1株葉棲酵母菌鑒定及其培養液代謝物初探

魏嘉妤,陳明珠，彭麗娟,3*，丁海霞，田 靜

(1.貴州大學 煙草學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省黔東南州煙草公司岑鞏縣分公司，貴州 岑鞏 557800；3.貴州省煙草品質研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學 農學院，貴州 貴陽 550025)

植物附生菌(epiphyte)是一類龐大且豐富的微生物群體，在植物生長發育過程中具有重要作用。因生長于植物表面，其菌群數量與結構受光、溫、水氣以及地勢等影響而發生改變；同時附生菌的生存方式不同于其他微生物類群，可通過產生胞外分泌物，在植物表面形成一種生物膜，使其粘合在植物表面，這可幫助附生菌有效減少菌體水分散失。附生真菌主要由酵母菌和絲狀真菌兩大類群構成，分布在植物葉片表面的酵母菌也稱為葉棲酵母菌。目前，葉棲酵母菌的研究主要側重于分離鑒定種類以及菌種資源分布等方面。研究發現，多數植物葉棲酵母菌的種類以擔子菌為主，以擲孢酵母屬 ()、隱球酵母屬()、紅酵母屬 ()等數量最多。臧威等在浙江雁蕩山山脈進行葉棲酵母菌資源考察，分離出 56 個已知類群和 19 個疑似新種，但未探究葉棲酵母菌的功能特點。

課題組前期在分離錦繡杜鵑葉腫病菌(，日本外擔菌)的過程中，分離到1株葉棲酵母菌，為探究該葉棲酵母菌具有何種功能及對植物生長發育的影響，明確該菌株的分類地位，依據菌株的形態特征和分子生物學方法進行種的鑒定，同時對其培養液中植物生長物質等代謝物進行初步分析，為該菌作為微生物菌劑的開發利用提供理論依據，以及為后續研究葉棲酵母菌在葉片表面作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年、2020年4月中旬，從貴州省貴陽市南明區鳳凰山采集的錦繡杜鵑葉腫病典型癥狀標本，分離方法參考文獻[6]，代謝組分析培養液參照文獻[7]進行制備。

1.2 方法

..形態特征鑒定

挑取 PDA 平板上生長 3 d 的葉棲酵母菌菌落，蔡司 Axio Image M2 光學顯微鏡下觀察測量 30 個分生孢子大??；選取在 PDA 上培養 10 d的葉棲酵母菌，用徠卡 M205FA 體式鏡拍攝菌落形態。

..分子生物學鑒定

PDA上25 ℃培養12 d的純培養物，用滅菌手術刀刮取 2.0 g 于2.0 mL EP ( Eppendorf )管中。用 Biomiga公司真菌DNA提取試劑盒提取總 DNA。選擇引物LSU(NL4/NL1)和ITS(ITS5/ITS4)對菌株進行PCR擴增，所用引物信息、反應體系和反應程序均參考李振英的方法，將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和純化后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

將測序結果在NCBI (http://www.ncbi.nlm.gov) 數據庫中進行同源性比對，提交序列至GenBank。在UNITE(https：//unite.ut.ee/#panel3)上搜索外擔菌綱相關物種和對應種的模式菌株序列(表1)，采用最大似然法( Maximum Likehood,ML)，通過raxmlGUI 15b2軟件構建系統發育樹，Bootstrap檢驗的重復次數為1000。

表1 采用類群和序列登錄數對2種基因進行組合序列分析Tab.1 Taxa and sequence accession numbers employed in the combined two genes sequence analysis

