戊型肝炎病毒感染的免疫發病機制

李曉領， 張 青， 王李安， 鄭娟娟， 李 海

天津市西青醫院 消化內科， 天津 300380

戊型肝炎病毒(HEV)感染是世界范圍內急性肝炎的主要病因之一，主要通過糞口途徑傳播，據估計每年約有2000萬人感染，其中約330萬例為癥狀性肝炎[1]。HEV感染通常是自限性的，但孕婦群體可出現急性肝衰竭[2]，尤其是妊娠晚期，這可能與其體內激素失衡和免疫改變有關[3]。HEV最初被認為只會引起急性感染，但目前確定HEV能引起免疫功能低下患者的慢性感染，如器官移植受者、HIV感染者和血液系統惡性腫瘤患者[4]。此外，在HEV感染過程中，也可引起肝外表現，包括腎臟、神經系統和胰腺疾病[5-6]。

HEV是一種小型、無包膜、單股正鏈RNA病毒，具有多個基因型。目前已知至少有8種不同的基因型，其中能夠感染人類的有1、2、3、4、7型[7]。基因1、2型HEV通常引起急性肝炎，而基因3、4型HEV感染可導致慢性肝炎或肝衰竭[8]。HEV的完整基因組長度為7.2 kb，至少包含3個開放閱讀框(open readiing frame，ORF)(ORF1、ORF2和ORF3)。結合過去研究，在基因1型HEV中定義了一個新的ORF(ORF4)[9]，所產生的非結構蛋白有助于病毒在應激條件下的有效復制，從而損傷靶器官。病毒在感染細胞過程中產生一個2.2 kb的亞基因組RNA，ORF2和ORF3編碼的結構蛋白是由亞基因組RNA在宿主細胞核糖體內翻譯而來的[10]。所以，在HEV感染的細胞中，病毒自身蛋白在HEV生命周期中發揮功能性作用。

宿主的免疫系統對入侵的病原體的發展和清除作用重大。其中，天然免疫是HEV感染過程中的第一道防線，在識別病毒的過程中產生抗病毒細胞因子，包括干擾素(IFN)和腫瘤壞死因子α(TNFα)[11]。這些天然的和非特異性的抗病毒免疫成分也能促進適應性免疫的發展，包括病毒特異性B淋巴細胞和T淋巴細胞反應，從而達到病毒的完全根除[12]。基于HEV細胞培養和動物模型，以及患者研究的最新發展，對這個復雜的病毒宿主免疫發病機制有了進一步認識。本文綜述了HEV感染過程中的免疫發病機制，并對急慢性感染的防治方法進行展望。

1 HEV的天然免疫

1.1 天然免疫細胞 自然殺傷細胞(NK細胞)在對病毒感染的天然免疫中似乎具有關鍵作用。在抵御病毒感染的過程中，NK細胞誘導天然細胞因子IFNα/β的產生，從而抑制病毒復制，增強NK細胞對靶細胞的毒性[13]。有研究[14]表明，在急性戊型肝炎患者外周血單個核細胞中，NK細胞和NKT淋巴細胞出現的總數低于健康對照組，但激活的NK細胞、NKT淋巴細胞數量顯著高于健康對照組，提示激活的NK細胞、NKT淋巴細胞可從外周血遷移到肝臟，在肝臟中發揮抗病毒作用，而在急性戊型肝炎恢復期階段，NK細胞、NKT淋巴細胞數量及激活狀態變為正常。目前樹突狀細胞(DC)、單核細胞、巨噬細胞遷移到受感染的肝臟產生免疫效應及發揮功能尚不清楚，因此，需要進一步研究這些天然免疫細胞在HEV感染中的作用。

