輔酶A 測定方法綜述

劉 里，石 柔

（曲靖師范學院 化學與環境科學學院，云南 曲靖 655011）

0 引 言

輔酶A (CoA)是20 世紀50 年代初由德國人Lipmann 和他的同事們發現的。CoA 是廣泛存在于動植物體中的天然輔酶，這種小分子(分子量通常≤1 000)以化學方式參與酶催化反應。

CoA 基本結構是由半胱氨酸、泛酸、三磷酸腺苷3 部分組成的。首次從大量豬肝提取物中分離出來的CoA 用于磺胺乙酰化。CoA 是一種在許多酶催化反應中幫助活化和轉移酰基的輔因子。由于CoA 上的巰基(-SH)與含有酰基的受體結合形成硫酯，所以可促進細胞體內100 多種化學反應。-SH是賦予其獨特的化學/酶學性質的功能位點，它與能量供給、酰基轉移、免疫激活，以及許多生物醫學反應息息相關。

所有細胞中都能合成的CoA 參與細胞內的許多生化反應，包括氨基酸、碳水化合物和脂類的代謝、肝糖原的儲存、乙酰膽堿的合成，以及三羧酸循環。

輔酶A 的濃度能反映出一些常見疾病的病理過程，如糖尿病、癌癥和心肌肥大等。由此可見，在生物基質中準確識別和檢測輔酶A 濃度的分析方法十分重要。但國內外對其檢測技術方面的研究進展至今還未見報道。本文綜述了32 年的研究進展，為后續輔酶A 的檢測提供一些參考價值。

1 測定方法

由于輔酶A 在生物體內的重要性，需一種靈敏、可靠、快速的分析方法檢測其含量。本文從1988 年開始綜述測定輔酶A 的各種技術、檢測原理以及各種參數。

已報道的測定方法有電化學法、熒光分光光度法、酶反應法、色譜法、毛細管電泳、液質聯用儀(LC-MS/MS)和比值比色法。

1.1 電化學法

潛在的低成本和便攜性的電分析設備是檢測分析的一個極具吸引力的選擇。由于電極表面易受其它物質的污染，從而降低了電極的靈敏度和準確度，限制了裸電極的應用。相比之下，基于各種修飾電極的電化學技術，因其固有的簡單性、高靈敏度和選擇性而受到青睞。

電化學發光(ECL)技術由于其高靈敏度和儀器簡單的優點而被廣泛應用于許多領域。半導體量子點(QDs)，也被稱為納米晶體(NCs)，由于其獨特的尺寸依賴性，引起了人們極大的興趣。量子點具有尺寸可控、量子產率高、抗降解穩定性好等優良性能，量子點已被用于太陽能電池、藥物載體、細胞成像和生化傳感器。

在過去的幾年里，量子點作為新型ECL 發射器和ECL 傳感器得到了廣泛的發展。

1.1.1 研究實例一

2015 年，Yufang Hu 等人報道利用核酸模擬配位聚合物優良的電催化活性檢測輔酶A 和組蛋白乙酰轉移酶的活性。

該研究小組首先以CoA 為有機配體，采用簡單的原位合成策略制備了一種新型的仿核酸輔酶A-銀離子[CoA-Ag(I)]配位聚合物(CP)，發現其對還原H2O2具有獨特的電催化活性。在此基礎上，研制了一種新型的無標簽電化學傳感器，用于檢測CoA 和組蛋白乙酰轉移酶(HAT)的活性。

Yufang Hu 等人使用這種獨特的CoA-Ag(I) CP作為電化學信號探針，高靈敏度和高選擇性檢測輔酶A 的檢測機制分為以下3 步：

（1） 由于CoA 分子的兩端分別是游離的硫醇基團和腺嘌呤，CoA 可與Ag(I)形成配位聚合物重復單位[(-CoA-Ag(I)-)]，并與沿著主鏈作為側基的多個腺嘌呤堿基形成鏈狀結構。因此，如果將CoA-Ag(I)CP 與核酸相比，它們都具有多個堿基側基，但CoA-Ag(I)CP 用硫醇-Ag(I)CP 主干取代原來的戊糖/磷酸核酸主干。因此，在某種程度上，CoA-Ag(I) CP 在結構上與聚A 單鏈核酸(ssNA)相似，所以，命名為模擬核酸CP。

