黃芩苷抑制糖尿病大鼠心肌成纖維細胞分化機制研究

徐秋玲 郭 冉 王以寧 孫 衛 張緒東 鄭學芝▲

1.牡丹江醫學院基礎醫學院，牡丹江黑龍江 157011；2.牡丹江醫學院附屬第二醫院心內科，牡丹江黑龍江 157011

心臟纖維化由駐留的心臟成纖維細胞激活介導，成纖維細胞分化為肌成纖維細胞以應對損傷或壓力，肌成纖維細胞的形成是一個對急性損傷的生理反應[1]，研究發現炎癥損傷參與糖尿病心肌病病理過程[2]，α-平滑肌細胞肌動蛋白（α-smooth muscle cell actin，α-SMA） 是心肌成纖維細胞分化為肌樣成纖維細胞的標志物。 miR-146a 異常表達參與縮窄性心肌炎纖維化病理過程[3]。 在糖尿病心肌纖維化病理過程中microRNA-146a（miR-146a）與α-SMA 表達相關性報道較少。 中藥黃芩的活性成分黃芩苷具有抗炎、抗氧化、抗纖維化作用[4]，本課題組前期研究發現黃芩苷參與糖尿病鼠心肌纖維化，本實驗主要研究黃芩苷參與糖尿病心肌纖維化與miR-146a 和α-SMA 表達相關性，為糖尿病心肌病的治療提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

24 只健康雄性SD 鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK（京）2016-0006]，飼養于SPF/VAF 級動物室， 室溫18～25℃， 相對濕度50%～80%，每日光照12 h，自由攝食、飲水。 適應性飼養1 周后進行實驗。動物實驗通過牡丹江醫學院動物實驗倫理委員會審核通過。

1.2 主要儀器與試劑

血糖儀（美國強生公司，20202221732）；熒光定量PCR 儀（美國Invirtogen 公司，A43162）；黃芩苷（Sigma公司，MFCD00134418）；生理鹽水配制藥液，鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司，MFCD00006607）；qPCR 試劑盒（美國Invirtogen 公司，F455XL）；抗α-SMA 抗體（博士德生物工程有限公司，A03744）；抗GAPDH 抗體（博士德生物工程有限公司，A00227-3）。

1.3 實驗分組及處理

用隨機區組設計法先將24 例健康雄性SD 鼠從01～24 編號， 在隨機數字表中任一位置開始按行選擇，選取雄性8 例作為對照組，余16 例建立糖尿病模型：采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素45 mg/kg（溶于0.1 mmol/L 枸櫞酸緩沖液），72 h 后連續2 次空腹血糖大于或等于16.7 mmol/L 為糖尿病造模成功。 然后將造模成功的鼠再按照隨機區組設計法分為模型組和治療組，每組各8 例。

治療組普通飼料飼養，同時腹腔注射黃芩苷藥液每天每千克15 μmol/L。 對照組和模型組同樣普通飼料飼養，同時腹腔注射與黃芩苷等容積的生理鹽水，連續用藥8 周后， 動物禁食12 h， 用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔麻醉，然后在冰上快速取心臟組織，稱重記錄，心臟剪成大小約為1 mm3的組織塊，加入胰酶心肌細胞消化液，攪拌3 次，每次10 min；3000 g離心，離心半徑10 cm，5 min；棄去懸液，加入PBS 重懸細胞；3000 g 離心，離心半徑10 cm，5 min；去懸液，PBS 重懸細胞后置于培養瓶中，因心肌細胞較心臟成纖維細胞貼壁速度慢，所以利用差速貼壁法將心肌細胞和心臟成纖維細胞分離，收集心臟的成纖維細胞[5]。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 基線資料 測各組血糖、心臟重量、體重，計算心臟重量指數（心臟重量/體重）。

1.4.2 RT-PCR 檢測miR-146a 表達 提取細胞總RNA，6000 g 離心，離心半徑10 cm，5 s。70℃干浴3 min。加逆轉錄酶0.5 μl，37℃水浴，60 min。 85℃干浴5 min失活處理，進行定量PCR 實驗。 miR-146a 正向引物5′-CAGCTGCATTGGATTTACCA-3′，miR-146a 反 向引物5′-GCCTGAGACTCTGCCTTCTG-3′，內參U6 正向引物5′-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3′，內參U6 反向引物5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′。qPCR 反應體系：SYBR Green 9 μl，cDNA 2 μl， 正向引物2 μl，反向引物2 μl。反應條件：95℃10 min 預變性，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，40個循環。 用2-△△CT法計算目的基因相對于內參基因的mRNA 相對表達量[6-7]。

1.4.3 Western-blot 檢測心肌成纖維細胞 α-SMA、GAPDH 蛋白PBS 沖洗細胞3 次， 加入胰蛋白酶消化細胞，4℃離心棄上清，加入適量細胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃，13 000 g，15 min，離心半徑10 cm。吸取上清，蛋白定量分裝，10 μg/管。 Western-blot 步驟：十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）電泳，轉膜；分別加入抗α-SMA 和抗GAPDH抗體孵育（封閉液稀釋1∶500），4℃過夜，TBST 洗2次，每次5 min，加入二抗（封閉液稀釋1∶1000），室溫10 min，TBST 洗3 次，每次5 min。濾膜于顯色液中反應1 min。拍照并計算灰度值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析， 計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血糖、心臟重量指數的比較