1.2 病毒感染后IFN應答 病毒感染后先觸發天然免疫應答，HEV可被RNA病毒特異性的一個或多種模式識別受體識別，包括維甲酸誘導基因1(retinoic acid inducible gene-1，RIG-1)樣受體(RIG-1-like receptors，RLR)、Toll樣受體(toll-like receptors，TLR)和核苷酸寡聚化域樣受體[15]；它們分別在細胞質和核內識別病毒RNA產物。RLR的成員包括RIG-1(也稱為DDX58)、黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation associated gene 5，MDA5，也稱為IFIH1)和遺傳生理學實驗室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)[16]。其中LGP2是RLR信號的調控因子，對于RIG-1信號為負調控因子，而MDA5信號為正調控因子[16]。在過去的幾年里，通過TaqMan低密度陣列和RNA測序的轉錄組分析，研究了RIG-I和MDA5在HEV RNA應答中的意義。結果表明，在人肝癌細胞系中這些RLR對于HEV感染反應非常重要[17]。在13種已知的不同TLR中，TLR3、7和8是病毒來源RNA應答的主要TLR[18]。RLR識別病毒，TLR可激活IFN調節因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)、IRF7和核因子κB(NF-κB)介導的下游信號通路，最終，導致IFN和其他促炎因子(炎癥細胞因子/趨化因子)的產生[11,18]，從而啟動抗病毒應答。

其中，IFN由3種不同的類型組成，包括I型(IFNα、IFNβ、IFNδ和其他亞型)、Ⅱ型(IFNγ，唯一的成員)、Ⅲ型(IFNλ1、IFNλ2、INFλ3和INFλ4)[19]。IFN通過自分泌和旁分泌途徑發出信號，以對抗體內病毒。IFN與靶細胞上的受體結合，激活它們共同的下游信號通路，包括經典的Janus激酶(JAK)信號傳感器和轉錄激活因子(STAT)通路(JAK-STAT信號通路)，引起IFN刺激基因(IFN-stimulated genes，ISG)轉錄[20]。雖然這三種類型的IFN都能抑制HEV復制，但體外實驗表明，Ⅰ型IFN對HEV基因復制的抑制作用最強[21]。對于基因3型HEV感染的豬動物模型觀察顯示，其Ⅲ型IFN誘導占主要優勢，且這種誘導是細胞依賴型，HEV感染的豬腸細胞中可發現Ⅱ型IFN的誘導[22]。基因1型和3型HEV可以在原代人類腸道細胞中復制，并能誘導Ⅲ型IFN和Ⅰ型IFN[23]。ISG是抗病毒效應直接作用分子，數百個ISG共同建立一個抗病毒的網絡起到清除病毒作用[24]。但HEV可能會破壞IFN誘導和激活的JAK-STAT信號通路，以減少ISG產生[7,21]。

在患有慢性戊型肝炎的腎移植受者中，橫斷面微陣列研究證實了在血液樣品中25種ISG上調，這些ISG的高表達可能與病毒的持續感染有關[25]。ISG F3復合物會使ISG發生結構改變，從而抑制HEV的復制，并對入侵的HEV病原體提供快速和及時的免疫應答[26]。抑制JAK1及ISGF3復合物會促進HEV的復制[26-27]。但STAT1、STAT2和IRF9抑制ISG的抗病毒作用，也會導致HEV復制的增加[27]。單個ISG在調節HEV感染中的抗病毒作用尚不清楚，基因3型HEV細胞培養模型中25個ISG的異位表達中發現RIG-1、MDA5和IRF1是抑制HEV復制的主要ISG，其中，IRF1和RIG-1都在不誘導IFN產生的情況下激活一組ISG[28-29]。因此，這些ISG很可能會激活宿主免疫防御機制而間接對抗HEV感染。也有研究[30]證實MDA5在HEV感染性和亞基因組復制子模型中具有直接抑制HEV復制的作用，其作用是通過部分激活JAK-STAT信號通路，誘導一系列不依賴于IFN產生的ISG來介導其抗病毒作用(圖1)。

注：病毒感染后，被模式識別受體識別，產生IFN。IFN與其相應受體結合，導致STAT磷酸化，磷酸化的STAT與IRF9形成復合物，易位到細胞核中，通過基因轉錄，誘導ISG(RIG-1、IRF1、STAT1、STAT2、MDA5)表達，從而抑制病毒復制，這是通常的抗病毒反應。HEV在細胞內的基因及產物也可通過抑制STAT磷酸化等多處信號通路而阻止IFN應答，因此降低IFN抗病毒效應，有利于HEV在人體生存。

HEV可能具有控制IFN產生平衡功能，以利于其在受感染的宿主細胞中生存，且這種作用具有基因型特異性。但這也是HEV感染者利用IFN治療效果不佳的原因，臨床應該考慮聯合治療或新型免疫治療策略。

