基于響應面優化杜仲多糖提取工藝的研究

朱 琳，郝曉亮，徐園園，田曉溪

（遼寧科技大學 化學工程學院，遼寧 鞍山 114051）

杜仲具有利尿、降壓、消炎、強身健體的功效，杜仲的葉和皮富含《中國藥典》中提到的多化糖合物，具有多種抗氧化成分，因此，杜仲在中藥材中用途非常廣泛，對于腰膝酸軟、畏寒怕冷、高血壓、風濕病，尤其是現代社會中，對于各種腰椎疾病、骨質疏松、骨關節疼痛、風濕痹痛，都可以起到很好的治療效果[1-3]。

多糖在抗癌抗病毒、免疫調節、降血糖等方面有很大的功效。本文先考察單因素乙醇濃度、料液比、提取時間對多糖提取率的影響，結合響應面法優化提取條件，對杜仲多糖的食品研究，醫藥研究等方面的效益增加有著重要價值[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲來源于市售，葡萄糖、苯酚、硫酸等均為分析純，由遼寧科技大學生物實驗室提供。

1.2 儀器與設備

KQ-250B 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產；UV-2000 紫外可見分光光度計，上海分析儀器總廠生產；JM-A1003 電子天平，諸暨市超澤衡器設備有限公司生產；多功能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司生產；HH-2恒溫水浴鍋：金壇市城東新瑞儀器廠生產。

1.3 試驗過程

1.3.1 杜仲粉的預處理

將杜仲放入多功能粉碎機內進行粉碎，重復3 次粉碎操作，過濾后置于干燥器中備用。

1.3.2 杜仲多糖提取

精確稱量0.5 g預處理后的杜仲粉，以不同濃度的乙醇溶液為提取溶劑，按工藝研究中的不同參數設定提取時間，提取結束后過濾得到杜仲粗多糖，記錄過濾后的溶液體積。

1.3.3 多糖含量與提取率的測定

準備2 支10 mL 容量瓶，標號1、2，取杜仲粗多糖1.0 mL于1 號容量瓶中，去離子水定容后超聲，取超聲后的樣液0.125 mL 于2 號容量瓶中，加入0.875 mL 去離子水，超聲，去離子水補至2 mL，再次超聲。超聲后的樣液中加入1.0 mL濃度為5%的苯酚，搖勻超聲后快速加入5.0 mL的濃硫酸，超聲后放入已設定40℃水浴鍋中水浴加熱15 min，取出后迅速冷卻至室溫，用2.0 mL 蒸餾水做空白調節透過率，調節在波長490 nm 處使用預熱好的分光光度計測定其吸光度，記錄，結合其余條件計算提取率。

1.4 杜仲多糖提取試驗

1.4.1 單因素試驗

將杜仲在粉碎機內粉碎。取杜仲粉末0.5 g 于磨口錐形瓶中，加入配好超聲后的乙醇溶液，加入根據設計得出后的料液比，在不同提取時間下提取多糖。試驗結束后分別對不同試驗得出得吸光度和剩余體積進行計算，得出多糖的提取率，初步確定各個因素的影響程度及較好的提取條件[6-7]。

（1）料液比的篩選。料液比分別設為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，提取時間30 min、70%乙醇溶液，得出不同料液比對多糖提取率的影響。

（2）乙醇濃度的篩選。乙醇濃度分別設為50%、60%、70%、80%、90%，在料液比1∶50（選擇最優料液比）、超聲提取30 min，得出不同乙醇濃度對多糖提取率的影響。

（3）超聲提取時間的篩選。超聲提取時間分別設為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，在料液比1∶50（選擇最優料液比）、乙醇濃度60%（選擇最優乙醇濃度），得出不同提取時間對多糖提取率的影響。

1.4.2 多糖含量的測定

多糖含量測定采用苯酚——硫酸法[3]，在490 nm波長處，將濃度（mg/mL）設為橫坐標，吸光值為縱坐標，作直線回歸，結果見圖1。

圖1 葡萄糖溶液標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose solution

多糖提取率計算公式：

式中：C——由葡萄糖標準曲線計算得到的多糖含量；V——提取液定容體積，mL；W——樣品取樣質量，g。

1.4.3 單因素試驗設計

用料液比1：50，提取時間為30 min，乙醇溶液濃度為60%作為基本條件，改變單因素中的不同水平，比較不同因素條件下對提取液中多糖類化合物的影響并檢測杜仲中多糖的提取率的大小。