（2） 受ssNA 與氧化石墨烯(GO)等二維碳納米材料強選擇性相互作用的啟發，發現CoA-Ag(I)CP與ssNA 類似，也可以通過側鏈的腺嘌呤通過π-π堆積作用輕松并有效地與GO 結合。

（3） 實驗進一步證明了GO 修飾電極吸附的CoA-Ag(I)CP 對H2O2的還原具有較高的電催化活性。電流與CoA 的濃度呈良好的線性關系，線性范圍為0.1~100 μM，檢出限為0.05 μM(S/N=3)。實際樣為添加了CoA 的人血清，加標回收為96.7%~108.5%。

1.1.2 研究實例二

2018 年，Zhao 等人發現了一種超靈敏測定輔酶A 的光電化學方法。輔酶A 作為電子供體加入到納米CdSe/ZnO 光電極的光電化學反應中，建立了一種新的光電化學(PEC)體系。

PEC 分析利用光來激發光電活性物質，被激發的物質與電子給體/受體發生反應產生光電流。因此，PEC 方法的靈敏度受電極、光電材料、電子給體或受體類型等多種因素的影響。

與電化學方法相比，PEC 可以消除一些不需要的背景信號，與光催化過程相似，產生的光電流能大大提高該方法的靈敏度。

一方面，CdSe 量子點是一種介于宏觀和微觀結構之間的亞穩態半導體材料，具有吸收光譜寬、穩定性好、比表面積大等優點，已被用于制備PEC傳感器。另一方面，CysH 和CoASH 都是含有巰基(-SH)的化合物，可以作為電子給體進行電子轉移反應，并且可以抑制光敏半導體納米材料的光激發電子空穴對的復合，產生光電效應。

在ZnO 納米棒陣列表面覆蓋CdSe 量子點，制備了CdSe/ZnO 光電極。CdSe/ZnO 光電極作為光敏界面，以其光敏性和作為電子受體的特性，與CysH 或CoASH 形成了一個PEC 體系，為CysH 和CoASH 的分析提供了一種新的PEC 方法。

在20 mW/cm2，410 nm 可見光照射下，得到了偏置電壓為0 V 時半胱氨酸或輔酶A 對光電流的敏感響應。優化實驗條件后，光電流與輔酶A 濃度的對數成正比，線性范圍為2.00×10-2~ 50.0 μmol/L，輔酶A 的檢出限為1.00×10-2μmol/L(S/N=3)。其它氨基酸或常見輔酶不干擾半胱氨酸和輔酶A 的測定。

1.1.3 研究實例三

2018 年，Chen 等人研究了一種CoA- 銀配位絡合物(CoA-Ag)，它能加速H2O2分解，提高CdTe@CdS QDs 的陰極ECL 強度。

輔酶A 是代謝過程中必不可少的輔酶，由腺苷3’-磷酸和一個巰基組成。因此，CoA 被認為是一種與貴金屬(如銀、金、銅)離子反應能力強的巰基官能團化合物。鑒于上述原理，2 個官能團巰基和腺嘌呤連接的分子CoA-Ag 絡合物，是由大量巰基-Ag 重復單位，像類似的多聚腺苷酸RNA 鏈組成的。

為了驗證CoA-Ag 復合物的RNA 結構，Chen等人研究了合成的CoA-Ag 絡合物是否可以用熒光法與SGII 結合，因為SGII 熒光染料可以特異性染色單鏈核酸。

研究結果表明，與SGII 結合CoA-Ag 絡合物具有明顯的放大信號發射，而單一的CoA-Ag 絡合物或SGII 熒光不明顯，事實證明CoA-Ag 具有RNA 結構。

單鏈核酸很容易通過π-π 和分子間作用力吸附在石墨烯或氧化石墨烯(GO)表面。由于CoA-Ag絡合物與RNA 類似，所以，GO 表面對CoA-Ag 也有高吸附能力。此外，GO 負載CoA-Ag 的量隨著CoA-Ag 絡合物的量增加而增加。

CdTe@CdS QDs 是一種陰極ECL 發射納米材料，在CdTe@CdS QDs-ECL 體系中引入了CoA-Ag絡合物，研究其電化學行為和ECL 行為。CdTe@CdS QDs 表現出ECL 最大波長在607 nm，與熒光發射光譜相當，表明陰極ECL 信號來源于CdTe@CdS QDs 激發態(CdTe@CdS*)。在CoA-Ag 存在時，CdTe@CdS QDs 在607 nm 表現出相同的最大波長，表明CoA-Ag 只是放大了CdTe@CdS* 的數量，而不會改變CdTe@CdS QDs 的其它屬性。