1.3 HEV誘導炎癥反應過程中相關信號通路 HEV感染的肺上皮細胞系的轉錄分析顯示，促炎細胞因子上調，包括IL-6、IL-8和TNFα[31]，TNFα通過誘導包括ISG15和MDA5在內的ISG，從而中度抑制HEV的復制[32]。TNFα與IFNα可以聯合產生協同抗HEV作用[32]。但在HEV感染的孕婦中發現TNFα水平顯著升高，這可能與其重癥化傾向有關[33]。

HEV ORF3可以干擾TLR信號傳導。在體外人肺上皮A549細胞實驗中，基因1型HEV ORF3可抑制TNFα誘導的NF-κB信號通路[34]。在HEV ORF3表達的細胞中，應用TNFα、IFNγ和異體霉素刺激時，NF-κB、JAK/STAT和JNK/MAPK等多種信號通路顯著下調[35]，進一步研究[36]提示，HEV ORF3通過抑制JAK-STAT信號通路，下調吞噬受體CD14和CD64來損害免疫細胞吞噬作用。HEV ORF3的P2結構域通過干擾NF-κB信號可導致促炎細胞因子的產生顯著減少，包括TNFα、IL-8和IL-1β[37]。此外，ORF2蛋白通過阻止IκBα的降解來阻礙NF-κB信號通路[38]。因此，以上研究結論表明，對相關信號通路的抑制有利于病毒的復制，并為抗病毒治療提供相關思路。

天然免疫是抗HEV重要屏障，但HEV也能影響天然免疫細胞因子的信號通路，從而導致疾病發生。

2 HEV的適應性免疫

HEV的適應性免疫反應包括抗原呈遞、淋巴細胞活化、免疫分子形成和免疫效應的發生。在抗原識別階段，B淋巴細胞和T淋巴細胞分別可以通過B淋巴細胞受體和T淋巴細胞受體準確識別抗原，而T淋巴細胞只有在抗原提呈細胞呈遞抗原后才能完成隨后的活化和增殖，并產生對HEV的細胞殺傷效應。

2.1 B淋巴細胞介導的HEV免疫反應 在感染早期，HEV感染可誘導機體產生特異性抗體——抗HEV-IgM[39]。在典型的急性HEV感染者中，癥狀出現的1周后就會出現抗HEV-IgM，隨后逐漸下降，其后的12個月內，約40%仍可檢測到抗HEV-IgM，而當患者就診時，病毒RNA可能已經無法檢測到[40]。IgG的產生通常在感染后20周達到峰值，約37%的病例在2年后仍可檢測到[2]。在急性期和恢復期，抗HEV-IgG逐漸增加，并可能長期存在[41]。也有其他研究中觀察到感染者抗HEV-IgG也能逐漸消失[42]。提示流行區中反復暴露于自然感染環境下HEV可能維持抗體陽性，并維持HEV的群體免疫。但HEV 特異性抗體的逐漸下降也可能是導致同一地區的反復暴發流行的原因[43]。

2.2 T淋巴細胞介導的HEV免疫反應 在HEV的急、慢性肝炎和急性肝衰竭患者中檢測到HEV特異性CD4+和 CD8+T淋巴細胞反應，這些HEV特異性T淋巴細胞反應可增殖和產生細胞因子(包括TNFα和IFNγ)[44]。免疫組化結果顯示，急性HEV感染者肝臟中CD4+T淋巴細胞數量高于健康組，其可通過細胞因子促進CD8+T淋巴細胞分化為細胞毒性T淋巴細胞，后者可直接殺死被感染的肝細胞，導致肝細胞損傷的同時清除病毒；而HEV特異性T淋巴細胞浸潤到肝臟也可能由于其細胞毒性(穿孔素和顆粒酶)而導致肝損傷[14]。CD8+T淋巴細胞介導的細胞免疫在HEV導致肝炎的進展中以及HEV清除中可能起關鍵作用。

