miR-210 介導CH25H 免疫信號通路調控骨關節炎軟骨細胞增殖和凋亡新機制研究①

吳福順 宋 瑤 張 雪 金京春 （延邊大學附屬醫院免疫科，延邊 133000）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種與年齡相關的退行性疾病，主要表現為軟骨組織遭到破壞、滑膜炎癥、骨贅形成等，同時伴有疼痛、短暫晨僵和骨擦音等臨床癥狀，嚴重影響患者生活和工作［1］。目前研究表明骨關節形成由多因素導致，microRNAs（miRNAs）在多種疾病中均發揮重要生理調控作用，其在OA 發生發展過程中既有上調表達又有下調表達，最新一項研究已經證實miRNA-138-5p可促進軟骨細胞增殖改善OA 炎癥環境［2］。OA 同時由免疫信號調節失衡造成大量炎癥因子分泌所導致［3］。miR-210已被證實有調控細胞增殖作用，但其是否通過調控免疫相關信號通路發揮抗炎促增殖作用鮮有報道。本研究旨在明確miR-210 對OA 軟骨細胞增殖和凋亡調控的新機制。

1 材料與方法

1.1 材料 12 只10 周齡SD 雄性大鼠購自延邊大學實驗動物中心；0.25%胰酶（03-052-1A/B）購自Biological 公司；0.2%Ⅱ型膠原酶混合液（BJ-X0541）購自邦景公司；胎牛血清（F8318）、DMEM（D6429）購自Sigma公司；Weigert染液（JA1021）、番紅O染液（JA1987）購自佳維斯公司；IL-6（ab233706）、MMP-3（ab285407）、CH25H（ab214295）、山 羊 抗 兔IgG（ab150077）、DAB（ab64238）購自Abcam 公司；TRIzol（15596026）、氯仿（10296028）購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 12 只SD 大鼠隨機分為sham 組和OA 組，每組6 只。所有大鼠均飼養于23 ℃、相對濕度55%、噪音85 分貝以下環境中，每12 h 通風換氣1 次。每天加水2 次，每天更換1 次墊料，室內光線陰暗。所有大鼠均按照延邊大學動物倫理委員會要求規范飼養和操作。

1.2.2 Hulth 法構建OA 大鼠模型 3%戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉大鼠，后肢膝關節處采用Hulth 法造模［4］。具體步驟：OA組大鼠后肢兩側切開2 cm左右切口，剝離并切斷交叉韌帶和內側副韌帶，剝離整個半月板，不損傷膝關節軟骨面，隨后縫合消毒。sham 組大鼠僅進行皮膚切開術后立即縫合。術后均注射青霉素抗感染，連續注射3 d，分籠單獨飼養。

1.2.3 分離原代軟骨細胞 取大鼠后肢膝關節消毒，超凈臺內剪碎膝關節軟骨，采用含0.25%胰酶和0.2%Ⅱ型膠原酶混合液玻璃皿內消化4 h。無菌濾網過濾，4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，采用含10%胎牛血清的DMEM 培養液重懸，細胞培養箱內培養，觀察細胞生長狀態。

1.2.4 HE染色 取SD大鼠后肢關節脫鈣處理，石蠟包埋，切片，脫蠟，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化5 s；去離子水洗片、氨水處理后水洗，伊紅染色5 min，水洗，乙醇、二甲苯處理，烘干樹脂封片。

1.2.5 番紅O-固綠染色 取SD 大鼠后肢關節脫鈣處理，石蠟包埋，切片后脫蠟。Weigert 染液染色5 min，酸性乙醇分化液分化15 s，洗片后固綠染液染色5 min，洗片，番紅O染液染色2 min，洗片、乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。

1.2.6 免疫熒光 將軟骨細胞鋪至含0.1%膠原涂層的玻璃蓋玻片，待細胞密度達60%左右采用預冷的甲醇和丙酮混合液（1∶1）進行固定，1%TritonX-100/PBS 中透化，洗片擦干后加入IL-6 和MMP-3（1∶1 000）抗體4 ℃孵育過夜。次日4%多聚甲醛固定4 h，含15%蔗糖的PBS孵育4 h，去離子水清洗玻片，激光共聚焦掃描分析切片。

1.2.7 CCK-8檢測細胞增殖 細胞按5 000個/孔接種至96孔板，設3個復孔。sh-miR-210、NC-miR-210、mimics-miR-210 Lipofectamine3000 轉染軟骨細胞成功后，分別在0 h、12 h、24 h、36 h 和48 h 時20μl/孔加入CCK-8反應液37 ℃孵育2 h，酶標儀測定450 nm處吸光度。