治療組血糖、心臟重量指數低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組血糖、心臟重量指數均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 三組血糖、心臟重量指數的比較（±s）

表1 三組血糖、心臟重量指數的比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 血糖（mmol/L） 心臟重量指數模型組（n=8）治療組（n=8）對照組（n=8）24.6±1.01a 11.4±2.12ab 5.60±0.02 0.0038±0.00013a 0.0022±0.00024ab 0.0016±0.00021

2.2 三組miR-146a、α-SMA 的比較

治療組miR-146a 高于模型組，a-SMA 低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組miR-146a 低于對照組，α-SMA 高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2、圖1）。 蛋白相對表達水平：α-SMA 灰度值/GAPDH 灰度值。

圖1 三組α-SMA 的比較

表2 三組miR-146a、α-SMA 的比較（±s）

表2 三組miR-146a、α-SMA 的比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05； 與模型組比較，bP＜0.05；α-SMA：α-平滑肌細胞肌動蛋白；miR-146a：microRNA-146a

組別 miR-146a α-SMA模型組（n=8）治療組（n=8）對照組（n=8）0.93±0.04a 1.34±0.01ab 1.63±0.02 1.68±0.03a 1.32±0.01ab 0.61±0.04

3 討論

心肌纖維化是糖尿病心肌病的特征性病理表現[8]。高血糖刺激細胞外基質的合成和沉積，血管代償性增殖，導致心肌纖維化[9]。本實驗使用鏈脲佐菌素一次性較大劑量靜脈注射的給藥方法建立與人類1 型糖尿病表現相似的糖尿病模型[10]。

黃芩苷是干燥黃芩根部的生物活性形式，具有抗炎、抗氧化等功效。 研究發現黃芩苷能夠減輕氧化應激相關的損傷，減輕炎癥反應，黃芩苷通過減少轉化生長因子-β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）表達參與博來霉素誘導的肺纖維化[11]。 黃芩苷具有抗炎作用，黃芩苷通過抑制toll 樣受體4/核轉錄因子（toll-like receptors 4/nuclear factor-kappa B，TLR4/NF-κB）信號通路激活來抑制小膠質細胞誘導的神經炎癥[12]。 本研究結果顯示，模型組血糖高于對照組，差異有統計學意義 （P＜0.05）， 提示糖尿病模型造模成功。模型組與治療組、治療組與對照組血糖比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示黃芩苷影響血糖的代謝，具有降低糖尿病鼠血糖的功能；模型組心臟重量指數高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示高血糖刺激心肌組織增生，使心肌代償性肥大，心臟重量增加，與文獻報道結果一致[13]。 模型組與治療組、治療組與對照組心臟重量指數比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示黃芩苷對心肌有影響，黃芩苷參與糖尿病心肌重構。

microRNAs（miRNAs）是一類非編碼小RNA，高度保守，長度21～25 個堿基，miRNAs 通過抑制mRNA翻譯、 誘導mRNA 降解來調節基因表達，miRNAs 參與多個靶點上游調控因子的調控[14]。 1 型糖尿病是一種慢性自身免疫性疾病，炎癥介質在1 型糖尿病的病變過程中起到重要作用，炎癥有助于早期誘導和放大針對胰腺β 細胞的免疫攻擊，抑制β 細胞功能，參與β 細胞凋亡[15]。 miR-146a 是miR-146 家族中的成員，參與免疫和炎癥反應的反向調節[16-17]。 慢性炎癥是糖尿病的病理基礎，降低miR-146a 表達，加重炎癥[18]。本研究結果顯示，模型組miR-146a 表達低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示高血糖抑制miR-146a 表達，誘導炎癥反應，使細胞外基質的合成及分解代謝紊亂。模型組與治療組、治療組與對照組miR-146a 比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示黃芩苷干預心肌炎癥反應， 可以改善糖尿病鼠心肌炎性損傷，參與1 型糖尿病心肌炎性變化的病理過程。

心臟成纖維細胞分化為肌樣成纖維細胞，是心肌纖維化的關鍵因素。肌樣成纖維細胞收縮力、遷移力和合成膠原能力增強，加劇心肌重構，降低心臟功能[19]，α-SMA 是肌樣成纖維細胞的表面標志物， 是成纖維細胞分化為肌樣成纖維細胞關鍵蛋白[20]。 本研究發現模型組α-SMA 高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示高血糖刺激下，心肌成纖維細胞向肌樣成纖維細胞轉化， 加劇糖尿病心肌纖維化的病理進程。模型組與治療組、治療組與對照組α-SMA 比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示黃芩苷參與心肌纖維化過程，通過抑制α-SMA 表達抑制心肌成纖維細胞向肌樣成纖維細胞轉化，抑制糖尿病鼠心肌纖維化，調控心臟重塑過程，對糖尿病心肌具有保護作用。

綜上所述， 黃芩苷能夠提高糖尿病鼠心肌成纖維細胞中miR-146a 表達， 抑制高糖對心肌炎性傷害；抑制α-SMA 表達，降低糖尿病鼠心肌纖維化的進程， 為運用黃芩苷治療糖尿病心肌纖維化提供理論依據。