山奈酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的肝保護(hù)作用研究

徐亞鵬，寇文龍，張鈺婷，邢圓圓，盧 燕，張文奎

（河南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 焦作 454002）

急性酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，乙醇及其毒性代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)過(guò)氧化、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等均參與其中[1]。在我國(guó)，酒精性肝病僅次于病毒性肝炎，已成為引起肝功能損害的第二大病因[2]。酒精性肝損傷目前沒(méi)有較好的臨床治療策略，因此尋找此類疾病的藥物顯得尤為迫切。山奈酚（Kaempferol,Kae）是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的黃酮類化合物，可通過(guò)提高人體對(duì)抗自由基能力起到抗氧化作用[3]。但是山奈酚是否對(duì)急性酒精性肝損傷具有保護(hù)作用尚不明確。ALT和AST時(shí)肝損傷疾病的敏感指標(biāo)，主要存在于細(xì)胞漿內(nèi)，AST還存在于線粒體中，當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重受損時(shí)，因肝細(xì)胞通透性增加。胞漿內(nèi)的ALT及線粒體內(nèi)的AST則釋放入血，導(dǎo)致血液中的ALT及AST的表達(dá)水平大幅升高[4]，因此可以采用這兩個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)小鼠肝臟的損害程度。

本研究擬通過(guò)一次性酒精灌胃建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，通過(guò)檢測(cè)血清中ALT、AST含量、觀察肝臟切片形態(tài)評(píng)價(jià)山奈酚對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康C57BL/6J小鼠30只，雄性，八周，體重25g～30g，由河南斯克貝斯生物科技股份有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（豫）2020-0005，合格證號(hào)：410000000000001195。

1.2 主要試劑及儀器

山奈酚（諾斯夫生物技術(shù)有限公司提供），無(wú)水乙醇，羧甲基纖維素鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供）水合氯醛，福爾馬林溶液，精密分析天平（Mettler Toledo）、低溫離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）、自動(dòng)生化分析儀

1.3 動(dòng)物分組、給藥與造模

實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)環(huán)境 23℃～ 25℃，30只健康雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、酒精組及給藥組（山奈酚低、中、高三個(gè)劑量組）共五組，每組6只。

將山奈酚溶于羧甲基纖維素鈉，超聲震蕩使其溶解，每天中午預(yù)防性給藥三天，對(duì)照組、酒精組分別按與給藥組等體積灌服生理鹽水，其余各組分別灌服相應(yīng)劑量山奈酚，其中低劑量組40mg/kg，中劑量組50mg/kg，高劑量組60mg/kg)，每只小鼠灌胃體積為0.5ml，第4天除對(duì)照組外其余各組均按12 ml/kg劑量一次性灌胃60%酒精（用無(wú)水乙醇稀釋，下同）造模[5]建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，灌胃60%酒精后小鼠禁食不禁水，灌胃后觀察小鼠精神狀態(tài)并記錄醒酒時(shí)間。

6h后每只小鼠給予5%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，眼眶靜脈叢取血，采集血液，置于EP管內(nèi)，室溫靜置1h后，5000r/min離心15min，取上清液，分裝于EP管內(nèi)，于-80℃冰箱中保存。取血結(jié)束后，快速摘取肝臟組織，并固定于10%福爾馬林溶液中。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.4.1 狀態(tài)觀察

觀察各組動(dòng)物的一般情況，包括醒酒時(shí)間、精神、活動(dòng)狀況、飲食、排便、翻正反射等，有任何異常情況及時(shí)記錄。

1.4.2 血清生化指標(biāo)測(cè)定

第4天灌胃酒精造模成功6h后，眼球靜脈取血，血液靜置1 h，4℃低溫下進(jìn)行離心，5000 r/min離心15min后取上清液，測(cè)試ALT、AST濃度。

1.4.3 肝臟組織病理學(xué)觀察

取相同的小鼠肝臟部位，經(jīng)酒精梯度脫水，石蠟包埋，預(yù)冷切片，蘇木精-伊紅染色處理后，在400倍顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPadPrism6.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，計(jì)量資料以（Mean&SEM）表示，各組間比較采用（oneway ANOVA）檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：a=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 狀態(tài)觀察

造模前小鼠生活狀態(tài)正常，進(jìn)食進(jìn)水正常，毛色光澤，黑褐色顆粒樣大便。給予酒精造模后，除空白組外，其余各組小鼠先表現(xiàn)為行動(dòng)緩慢，翻正反射消失，進(jìn)入嗜睡醉酒狀態(tài)，進(jìn)食少，毛散亂。灌胃4h后給藥高劑量組小鼠逐漸蘇醒，其他各給藥組小鼠也逐漸蘇醒，模型組小鼠仍處于嗜睡醉酒狀態(tài)。