1.4.4 響應面試驗設計

綜合單因素試驗的結果，使用Design-Expert 8.0.6 軟件設計響應面，以多糖提取率作為響應值，對不同乙醇濃度、料液比及提取時間3個因素做出改變，設計3因素3水平的響應面試驗[8]。

1.4.5 正交試驗

正交試驗，見表1。

表1 正交試驗表Tab.1 The rthogonal test table

2 試驗結果討論與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對杜仲多糖提取率的影響

由圖2 知，多糖的提取率隨著提取時間的延長呈先增大后減小的趨勢，在30 min 左右時，提取已經較為完全。后續提取率的下降可能由于超聲儀器長時間工作導致的升溫使多糖的內部結構發生改變。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 The effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

2.1.2 料液比對杜仲多糖提取率的影響

由圖3 知，料液比的增大，杜仲多糖提取率逐漸增大，當料液比為1∶50時，達到最大，此后有小幅度降低，分析可能由于料液比的增大導致后續過濾的困難。

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig.3 The effect of material liquid ratio on polysaccharide extraction rate

2.1.3 乙醇濃度對杜仲多糖提取率的影響

由圖4知，當乙醇濃度由50%上升到60%，提取率迅速增大，然后雖然乙醇濃度增加，但提取率呈下降的趨勢，可能由于乙醇濃度的增加導致多糖的活性和結構發生變化。

圖4 乙醇濃度對多糖提取率的影響Fig.4 The effect of ethanol concentration on polysaccharide extraction rat

2.2 響應面優化提取工藝

響應面的設計與結果見表2。

表2 響應面的設計與結果Tab.2 The design and the results of the response surface

經過多元回歸模擬分析，得到杜仲多糖提取率的預測值（Y）對編碼1.22A2-0.30B2-0.27C2-0.005AB-0.01AC-0.005B C+0.095A+0.19B-0.085C，對該回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表3 響應面試驗結果的方差分析Tab.3 The variance analysis of the response surface results

由表3 分析可知，模型P＜0.05，上述回歸模型差異顯著，說明杜仲多糖提取率的擬合方程可靠性很好，在擬合方程一次項A、B、C 中，A 的P值＜0.001，效果極顯著，可得出乙醇濃度對多糖的提取率相比于提取時間和料液比對多糖的提取率影響較大。

圖7 料液比和乙醇濃度對杜仲多糖提取率的影響Fig.7 Effects of solid liquid ratio and ethanol concentration on extraction rate of Eucommia ulmoides polysaccharide

根據響應面法對提取參數與杜仲多糖提取率之間的關系分析三維響應面圖，隨著乙醇濃度的增加和液料比的增加，多糖的提取率逐漸增加到一定值時，多糖的提取率開始下降。

圖8 提取時間和乙醇濃度對杜仲多糖提取率的影響Fig.8 The effect of extraction time and ethanol concentration on extraction rate of Eucommia ulmoides polysaccharides

隨著提取時間和乙醇濃度的增加，多糖的提取率逐漸增加。

圖9 提取時間和料液比對杜仲多糖提取率的影響Fig.9 The effect of extraction time and material liquid ratio on extraction rate of Eucommia ulmoides polysaccharides

隨著提取時間的增加和料液比的增加，多糖的提取率呈先增大后減小的趨勢

3 結論

以單因素試驗為基礎，進一步進行響應面試驗，對提取杜仲中多糖物質進行分析，優化工藝條件最后得出提取率最高的工藝為料液比為1∶60，乙醇濃度60%，提取40 min，多糖的提取率為44.53%。本研究為獲得經濟、簡單、穩定、可行的杜仲多糖提取工藝提供了參考依據，為杜仲多糖的醫藥、食品等產品的研發提供資料支撐。