1.2.8 流式細胞術 按照1.2.7轉染細胞。軟骨細胞接種至6 孔板，細胞密度生長至60%左右收集細胞，加入5μl Annexin V-FITC 避光孵育10 min，再加入10μl碘化丙啶染液避光孵育15 min，流式細胞儀分析。

1.2.9 免疫組化 關節脫鈣處理，石蠟切片脫蠟至水，修復抗原，阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉，加入CH25H一抗、二抗，DAB顯色，細胞核復染，脫水，切片掃描儀掃描分析。

1.2.10 RT-PCR 采用TRIzol和氯仿用提取RNA，RNA 逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為性質穩定的cDNA，qRT-PCR儀檢測目的基因相對表達，以β-actin為內參。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃退化10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s。2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.11 Western blot 調整細胞密度為5×104個/ml，細胞匯合度達70%時收集細胞，冰上裂解30 min，4 ℃、8 000 g 離心吸取上清，提取總蛋白，蛋白定量后計算，加入上樣緩沖液，100 ℃煮5 min，SDS-PACE凝膠電泳，電泳結束后將目的蛋白轉至PVDF 膜，脫脂牛奶封閉，加入IL-6、MMP-13 和CH25H 一抗孵育過夜，次日加入二抗孵育，PBS 清洗，ECL 發光儀發光拍照。

1.3 統計學分析 數據應用SPSS20.0軟件進計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-210 在OA 體內外模型中表達下調 HE染色結果顯示，與sham 組相比，OA 組大鼠軟骨細胞顯著肥大且排列無序（圖1A）；番紅O-固綠染色結果顯示，OA 組大鼠軟骨組織出現明顯骨侵蝕（圖1A）。免疫熒光鑒定軟骨細胞標志物Ⅱ型膠原表達，結果顯示，軟骨細胞胞漿和胞膜處分布Ⅱ型膠原（P＜0.05，圖1B）。RT-PCR 結果顯示，OA 組大鼠軟骨組織和IL-1β 的刺激軟骨細胞內miR-210 表達均顯著降低（P＜0.05，圖1C、D）。體內外實驗結果均提示miR-210與OA密切相關。

圖1 大鼠軟骨組織染色及miR-210表達Fig.1 Staining of cartilage and miR-210 expression of rats

2.2 miR-210 促進軟骨細胞增殖 sh-miR-210、NC-miR-210 和mimics-miR-210 分別轉染軟骨細胞，RT-PCR 結果顯示，sh-miR-210 顯著降低軟骨細胞miR-210 表達，mimics-miR-210 顯著增加軟骨細胞miR-210 表達（P＜0.05，圖2A）；CCK-8 結果顯示，軟骨細胞增殖能力隨著miR-210 表達沉默而降低，隨著miR-210 過表達而增強（P＜0.05，圖2B）；細胞凋亡趨勢則與之相反（P＜0.05，圖2C）。

圖2 miR-210對大鼠軟骨細胞增殖的影響Fig.2 Effects of miR-210 on proliferation of chondrosto?cytes of rats

2.3 miR-210 抑制免疫細胞因子IL-6 和MMP-13 表達 免疫熒光結果顯示，IL-6 和MMP-13 在IL-1β 刺激的軟骨細胞內表達均顯著增加，mimics-miR-210轉染后可抑制軟骨細胞IL-6 和MMP-13 表達，sh-miR-210 顯著增加IL-6 和MMP-13 表達（P＜0.05，圖3A、B）；RT-PCR 和Western blot 結果提示IL-6 和MMP-13 在OA 模型組軟骨組織中顯著增高（P＜0.05，圖3C、D）。提示miR-210 通過抑制細胞因子IL-6和MMP-13表達對OA軟骨細胞發揮保護作用。

圖3 miR-210對大鼠軟骨細胞IL-6和MMP-13表達的影響Fig.3 Effects of miR-210 on IL-6 and MMP-13 expressions in chondrocyte of rats

2.4 miR-210 抑制軟骨細胞CH25H 表達 CH25H可導致代謝紊亂參與OA 發生，Western blot 證實CH25H 在IL-1β 刺激的軟骨細胞內表達顯著增高（P＜0.05，圖4A）；Western blot（圖4A、B）和RT-PCR（圖4C）結果顯示，CH25H 表達隨著miR-210 沉默而增加，隨著miR-210 過表達而降低（P＜0.05）。提示CH25H在OA發生過程中受miR-210調控。