HEV感染過程中的一個最重要的細胞因子是肝臟中的IFNγ，其可由多種類型的細胞產生，包括單核細胞、DC、NK細胞和NKT細胞，但主要來源于NK細胞和NKT細胞，其在免疫抑制劑治療的器官移植患者減少，可繼發導致CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞及其產生的細胞因子減少，從而導致HEV發展為慢性疾病[7]。通常，研究[38]使用HEV ORF2蛋白(pORF2) 和HEV ORF3蛋白(pORF3)刺激患者來源的淋巴細胞或轉染肝癌細胞，其中ORF2具有高免疫原性，可以在體外有效刺激特定的T淋巴細胞反應。持續高抗原(HEV RNA)刺激會產生細胞因子，并損傷細胞毒活性，也有可能導致T淋巴細胞衰竭。這種現象在幾種慢性病毒感染，包括HBV、HCV和HIV中也有類似表現[45]。T淋巴細胞衰竭可限制感染宿主的免疫病理機制，有利于病毒的復制并促進病毒的持久生存[46]。

除了慢性化之外，孕婦感染HEV后常會引起重癥化，目前考慮也和T淋巴細胞免疫相關，根據孕婦的免疫生理變化提示在孕后期，Th2和Treg的數量和比例逐漸升高，Th1數量和比例逐漸降低，從而呈現一種叫Th2漂移現象，可能與HEV孕婦重癥化相關[2]。

3 HEV的疫苗和治療

對于HEV感染的預防，除了常見的公共衛生預防以外，還可以應用疫苗進行免疫預防。疫苗開發的基礎是利用HEV特異性抗體的保護作用。目前在我國只有一種獲得許可的抗HEV疫苗—病毒樣顆粒HEV239疫苗(Hecolin?)(廈門創新生物技術)，主要誘導體液反應。在臨床試驗[47-48]中已成功證明了抗HEV抗體可以通過疫苗接種來誘導。其免疫保護的有效性、安全性和持久性均得到了很多研究的支持，且這種疫苗已經得到我國食品藥品監督管理局批準上市。目前還在研制的疫苗包括基因1型重組蛋白、基因4型衍生肽疫苗等，都還在上市前研究階段[49]。尚不清楚HEV疫苗能否在HEV感染暴發期間為暴露人群提供快速保護的作用，也沒有充分證據提示其對HEV的基因2型或3型有效，所以，一些專家反對在HEV暴發期間進行大規模疫苗接種[50]。應用T淋巴細胞基礎的疫苗來誘導特異性T淋巴細胞反應是有效果的，其中包括基于肽的CD8+T淋巴細胞疫苗或CD4+輔助性T淋巴細胞靶向疫苗，具有良好療效，它們已應用于癌癥和慢性HEV感染的治療中[51-52]。目前仍然需要對目標表位的確定和優化上繼續研究[53]。但其在臨床上應用仍然具有挑戰，其未來目標可能是慢性HEV感染者人群，這種人群的IFN傳統治療效果有限。

針對HEV的抗病毒治療尚無特異性的療法。抗病毒藥物利巴韋林和聚乙二醇化IFN是目前用于治療急性和慢性HEV感染的常用方法，但根據其免疫發病機理及藥物本身局限性，效果不佳。更多有效的治療，尤其對孕婦安全有效的治療還需要進一步開發。

4 結論和展望

HEV感染是廣泛影響發展中國家和發達國家的一種傳染病，可導致世界各地(主要是發展中國家)大規模肝炎暴發。近些年研究提示HEV感染的天然和適應性免疫方面取得了一定進展，其特異性的特點包括可以通過多信號通路較強阻止IFN的抗病毒作用，病毒T淋巴細胞免疫及某些細胞因子在HEV控制及慢性化中至關重要。開展進一步研究將提高對 HEV免疫發病機制與HEV清除過程和不同臨床結果的了解，從而制訂針對性抗病毒方案及措施，比如IFN聯合方案或新型免疫治療方案。天然免疫細胞，包括NK細胞、DC和巨噬細胞功能尚不清楚，但這些細胞是啟動對HEV的天然免疫反應和控制抗病毒B、T淋巴細胞免疫建立的關鍵效應細胞。因此，應該全面研究HEV在肝臟的免疫應答。

盡管目前有針對抗HEV藥物及疫苗，但因其供應量較少及在特殊(孕婦及免疫抑制或低下)人群中的副作用，以及價格較昂貴，認知較差，限制了其在減少全球HEV感染負擔中的作用。因此，需要進一步研究病毒與宿主之間的相互作用，開發新的抗病毒策略和HEV疫苗，從而對更好地控制該病起到關鍵作用。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李曉領負責資料分析，撰寫文章；張青、王李安、鄭娟娟參與收集、分析資料；李海負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。