2.2 小鼠血清ALT、AST數(shù)值統(tǒng)計(jì)（x±SD）

從表1中觀察可以得出各給藥組降低ALT、AST水平隨著劑量增大而增強(qiáng)。

表1 小鼠血清ALT、AST數(shù)值統(tǒng)計(jì)表

2.3 山奈酚對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清AST、ALT的影響

如圖1所示，與對(duì)照組（control）相比，模型組（alcohol）小鼠血清中的AST、ALT水平顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明本研究成功建立了急性酒精性肝損傷的模型。與模型組相比各給藥組均可以抑制AST、ALT水平，在降低AST水平上高劑量組具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖1 山奈酚對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清AST、ALT的影響

2.4 山奈酚對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)的影響

由圖2可以看出，空白對(duì)照組小鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)明顯病變壞死和炎癥，肝細(xì)胞排列整齊，紅細(xì)胞未見(jiàn)滲出。模型組細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死，細(xì)胞破裂，細(xì)胞核滲出，炎癥浸潤(rùn)嚴(yán)重。給藥組可明顯改善酒精性肝損傷，肝索排列整齊，細(xì)胞形態(tài)趨于正常、紅細(xì)胞未滲出，無(wú)明顯炎癥浸潤(rùn)。

圖2 酒精性肝損傷小鼠的肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察（蘇木精-伊紅染色，×400）A：空白組；B：模型組；C：山奈酚低劑量組；D：山奈酚中劑量組；E：山奈酚高劑量組.標(biāo)尺=25um

3 討論

酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）是指長(zhǎng)期過(guò)量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，包括酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver,AFL）、酒精性肝炎（alcoholic hep-atitis,AH）、酒精性肝纖維化（alcoholic hepatic fibro-sis,AHF）、酒精性肝硬化（alcoholic cirrhosis,AC）和肝細(xì)胞癌（hepato cellular carcinoma,HCC）。酒精性肝病是世界范圍內(nèi)慢性肝病的最重要病因之一。約占全球死亡率的3.8%，在發(fā)達(dá)國(guó)家十分常見(jiàn)[6]。2007年美國(guó)國(guó)家防止酒精濫用及酒精中毒研究所的報(bào)告顯示肝硬化死亡率位于死亡原因的第12位，其中超過(guò)48%的比例與酒精有關(guān)。在我國(guó)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高以及受“中國(guó)酒文化”的影響，酒精消費(fèi)量逐年上升，酒精性肝病發(fā)病率也呈逐漸上升的趨勢(shì)。

肝臟是人體酒精代謝的重要器官，大約80%的酒精在肝臟中進(jìn)行代謝。酒精攝入過(guò)多會(huì)導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)一系列損害性病變。如何安全有效地預(yù)防和治療酒精性肝病已受到全社會(huì)的關(guān)注[8]。山奈酚（Kaempferol）是常見(jiàn)的黃酮類化合物之一，也稱為山奈黃素、黃芪甙元、山柰酚-3等，分子結(jié)構(gòu)式為C15H10O6，分子量為286.23，在山奈等姜科植物根莖中的含量最為豐富，也存在于生活中常見(jiàn)的果蔬及草本植物中[9]。

既往研究已證實(shí)了山奈酚具有多種重要的藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)等，在腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病腎病、急性肝損傷、骨關(guān)節(jié)炎等疾病中具有潛在的治療價(jià)值[10，12]。山奈酚具有十分明顯的抗炎作用，其作用機(jī)制主要包括調(diào)節(jié)促炎酶的活性和炎癥相關(guān)基因表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)錄因子、黏附分子以及基質(zhì)金屬蛋白酶等[13]。這為酒精性肝損傷的治療提供了新思路。

本研究明確了山奈酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保肝作用，在模型組中小鼠的ALT、AST明顯高于空白組，提示急性肝損傷模型復(fù)制成功，而各給藥組ALT、AST較模型組明顯下降，且隨著劑量因素比重的增大，抑制作用更明顯。表明山奈酚預(yù)處理能穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，抑制因肝細(xì)胞破裂、壞死而引起的血清轉(zhuǎn)氨酶升高，保護(hù)肝細(xì)胞免于大量酒精攝入引起的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為該產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床酒精性肝病的治療提供了新思路。