..ITS 擴增子測序

選取新鮮有典型錦繡杜鵑葉腫病癥狀的感病葉片，用滅菌手術刀刮取表面白色子實層于無菌1.5 mL EP管中，3個重復，用干冰運送至北京諾禾致源公司對其ITS1區引物(ITS5-F和ITS1-R)進行PCR擴增測序，同時構建PE擴增文庫，使用NovaSeq600進行上機測序。下機數據參照Qiime(V1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags質量控制流程，經過嚴格的過濾處理得到高質量的Tags數據(Clean Tags)，利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)對所有樣本的全部 Effective Tag進行聚類，用Qiime軟件(Version 1.9.1)中的blast方法(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)與Unit (v7.2) 數據庫(https://unite.ut.ee/)進行物種注釋分析，最后將 OUTs 代表序列與相應微生物數據庫進行比對，得到各樣本的物種分類信息與各水平注釋信息。同時，獲得基于聚類結果的多樣性分析與基于注釋結果的各分類水平物種組成信息。

..2種真菌共培養

參考Berendsen等的方法，挑取培養12 d的葉棲酵母菌與 15 d的日本外擔菌單菌落，同時接種于PDA培養基(?=9 cm)上，在培養皿底畫夾角為30°的兩條線，接種8個單菌落呈V形擺放，倒置放于25 ℃恒溫培養箱中培養，每隔1天觀察2種菌間生長的變化。用徠卡 M205FA 體式鏡拍攝其培養菌落形態。

..基于液質聯用(LC-MS/MS)技術的非靶向代謝組學

從3瓶葉棲酵母菌培養液中分別取50 mL菌液移至3個無菌離心管后，參照文獻[6]的方法進行處理后用干冰送至北京諾禾致源公司，進行LC-MS/MS進行分析。

..致病性測定

分別于2021年3月12日在貴州省貴陽市南明區鳳凰山、4月14日在貴州大學西校區進行致病性測定。

采用有傷、無傷2種方法進行接種，共設8個處理(表 2)，2種接種方法各4個處理；對照、日本外擔菌菌餅、葉棲酵母菌菌餅以及混接2種菌餅。選生長健康的錦繡杜鵑幼嫩葉片用無菌水沖洗3次，使用無菌濾紙吸干葉片表面水分，接著進行接種，有傷處理用無菌一次性針筒(規格為10 mL)的針尖在葉脈兩側各輕輕劃開1個約為5 mm的傷口，無傷處理直接接種。用打孔器(?=5 mm)在培養好的菌種上打孔，取2個菌餅接種于葉片的葉脈兩側各1個(有傷處理接種至傷口處)，沾濕無菌水的無菌棉覆蓋菌餅，使用保鮮膜纏繞封好，維持保濕狀態。不同菌種使用記號筆在葉基部兩側上注明標記(：A；GYDJ-G：B)，每片葉接種2個菌餅，每株接種5片葉，每處理5株。錦繡杜鵑處于自然條件下生長。

表2 回接試驗Tab.2 Pathogenicity testing

1.3 數據分析方法

所有數據均通過Excel 2019整理，利用SPSS 21.0 軟件進行試驗數據的統計分析，采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 菌株形態特征及培養特性

從錦繡杜鵑病葉上分離到10個葉棲酵母菌純培養物，選取其中1株編號為GYDJ-G的觀察形態特征(圖1-a～g)。在PDA平板上25 ℃培養12 d菌落直徑13～16 mm，單菌落為圓形(圖1-b、c)，米白色，毛絮狀，緊貼平板向上生長，長在一起形成不規則菌落(圖1-a)，培養3 d的菌落在顯微鏡下觀察到其擲孢子形態(圖1-d、e)：長棒狀，長10.8～19.1 μm，寬1.7～2.6 μm，有2～3個油球，油球直徑1.0～2.3 μm ，部分擲孢子萌發產生芽管(圖1-f、g)，12 d后菌落生長以菌絲為主。

注：a～c為單個擲孢子在PDA上25 ℃黑暗培養12 d后形成的淺色戈盧別夫氏菌菌落形態; d、e為擲孢子; f、g為擲孢子萌發，bars =10 μm圖1 淺色戈盧別夫氏菌的形態特征(a-g)Fig.1 Morphological features of Golubevia pallescens(a-g)