Chen 等人推測CoA-Ag 絡合物加速了電極表面的電子轉移，增加了CdTe@CdS*的數量，最終增強了ECL 信號。在負電位方向掃描時，通過電荷注入將共反應物H2O2還原為羥基自由(·OH)，將CdTe@CdS QDs 還原為納米晶CdTe@CdS(e-)。隨后，·OH 與帶負電荷的CdTe@CdS(e-)發生反應，直接氧化CdTe@CdS QDs，同時發出光，產生激發態CdTe@CdS*。

ECL 信號隨著CoA 濃度在0.1~100 μM 范圍內增加而增加，這是由于增加了CoA-Ag 絡合物的數量。根據不同濃度CoA 下的ECL 的強度，ECL信號與CoA 濃度之間存在線性關系。線性方程為I-I0/I0= 0.082 0C+ 0.211(I0表示了最初的ECL 強度，I表示CoA-Ag 增加的ECL 強度)，檢出限(LOD)為0.03 μM(S/N=3)。

為了進一步探索傳感在生物樣品中的應用，在反應體系中加入10%的血清，用該方法測出的含量與CoA 分析試劑盒測得的含量進行比較，獲得令人滿意的數據。

電化學發光(ECL)結合電化學和光學技術，具有操作簡單、響應快、低背景、高靈敏度和低儀器要求等優點，但是它的實驗過程復雜。

1.2 熒光分光光度法

熒光光譜法以其靈敏度高、選擇性好、檢出限低、簡便易行等優點，從而被廣泛應用于輔酶A的檢測。

1.2.1 研究實例一

2007 年，Qian 等人在pH=6.80 緩沖溶液中使用銪(Eu3+)-四環素(TC)絡合物作為熒光探針，輔酶A 可顯著提高添加H5IO6后Eu3+-TC 絡合物在λ =612 nm 的熒光強度，增強的熒光強度與輔酶A 的濃度成正比。

在CoA-H5IO6-buffer-Eu3+-TC 系統中，當H5IO6為3.59×10-5~6.46×10-5mol/L 時，ΔF達到最大并保持不變。在最佳實驗條件下，增強熒光值（ΔF） 和輔酶A 的濃度之間有一個很好的線性關系，線性范圍為6.08×10-8~ 1.84×10-5mol/L，檢出限為4.62×10-8mol/L。實際樣選用了成都天臺山藥業有限公司注射用輔酶A、人血清和豬肝，實驗結果準確。

1.2.2 研究實例二

2007 年，Li 等人建立了一種測定微量輔酶A(CoA)的熒光分光光度法。在pH=5.4 的緩沖溶液中，當高碘酸(H5IO6)存在時，CoA 可以顯著增強添Tb3+- 環丙沙星(CIP)絡合物在545 nm 處的熒光強度，Tb3+離子的增強熒光強度與CoA 的濃度成正比。測定CoA 的線性范圍和檢出限分別為6.08×10-6~1.64×10-5和2.1×10-8mol/L。

Li 等人選擇CIP 作為Tb3+的配體，并研究了在H5IO6存在的情況下，CoA 作為協同配體對Tb3+熒光有增強作用。在335 nm 處激發后，在545 nm處測量熒光強度。檢測機理推測為CIP 可以與Tb3+離子形成穩定的二元絡合物，在490 和545 nm 處觀察到Tb3+離子的特征峰，分別來自于Tb3+離子的5D4-7F6和5D4-7F5躍遷。

加入H5IO6后，(Tb3+-CIP)*的熒光強度明顯降低。H5IO6-(Tb3+-CIP)*-CoA 體系的熒光光譜與H5IO6-(Tb3+-CIP)*相似。但在CoA 作用下，H5IO6-(Tb3+-CIP)*的熒光強度明顯增強，Tb3+離子的熒光強度增強與CoA 濃度成正比，說明在H5IO6作用下，CoA 可以與(Tb3+-CIP)*絡合物形成非常穩定的三元復合物。