圖4 miR-210對大鼠軟骨細胞CH25H蛋白表達的影響Fig.4 Effects of miR-210 on CH25H protein expression in chondrocyte of rats

2.5 CH25H 部分抵消miR-210 對軟骨細胞的促增殖作用 為探索CH25H作用于miR-210的位置，采用IL-1β 刺激軟骨細胞，隨后共同轉染mimics-miR-210和CH25H 過表達質粒，結果發現miR-210 對軟骨細胞的促增殖作用被部分抵消（P＜0.05，圖5A）；共同轉染sh-miR-210和shRNA-CH25H質粒后，sh-miR-210抑制細胞增殖的作用可被shRNA-CH25H 部分恢復（P＜0.05，圖5B）。

圖5 CH25H 可部分抵消miR-210 對大鼠軟骨細胞增殖能力的影響Fig.5 CH25H partially counteracts effect of miR-210 on proliferation capacity of chondrocytes of rats

3 討論

軟骨細胞是軟骨組織中維持關節軟骨穩態的重要因素，研究證實軟骨細胞大量凋亡和免疫因子異常表達是OA 發生的重要因素［5］。OA 是老年人常見的一類骨科疾病，同時好發于運動員等運動量大導致關節損傷的人群［6］。研究報道mRNA 在多種細胞調控過程中發揮重要作用，同時參與OA 發生發展，但其具體調控機制尚不明確［7］。mRNA 通過調控細胞增殖分化和凋亡等作用參與多種疾病發生發展，是治療多種疾病的熱門候選靶點［8］。大量研究證實，多種mRNA參與OA發生過程，如miR-31-5p在OA 患者外周血中表達顯著增高，體外實驗表明miR-31-5p 對軟骨細胞增殖和分化起負調控作用，說明miR-31-5p 可促進OA 發生［9］。此外，miR-495通過抑制PI3K/AKT 信號通路促進軟骨細胞凋亡和老化而發揮促OA 發生作用，同時miR-27a 在OA 中的表達與上述mRNA 相反，呈下降趨勢，體外實驗證實增加miR-27a 表達可促進軟骨細胞增殖，抑制其凋亡［10-12］。提示mRNA 在OA 發生發展過程中發揮重要作用。

本研究發現miR-210 在OA 大鼠關節軟骨組織和IL-1β 誘導的體外軟骨細胞中表達均顯著降低。miR-210 已被證實對多種細胞起促增殖作用，但其對軟骨細胞增殖的影響如何尚不清楚。本研究通過增殖活力實驗和流式檢測觀察轉染sh-miR-210、mimics-miR-210 對軟骨細胞增殖和凋亡能力的影響，發現軟骨細胞增殖能力隨著miR-210 表達沉默而降低，隨著miR-210過表達而增強。IL-6和MMP-13是促進OA 發生的免疫細胞因子，在OA 中大量分泌和表達［13］。本研究發現，miR-210 能夠顯著降低OA標志細胞因子IL-6和MMP-13表達，證實miR-210參與OA 發生并發揮負調控作用，但并未明確其具體作用方式。進一步查閱文獻發現，CH25H 是參與OA 發生的經典免疫因子，可通過影響CH25HCYP7B1-RORα信號軸調控OA代謝，誘發OA［14］。

CH25H 是一類重要免疫調控因子，在多種疾病中異常表達可導致患者機體代謝紊亂，為疾病發生提供有利條件［15］。在風濕性關節炎中，CH25H 促進重要免疫因子IL-1β/TNF-α/IL-6 表達，導致患者代謝紊亂，促進風濕性關節炎發生發展［16］。免疫因素對OA 同樣重要。本研究顯示，miR-210 顯著抑制CH25H在體外軟骨細胞中表達，同時過表達CH25H可部分抵消miR-210 對軟骨細胞的促增殖作用，說明二者相互作用，但具體機制尚不清楚，將是下一步研究重點。

綜上所述，本研究明確miR-210在OA 體內模型中表達顯著下調，可能通過促進軟骨細胞增殖對OA 發生起促進作用，進一步發現miR-210 可能通過抑制免疫因子CH25H 發揮促軟骨細胞增殖作用。以上結果初步探討了miR-210 在OA 發生中起重要作用，為下一步研究奠定基礎，同時為OA 發病機制提供了新的理論依據。