，顯著減少α-SMA和Col-Ⅰ等纖維化指標的mRNA和蛋白的表達，顯著減少ANGPTL4、TLR4、P-NF-κB/NF-κB和CD163蛋白的表達。

注：CS，蟲草菌絲；FZHY，扶正化瘀方。

ANGPTL4屬于血管生成素樣蛋白家族的一員，全長ANGPTL4(fANGPTL4)蛋白含一個nANGPTL4結構域和一個cANGPTL4結構域，肝臟能產生nANGPTL4片段[14]。肝臟是人體內脂肪代謝的場所，它在維持血糖穩定和正常脂質代謝中起著關鍵作用，肝臟功能障礙容易引起血糖和脂質代謝紊亂[15-16]。特異性地敲除ANGPTL4基因可以改善小鼠模型中因飲食引起的肥胖、葡萄糖不耐受和肝臟脂肪變性等問題[17]。最新研究[18]發現ANGPTL4在肝硬化患者和HBV誘導的肝損傷細胞模型中明顯上調，向肝硬化模型小鼠的尾靜脈注射sh-ANGPTL4慢病毒載體，發現干擾ANGPTL4的表達可以抑制HSC的活化，減少α-SMA、Col-Ⅰ、TLR4、NF-κB和CD163的mRNA和蛋白的表達，提示ANGPTL4通過TLR4/NF-κB通路調節CD163表達來改善Kupffer細胞極化誘導的肝硬化。ANGPTL4在本實驗CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中顯著升高，這和文獻報道的在肝硬化模型中升高相一致，并且高劑量組蟲草菌絲能夠顯著降低ANGPTL4的表達。

在纖維化肝臟中，巨噬細胞對肝纖維化的影響主要通過細胞因子旁分泌影響HSC的活化[19]，進而促進肝纖維化的進展[20]。CD163是一種M2型巨噬細胞的標志物，過往研究表明CD163是一種抗炎分子，在促炎因子的刺激下會受到抑制。但有文獻[21]報道在缺血損傷后的肝再生組織區域中會發現大量CD163高表達的巨噬細胞。同時既往研究[17]發現ANGPTL4是巨噬細胞的一個重要調控因子，能調節巨噬細胞的極化和造血干細胞的激活，并促進肝硬化的發生發展。本實驗研究結果發現在CCl4肝纖維化模型小鼠中CD163蛋白表達顯著升高，這也提示CD163蛋白不僅是一種抗炎分子，同樣也會在促炎因子的刺激下高表達。

TLR4/NF-κB信號通路是肝臟疾病反應的關鍵通路，它廣泛存在于各種組織和細胞中，是介導炎癥因子和細胞之間相互作用的重要信號途徑之一[22-23]。同時TLR4也可以通過與下游MyD88信號分子結合，來快速激活NF-κB炎癥分子，從而上調包括Col-Ⅰ等在內的促纖維化細胞因子的釋放，進而促進纖維化的進程[24-25]。除能調節肝纖維化疾病進展外，還有報道[26]表明TLR4/NF-κB信號通路在肝臟免疫功能紊亂、HSC的激活和肝癌的進展等機制方面發揮著重要作用。本研究發現蟲草菌絲能夠顯著減少肝臟膠原沉積，并且能劑量依賴性地降低肝臟α-SMA和Col-Ⅰ的表達以及TLR4/NF-κB信號通路相關的蛋白表達。因此抑制TLR4/NF-κB信號通路可能是緩解肝纖維化進展的有效途徑之一。

綜上所述，蟲草菌絲對CCl4誘導的小鼠肝纖維化具有顯著的治療作用，其可能通過降低ANGPTL4的表達來下調CD163表達，進而抑制肝纖維化進程，這可能主要是通過調節TLR4/NF-κB信號通路來實現。

倫理學聲明：本研究方案于2021年1月15日通過上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查，倫理編號PZSHUTCM210115005，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：張霖璋負責課題設計，資料分析，撰寫論文；張定棋、徐瑩、楊海琳、戚勝蘭、張聰聰、陳佳美參與收集數據，修改論文；劉平、劉偉負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。