但在沒有H5IO6的情況下，添加CoA 后Tb3+-CIP 體系的熒光強度變化不大。在H5IO6存在的情況下，pH 值對(Tb3+-CIP)* 和(Tb3+-CIP)*-CoA 體系的熒光強度有顯著影響。H5IO6-(Tb3+-CIP)*CoA(F)和H5IO6-(Tb3+-CIP)*(F0)體系的熒光強度隨pH 值的變化而變化。實驗結果表明，在pH=5.4 時，ΔF(F-F0)達到最大值。

隨著H5IO6的加入量的增加(從0.1 mL 到0.7 mL)，(Tb3+-CIP)*(F0)的熒光強度開始急劇下降，而CoA-(Tb3+-CIP)*(F)的熒光強度變化不大。當H5IO6加入量＞1.5 mL 時，F明顯降低，F0變化不大。因此，選擇1.0 mL H5IO6(濃度為5.3 ×10-5mol/L)時，F0明顯下降，F保持恒定，ΔF值大大增強。

在H5IO6存在的情況下，反應時間對(Tb3+-CIP)*和(Tb3+-CIP)*-CoA 體系的熒光強度有影響。螯合反應在室溫下20 min 內完成，熒光強度達到最高值，并保持至少180 min。因此，所有螯合反應均在室溫下進行30 min，所有測量均在室溫下3 h 內完成。

實際樣選擇了由安徽豐元藥業有限公司生產的注射用輔酶A，并用酶法進行了對照；豬肝樣品用加標回收實驗來驗證方法的準確度，實驗結果令人滿意。

1.2.3 研究實例三

近年來，雜原子摻雜被認為是改善CDs 光學性質和提高CDs 量子產率(QY)的一種有前途的方法。特別是氮(N)原子由于與碳原子大小相似，可以與碳原子發生強烈的結合，因此，N- 摻雜的CDs(N/CDs)具有更高的熒光量子產率(QYs)。

而硫(S)原子可以調節態密度，提供發射陷阱態(ETSs)，這導致電子被激發來修正帶隙能。因此，S 摻雜可以使CDs 的最大熒光發射波長變長，提高CDs 的熒光強度。

2017 年，Hu 等人提出了一種S 和N 共摻雜熒光碳點(S,N/CDs)的制備方法。該方法以2 種天然物質(菱角和洋蔥)為前體，通過對菱角和洋蔥的水加熱，得到了單分散、高熒光的S,N/CDs(直徑約為3.5 nm)。S,N/CDs 表面的羧基可以與Cu(II)離子結合，導致S,N/CDs 的發光猝滅，而輔酶A (CoA)可以恢復(S,N/CDs)的發光，基于S,N/CDs 上述的特性，提出了一種新穎的熒光探針以用于CoA 高靈敏度的測定。

在最佳條件下，線性范圍和檢出限分別是0.03~40 μM 和0.01 μM。S 和N 被用作雜原子來合成S 和N 共摻雜的CDs (S,N/CDs)，S,N/CDs-Cu(II)作為熒光探針檢測CoA 時的熒光機制。

S,N/CDs 在370 nm 光激發下發射出很強的藍綠色熒光，加入Cu(II)離子后，藍綠色熒光明顯減弱。這一結果驗證了Cu(II)離子可以猝滅S,N/CDs 的發光，因為Cu(II)離子很容易與S,N/CDs 表面的羧基和羥基螯合，形成無輻射絡合物[(S,N/CDs-Cu(II)]。無輻射絡合物的形成，改變了S,N/CDs 表面的缺陷和激子分布，導致了熒光猝滅，使發光達到“關閉”狀態。

加入CoA 后，Cu(II)離子從S,N/CDs-Cu(II)絡合物中分離出來，CoA 分子中的硫醇基團與Cu(II)離子發生強烈結合，形成更穩定的Cu(II)鍵，使S,N/CDs 的發光恢復到“打開”狀態。

為進一步證實上述猝滅機制，檢測了不同濃度Cu(II)離子存在時S,N/CDs 的熒光壽命。加入猝滅劑后，如果熒光壽命降低，則為動態猝滅；如果熒光壽命不變(τ0/τ=1)，該系統是靜態猝滅。

實驗結果表明，熒光壽命發生了微小變化，說明Cu(II)猝滅S,N/CDs 熒光是一個靜態猝滅過程，因為它形成了一個穩定的無輻射絡合物。

隨著CoA 濃度的增加，S,N/CDs 的熒光信號逐漸恢復。體系的熒光強度的增強值與輔酶A 濃度顯示了良好的線性關系，線性范圍為0.03~40 μM，檢測限為0.01 μM。實際樣為豬肝，加入的標準為1.50×10-7mol/g，回收為3.00×10-7mol/g，回收率為102.2%，相對標準偏差為2.4%。