2.2 菌株分子生物學鑒定

測序結果顯示，葉棲酵母菌GYDJ-G ITS/LSU長度為680/622 bp，序列已上傳至NCBI網站。經系統發育樹分析，葉棲酵母菌以97%支持率與淺色戈盧別夫氏菌(CBS 364.85) (登錄號：DQ3176 36/AJ235292)聚在一起，形成一個明顯的分支。結合GYDJ-G 菌株培養性狀和形態特征分析，確定該菌株為淺色戈盧別夫氏菌。

圖2 利用LSU和ITS序列的最大似然分析構建了GYDJ-G的系統發育樹，以 Entyloma arnoseridis 為外群最大似然bootstrap值(≥70%)Fig.2 Phylogenetic tree constructed by maximum likelihood analyses of LSU and ITS sequences for GYDJ-G,with Entyloma arnoseridis as outgroups.Maximum likelihood bootstrap values(≥70%)

2.3 擴增子分析

分別從屬水平與種水平分析擴增子結果。首先通過多序列比對得到top 100屬的代表序列，再選取top 34屬構建系統發育樹，豐度水平排名前12個屬依次為、、、戈盧別夫氏菌屬()、、外擔菌屬()、、、、、和(圖3)，其中，戈盧別夫氏菌屬和外擔菌屬豐度分別位于第4和第6位。種水平豐度前20物種系統發育樹顯示，淺色戈盧別夫氏菌占所觀察物種比例為4.62%，占真菌序列比例為12.00%；日本外擔菌相應比例分別為1.03%和2.67%，可聚類到日本外擔菌和淺色戈盧別夫氏菌。上述結果說明，在錦繡杜鵑葉腫病葉片上確實存在淺色戈盧別夫氏菌(圖4)。

圖3 屬水平擴增子系統發育樹Fig.3 A phylogenetic tree of amplifying subsystems at the genus level

圖4 種水平擴增子系統發育樹Fig.4 A phylogenetic tree of amplifying subsystems at the species level

2.4 2種真菌共培養

2種真菌共同培養15 d后可看出，淺色戈盧別夫氏菌與日本外擔菌在PDA平板上生長不相互排斥(圖5-a～d)，說明這2種真菌在PDA 平板上生長相互吸引，沒有拮抗作用。

注：a,2種真菌共培養；b,日本外擔菌菌落; c,淺色戈盧別夫氏菌菌落；d,2種真菌共培養菌落。圖5 日本外擔菌和淺色戈盧別夫氏菌共培養Fig.5 Synergistic interactions between Exobasidium japonicum and Golubevia pallescens

2.5 培養液代謝組分析

對培養液中代謝物進行分析，結果顯示培養液中含有557種化合物，其中正離子化合物379種，負離子化合物178種。因其代謝物中化合物種類較多，本文僅對其中植物生長物質、氨基酸和維生素種類進行統計分析。淺色戈盧別夫氏菌 ()培養液中含有維生素B2、維生素B3、維生素B5、維生素B6和維生素C等5種維生素(圖6-a)；含有吲哚乙酸(IAA)、反式玉米素(trans-Zeatin)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、褪黑素(MT)、茉莉酸(JA)、亞精胺(Spermidine)和組胺(Histamine)等8種植物生長物質(圖6-b)；含有絲氨酸(Serine)、賴氨酸(Lysine)、谷氨酸(Glutamic acid)、組氨酸(Histidine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、色氨酸(Tryptophan)、纈氨酸(Valine)精氨酸(Arginine)、脯氨酸(Proline)、焦谷氨酸(Pyroglutamic acid)和肌氨酸(Sarcosine)等11種氨基酸(圖6-c)。

注：a,維生素; b,植物生長物質; c,氨基酸，不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)。圖6 淺色戈盧別夫氏菌培養液代謝物Fig.6 Metabolites of Golubevia pallescens in liquid culture