該法的最大特點是在加入添加銅(II)離子后，熒光信號逐漸減少，在約6 min 時達成平衡，6 min后保持不變，猝滅熒光時間令人滿意。在S,N/CDs-Cu(II)中加入輔酶A 后，熒光迅速在1 min后恢復，反應時間非常短，但線性范圍較窄。

迄今為止，各種熒光探針，如熒光染料、熒光蛋白、熒光無機或有機納米顆粒，已經成功開發和應用。在制備的熒光探針中，如碳點(CDs)，是一種新型的零維碳納米材料，因其制備簡單、獨特的光學性質和高耐光性、低生物毒性和優良的生物相容性等獨特優點，而受到了廣泛的關注。

1.2.4 研究實例四

2020 年，Long 等人設計了一種新型的白胡椒衍生比率型碳點(CDs)，量子產率為10.4%，作為高校特異檢測CoA 的熒光納米傳感器。

首先，將16 種金屬離子(40 μM)分別添加到CDs 溶液中，只有當Cu2+加入后，CDs 的原始熒光強度在520 nm 處猝滅。當Cu2+的濃度從0 逐漸增加到65 μM 時，CDs 的熒光強度在520 nm 逐漸下降；當Cu2+的濃度從65 μM 不斷增加到80 μM 時，CDs 的熒光強度并沒有發生明顯的減少，同時，最大發射波長發生藍移。

添加Cu2+(65 μM)進入CDs 溶液(2.0 mg/mL)中，最大紫外吸收波長(261、310 和343 nm)沒有變化，吸收強度降低，而熒光壽命從4.31 ns 降低到4.19 ns。猝滅機理推測為CDs 表面基團(如-COOH、-OH、-NH2)與Cu2+之間存在親和作用而發生靜電相互作用，無輻射電子轉移進而導致熒光猝滅。輔酶A含有巰基、磷酸基和氨基，由于其易與Cu2+結合形成更穩定的絡合物，迫使Cu2+從CDs 中分出來，此時CDs 表面不再含有Cu2+，CDs 的熒光得到恢復。

與預期一樣，Long 等人觀察到在CDs-Cu2+溶液中加入CoA 后，熒光強度和熒光壽命得到恢復。生物硫醇(如Hcy、GSH、Cys)也有硫醇基團，前人報道由于硫醇基團與金屬離子(如Hg2+、Cu2+)有很強的結合作用，形成穩定的S-Hg2+/S-Cu2+絡合物，但硫代反應型熒光傳感器的特異性較差。

而論文中的CDs-Cu2+很少對生物硫醇有反應，更不用說其它沒有巰基的氨基酸。可以推測，輔酶A 比生物硫醇有著更強的結合CDs-Cu2+的能力，生物硫醇不能還原猝滅的熒光。因此，在濃度范圍(0~150 μM)內，相對熒光強度比(F520/F668)與CoA濃度呈極好的線性相關關系，檢出限＜8.75 nM。

為了探索白胡椒衍生CDs 的實用性，該方法選取了2 個豬肝樣品，回收率為93.3%~108.0%，相對標準偏差(RSD)為2.3%~4.5%。

1.3 酶反應法

1988 年，K.M.Knights 等人研究了一種單步酶反應，即由細菌產生的酰基輔酶A 合成酶催化棕櫚酸和輔酶A 形成棕櫚酰輔酶A。在必要的輔助因子存在的情況下，酶促反應依賴于輔酶A 的濃度。實驗證實，棕櫚酰輔酶A 的形成依賴于ATP、MgCl2、輔酶A 和酰基輔酶A 合成酶的存在。

當脫磷酸輔酶A、乙酰輔酶A 或取代輔酶A(CoA-SS-CoA)作為酰基受體時，反應并沒有繼續下去(沒有棕櫚酰輔酶A 形成)。優化出的實驗條件為pH=8.4、6.2 mM MgCl2、0.05% Triton X-100 和10 min 孵育。

該方法在1~250 pmol 范圍內定量輔酶A 時得到的標準曲線，相關系數和變異系數分別為0.999和4.2%。棕櫚酰輔酶A 的形成雖然與輔酶A 濃度線性相關，但未表現出化學計量關系，因此，需要一個標準的曲線來定量組織提取物中的輔酶A。

當加入150 pmol/mL~12.5 nmol/mL 范圍內的勻漿時，從大鼠肝臟勻漿(6.6%)中輔酶A 的回收率為99.1±3.6%(平均值±SD,n=5)。此外，在等物質的量濃度輔酶A 的反應混合物中加入乙酰輔酶A、脫磷輔酶A 或CoA-SS-CoA，沒有顯著的的棕櫚酰輔酶A 形成。

結果表明，在所述實驗條件下，使用的二硫蘇糖醇濃度并不促進硫酯向輔酶A 的轉化。將該方法應用于大鼠肝組織勻漿、線粒體和肝細胞游離濃縮物濃度的測定，驗證了該方法的有效性。

使用終點磷酸轉乙酰酶測定時，大鼠肝臟的輔酶A 含量約為156 nmol/g。當使用K.M.Knights 等人的技術測定肝勻漿樣品中輔酶A 含量時，其值為106.9±21.8 nmol/g。

兩種方法測得肝臟中輔酶A 的濃度之間的差異可以根據動物的代謝狀態(喂或不喂)的差異來解釋。與從腎移植供體獲得的樣本(91.9±6.2 nmol/g)相比，死后獲得的人肝組織輔酶A 含量降低(66.1± 3.7 nmol/g)，表明死后輔酶A 丟失。然而，在-80 ℃儲存5 周之前和之后進行檢測，結果顯示，輔酶A 的損失最小，之前為89.5 nmol/g，而之后為83.6 nmol/g。

此分析方法為測定肝勻漿和分離的線粒體和肝細胞懸浮液中的輔酶A 提供了一種非常靈敏的技術手段。

1.4 色譜法

高效液相色譜(HPLC)是最常用的分離方法，可與不同的檢測器相結合。

1996 年，A. H.Lokkerbol 等人建立一套分析CoA 代謝所涉及各種輔酶A-酯底物和產物的分析體系，建立檢測17 個短鏈輔酶A 酯的高效液相色譜體系。

所有HPLC 分析均在室溫下進行，采用十八烷基硅膠柱，磷酸鈉緩沖液和乙腈梯度洗脫。使用0.2 M、pH=5.0 磷酸鈉緩沖液-乙腈(100∶5)洗脫液，在22 min 即可完成測定，但待分析混合物中的dPCoA 酯的分辨率沒有達到效果。

用甲醇代替乙腈作為有機溶劑進行洗脫，不僅能改善峰形，還能使乙酰乙酰輔酶A 和乙酰輔酶A 達到較好的分離效果。

實驗選用pH=5.0 緩沖液-甲醇(100∶20)組成的洗脫液，輔酶A 和乙酰輔酶A 的k'（容量因子） 值分別為1.3 和3.8，10 min 內完成分離(流速為1.5 mL/min)。此外，使用含甲醇的洗脫液，即使有機溶劑含量的微小變化，也不會導致保留時間的顯著變化。

研究了CoA 酯注入濃度與檢測器輸出量之間呈良好的線性關系，范圍在0.5~10 nmol 之間，檢出限為2.5 pmol。

雖然色譜法經典，但往往需要濃縮過程來提高檢測的靈敏度，從而導致樣品嚴重受損。而且，該方法也相對復雜，需要昂貴的儀器和訓練有素的技術人員來操作。

1.5 毛細管電泳

毛細管電泳(CE)在分離方法方面優點很多，如試劑和樣品用量小，分離效率高，節省時間等。CE 也有一定的局限性，尤其是在靈敏度高的檢測中，所用的毛細管內徑很小(50-75 μm),只允許體積小的樣本被注入系統中。由于毛細管體系的樣品注入量低(以納升為單位)，CE 常與高靈敏度檢測器聯用。

紫外光譜法（UV） 以其低成本、易操作等優點，可與色譜等先進技術結合起來，而成為一種檢測手段。

1.5.1 研究實例一

2003 年，Liu 等人首次用254 nm 的紫外檢測-毛細管電泳法對12 種不同的CoA 進行了分離和定量。所有12 個CoAs (輔酶A、戊二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A、琥珀酰輔酶A、甲基巴豆酰輔酶A、異丁酰輔酶A、氧化輔酶A、乙酰輔酶A、巴豆酰輔酶A、n-丙酰輔酶A、乙酰乙酰基輔酶A、丙二酰輔酶A)均在-30 kV 條件下，在含有0.1% β- 環糊精的100 mM NaH2PO4運行緩沖液中被完全分離。總分離時間＜30 min，信號響應在2個數量級(1~100 nmol)上呈線性，檢測限在皮物質的量范圍內。