2.6 致病性測定結果

處理后第5天、10天、15天，有傷與無傷接種8個處理均未發病(圖7-a～f)，同時期錦繡杜鵑葉腫病在自然條件下的發病癥狀如圖7-g～i。結果表明淺色戈盧別夫氏菌不是錦繡杜鵑葉腫病的病原菌。

注：a、d,接種第 5 d ; b、 e 接種第 10 d ;c、 f,接種第 15 d；g～i,在同時間自然條件情況下，錦繡杜鵑感病癥狀。圖7 菌株GYDJ-G的致病性試驗Fig.7 Pathogenicity test of strain GYDJ-G

3 結論與討論

經形態特征與分子生物學相結合方法鑒定，該葉棲酵母菌為淺色戈盧別夫氏菌。擴增子結果顯示，日本外擔菌和淺色戈盧別夫氏菌同時存在于錦繡杜鵑葉片上。共培養發現2種菌在PDA平板上相互吸引，致病性測定證明淺色戈盧別夫氏菌不是錦繡杜鵑葉腫病病原菌。在對這2種菌的分離純化過程中發現，淺色戈盧別夫氏菌生長速度遠快于日本外擔菌，菌落直徑比日本外擔菌大。2019、2020年均從貴州省貴陽市鳳凰山錦繡杜鵑葉腫病葉上分離到葉棲酵母菌。2019年從貴州省遵義市和貴州省遵義市鳳岡縣采集杜鵑()葉腫病分離日本外擔菌過程中，并未分離到淺色戈盧別夫氏菌。臧威等在對浙江雁蕩山葉棲酵母菌資源進行考察時，采用組織懸掛法從半枯葉片上分離到1株淺色戈盧別夫氏菌，本研究從錦繡杜鵑葉腫病葉上分離，而遵義市2個地點杜鵑()葉腫病葉上未分離到葉棲酵母菌。其中浙江雁蕩山與貴州省貴陽市鳳凰山均有大量的木本植物，而遵義市標本采集點為園林綠化區域，推測淺色戈盧別夫氏菌和日本外擔菌共同生長可能與生態條件有一定關系。

戈盧別夫氏菌屬由Wang等采用多基因分子系統發育分析方法建立的新屬，其模式種為淺色戈盧別夫氏菌(菌株號：CBS 364.85)，其同物異名種為腥擲孢菌屬()的。目前報道戈盧別夫氏菌屬僅有2個種，淺色戈盧別夫氏菌是1973年從日本鏈擔耳菌屬()的子實體上分離到的(http://www.indexfungorum.org/Names/NamesRecord.asp?RecordID =324632)。另1個種是異形戈盧別夫氏菌()，菌落為奶油色或白色，擲孢子與淺色戈盧別夫氏菌相似，呈圓柱形、細長形或月形，在歐洲多國引起蘋果果實白斑病。

本研究基于液質聯用(LC-MS/MS)技術對淺色戈盧別夫氏菌培養液中代謝物進行分析，其培養液中含有8種植物生長物質，有研究表明一些微生物可產生植物生長物質，對植物生長有一定調控作用。高繪菊等報道桑樹內生拮抗細菌枯草芽孢桿菌 ()能產生植物生長激素IAA，該菌株的培養液和菌體懸浮液及胞外分泌物對桑樹()和玉米()幼苗有較明顯的促生作用；Mehmood等從受到干旱脅迫的催眠睡茄()葉片中分離到1株內生真菌正泡盛曲霉()，該菌產生3-吲哚乙酸(IAA)、酚類和糖類等次生代謝物，可有效定殖于玉米根系并促進玉米生長。韓麗珍等從茶樹根際分離出6株根際促生菌，其分屬于假單胞菌屬(sp.)、芽孢桿菌屬(sp.)、束村氏菌屬(sp.)、伯克霍爾德氏菌屬(sp.)和根瘤菌屬(sp.)，均有產IAA能力，具有良好的促生性能。而淺色戈盧別夫氏菌培養液的代謝物會通過何種方式影響植株的生長發育尚未明確，值得進一步研究。