研究了4 種不同緩沖濃度(25、50、75 和100 mM)來比較12 種CoAs 的分離效率和峰間分辨率。通過一系列實驗發現，CoAs 的分離對磷酸鹽濃度非常敏感。隨著緩沖液濃度的增加，各CoA 的洗脫順序不變，分離效率和峰形均有較大提高。隨著緩沖液濃度在100 mM 以下逐漸降低，峰寬越來越寬，分辨率越來越差。CoAs 的遷移可能是通過氫鍵或絡合物的形成與磷酸基密切相關。

優化出磷酸鹽(pH = 6.0)最佳濃度為100 mM。然而，在高緩沖濃度下，高壓會產生大量的焦耳熱，最終影響分離效率，導致電流擊穿。為了解決這個問題，在整個分離過程中，使用了冷卻系統使分離柱保持在15 ℃。

此外，經過3 次運行后，緩沖溶液兩邊的離子強度不再平衡，導致分辨率較差。因此，每3 次運行就替換1 次緩沖液，以保持良好的分離條件。

緩沖液pH 在可電離分析物的分離中起著重要的作用，因為它決定了每一種分析物的電離程度，同時也影響著毛細管壁的表面。

檢測了8 個CoA 化合物的pH 值，范圍為3.5~7.0，隨著緩沖液pH 值的增加，分離功率也隨之增加。然而，當緩沖pH 值＞6.5 時，遷移時間急劇增加。因此，為了在合理的時間內獲得較好的分離效果，優化pH 值，最佳pH=6.0。

沒有任何添加劑，CoAs 是無法分離的。Liu 等人檢測了各種添加劑，如SDS，β-CD，PVP，PEO。經過一系列的設計實驗，Liu 等人發現只有β-CD可以有效的分離所有的CoAs。為了在最小的基線噪聲和合理的洗脫時間(＜25 min)內實現良好的分離，接下來的研究中將β-CD 濃度維持在0.1%。利用毛細管電泳研究了β-CD 輔助分離對手性和非手性分子的影響。

高效毛細管電泳-紫外檢測法測定輔酶A 的線性范圍為1~100 nmol，相關系數為0.988，檢出限為55 pmol。實際樣為大鼠肝臟，測得輔酶A 的濃度為10.35±1.14 nmol/g。

雖然CE-UV 可成功用于測定輔酶A，但其還存在一些固有的缺陷，如毛細管直徑小，容量受限，光程短，于紫外檢測器的靈敏度較低。

1.5.2 研究實例二

2010 年，Yongqing Jiang 小組報道了毛細管電泳-激光誘導熒光檢測植物組織中短鏈輔酶A 的分離與定量研究。

在各種組織中測量短鏈和長鏈CoA 化合物的高效液相色譜(HPLC)和毛細管電泳-紫外(CE-UV)檢測已被報道，但這些技術不允許同時敏感地測定所有可能在植物組織中共存的CoA 及其衍生物。

在該文中建立了毛細管電泳結合激光誘導熒光檢測器(CE-LIF)定量測定植物組織中5 種短鏈CoAs。在優化衍生化和電泳條件下，用熒光素-5-異硫氰酸酯(FITC)衍生CoAs 后使用75 mm (i.d.)、57 cm 的熔融石英毛細管和150 mM 硼酸鹽緩沖液(pH=9.00)作為背景電解質進行分離和定量，在皮物質的量水平上，分離過程在25 kV 下進行，不到13 min 就完成了。

衍生化時間、緩沖液濃度和pH 值對衍生化效率的影響也進行了系統的研究，5 種短鏈CoAs 檢出限達到0.26~1.37 nmol/L。

1.6 液質聯用儀

2015 年，Neubauer 等人建立了一種基于液相色譜串聯質譜檢測(LC-MS/MS)相結合的代謝物分析方法，解決了細胞內輔酶A(CoA)、輔酶A 二硫和短鏈酰基輔酶A 硫酯的絕對定量問題。

作者利用反相色譜分離方法，沒有使用離子對試劑(該方法的一個關鍵優勢)，就能分離出CoA 及其相應的衍生物和同分異構體。離子強度和水相的pH 值對色譜有很大的影響。在較低的pH 值和離子強度溶液中，出現大量的峰尾。為避免較高的pH 值和離子強度，常用乙腈作為有機相保證最佳的分離效率。

Neubauer 等人提出了用甲醇代替乙腈的色譜法，并結合ICP-MS 對CoA 進行磷和硫的絕對定量分析。LC 與MS/MS 方法相結合，將其應用于細胞提取物中CoA 的分析。

Neubauer 等人定義了CoA 定量的關鍵因素，即標準純度、溶液穩定性和正確選擇內部標準。觀察標準中iso-CoAs 的發生情況，通過優化色譜，消除了它們對準確定量的潛在負面影響。

由于游離輔酶A 是酰基輔酶A 標準品中不可避免的雜質，因此，必須使用單獨的標準溶液對其進行定量，并成功使用了含有CoAs 的全標記U13C 細胞提取物作為內標物。

此外，內部標準化使得研究代謝物(琥珀酰輔酶A 除外)的測量周期為30 h。利用市場上可以買到的標準物質，制得標準溶液，測得100 mol/L 的輔酶A 的信噪比（S/N） 為14，檢出限為3.8 nM，檢測極限為12.5 nM，相對標準偏差為7.4%。

1.7 比值比色法

2016 年，Wu 等人介紹了一種利用金納米粒子(AuNPs)和雙鈾酰雙硫磷(BUBSS)作為光學探針，采用比色法測定CoA 的方法。

BUBSS 是一種雙核鈾酰絡合物，由2 個鈾酰離子和雙硫磷酚螯合反應形成。首先，CoA 通過巰基被AuNPs 捕獲，形成CoA-AuNPs；然后，BUBSS 通過鈾酰離子與CoA-AuNPs 中的磷酸基團發生配位反應，將2 個CoA-AuNPs 結合在一起，這就引起CoA-AuNPs 聚合，并導致溶液的顏色從葡萄酒紅色變為藍色。

基于在650 和525 nm 吸光度比值(A630/A525)變化的測定，建立了CoA 的比值比色法。線性范圍為0~1.2 μmol/L，檢測限為6 nmol/L。該方法成功地應用于加標肝臟樣品中CoA 的測定，回收率為99.4%~102.6%。

以上綜述的每一種方法都各有其優缺點，本文對其進行了分析。測定方法的線性范圍、檢出限和所用材料或技術見表1。

表1 幾種CoA 測定方法的比較Table 1 Comparison of some methods used for CoA determination

由表1 可以看出，熒光分光光度法具有方法簡單、靈敏度高、選擇性高、檢測限低和成本低等優點，現已成為一種最具吸引力的方法。

2 結 語

本文綜述了1988 年以來各種測定輔酶A 的方法，僅有13 篇文獻報道，說明輔酶A 的檢測技術還待進一步的開發，希望該綜述能為有興趣的研究學者提供一些有用的參考。

本文詳細評價了各種技術的優缺點，發現：

（1） 電化學法靈敏度差，不適合常規的痕量分析。

（2） 高效液相色譜法和毛細管電泳法具有檢測限低、較高的靈敏度和選擇性等優點，但也存在儀器復雜、成本高、操作技術門檻高等缺點。

（3） 比色法是相對簡單和廉價的選擇，但它們對量化痕量輔酶A 還不夠敏感。

（4） 液質聯用儀的測定不僅耗時，衍生化，樣品還需專門地進行預處理、水解等。

（5） 酶反應法要求輔酶A 的濃度非常低，適合痕量分析，但難出現化學計量關系。

與上述各法相比，熒光分光光度法因其簡單、方便、高靈敏度和高選擇性、低檢測限和低成本等優點而得到了廣泛的應用。

自從2007 年熒光法測定輔酶A 報道以來，越來越多的熒光探針相繼涌現。2020 年報道的白胡椒碳點法是所有檢測方法中線性范圍最寬、靈敏度最高的熒光法。因此，高靈敏度和選擇性的熒光探針在輔酶A 的熒光分光光度法的發展中起著關鍵的作用。

鑒于碳點是一類既有納米材料的獨特性能，又有催化或光學功能的零維碳材料，如何把碳點的這種雙功能特性巧妙地結合起來，創造出更多奇特功能的碳點，揭示其作用機制，并將其應用于輔酶A的測定，是今后有待研究的新課題。