阿糖胞苷通過調(diào)控miR-126表達(dá)抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究

林曉媛 王波濤 黨惠兵 （河南省南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，南陽 473000）

急性髓系白血病是臨床常見的一種急性白血病，近年來，急性髓系白血病發(fā)病率逐年上升，而骨髓移植或干細(xì)胞移植是主要治療方法，但移植易引起并發(fā)癥從而影響患者生活質(zhì)量［1-3］。臨床采用化療方法治療急性髓系白血病，但患者易產(chǎn)生化療耐受性從而降低治療效果，但調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)可逆轉(zhuǎn)化療藥物耐受性［4］。阿糖胞苷可能通過抑制cFLIP 基因表達(dá)從而誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡［5］。微小RNA-126（miR-126）在腫瘤中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。但阿糖胞苷是否通過調(diào)控miR-126表達(dá)從而影響急性髓系白血病細(xì)胞增殖及凋亡尚未可知。因此，本研究主要探討阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探究其對miR-126的調(diào)控作用，為進(jìn)一步闡釋阿糖胞苷治療白血病的分子機(jī)制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 阿糖胞苷購自美國Sigma 公司；人急性髓系白血病細(xì)胞HL-60 購自中科院上海細(xì)胞庫；杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000 購自北京索萊寶科技有限公司；miR-126 寡核苷酸模擬物（miR-126 mimics）及陰性對照mimic NC 序列（miR-NC）、miR-126 特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-126）及其陰性對照（antimiR-NC）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；甲基噻唑基四唑（MTT）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；Trizol 試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄、熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；兔抗人增殖標(biāo)記蛋白細(xì)胞增殖核抗原67（Ki67）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-caspase-3）抗體購自美國Santa Cruz 公司；兔抗人磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路相關(guān)蛋白磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體購自美國CST 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 HL-60 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液，使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行傳代，待細(xì)胞生長至70%融合度時將細(xì)胞接種于96 孔板（5×103個/孔），分別加入含有不同濃度（1、3、9μmol/L）的阿糖胞苷處理24 h［7］，分別記作1 μmol/L 阿糖胞苷組、3 μmol/L 阿糖胞苷組、9μmol/L阿糖胞苷組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組。后續(xù)實驗設(shè)置miR-NC組（miR-NC轉(zhuǎn)染至HL-60 細(xì)胞）、miR-126 組（miR-126 mimics 轉(zhuǎn)染至HL-60細(xì)胞）、anti-miR-NC 組（anti-miR-NC 轉(zhuǎn)染至HL-60細(xì)胞）、anti-miR-126組（anti-miR-126轉(zhuǎn)染至HL-60細(xì)胞）、阿糖胞苷+anti-miR-NC組（anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至HL-60 細(xì)胞，加入濃度為3 μmol/L 的阿糖胞苷處理24 h）、阿糖胞苷+anti-miR-126組（anti-miR-126轉(zhuǎn)染至HL-60 細(xì)胞，加入濃度為3 μmol/L 的阿糖胞苷處理24 h）。

1.2.2 MTT 檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個/ml，接種于96 孔板（100μl/孔），按照1.2.1 分組處理，分別向各孔加入20μl MTT 溶液，室溫培養(yǎng)4 h，棄上清，分別加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩孵育10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值（OD 值），計算細(xì)胞增殖率（%）=實驗組OD值/空白組OD值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組HL-60 細(xì)胞，預(yù)冷PBS 清洗，4 ℃下3 000 r/min 離心6 min，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入500 μl Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，參照細(xì)胞凋亡試劑盒分別加入5μl Annexin V-FITC 與5μl PI，充分混勻，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測miR-126 的表達(dá)水平 收集各組HL-60 細(xì)胞，采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA 濃度。反轉(zhuǎn)錄體系：5×g DNA Buffer 2μl，10×King RT Buffer 2μl，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1μl，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μl，RNA（2 μg），RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：42 ℃15 min，95 ℃3 min。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件均參照熒光定量試劑盒進(jìn)行操作。其中miR-126 正向引物5'-TACTTTTGGTACGCGCTGTG-3'，反 向 引 物5'-GC?TAGCTACGATCACACTACG-3'；U6 正 向 引 物5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。miR-126 以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-126相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blot 檢測Ki67、Cleaved-caspase-3、p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá) 收集各組HL-60 細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度，蛋白變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液（1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST 洗滌，曝光，顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60 增殖的影響 與NC 組比較，1μmol/L 阿糖胞苷組、3μmol/L 阿糖胞苷組、9μmol/L 阿糖胞苷組細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），Ki67 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 不同濃度阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60增殖的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of cytarabine on proliferation of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

表1 不同濃度阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60增殖的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of cytarabine on proliferation of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

Rate of cell proliferation/%100.25±9.68 88.66±7.251）51.32±4.011）42.38±3.111）165.567 0.000 Groups NC 1μmol/L cytarabine 3μmol/L cytarabine 9μmol/L cytarabine FP Ki67 0.85±0.07 0.72±0.061）0.37±0.021）0.31±0.031）255.031 0.000

圖1 Western blot檢測Ki67蛋白的表達(dá)Fig.1 Western blot was used to detect expression of Ki67 protein

2.2 阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60 凋亡的影響 與NC 組比較，1 μmol/L 阿糖胞苷組、3 μmol/L 阿糖胞苷組、9 μmol/L 阿糖胞苷組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖2、表2。

表2 阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60 凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of cytarabine on apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

表2 阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60 凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of cytarabine on apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

Apoptotic rate/%5.69±0.43 12.53±0.951）21.34±1.521）25.46±1.281）562.529 0.000 Groups NC 1μmol/L cytarabine 3μmol/L cytarabine 9μmol/L cytarabine FP Cleaved-caspase-3 0.33±0.03 0.46±0.041）0.75±0.071）0.88±0.081）154.326 0.000

圖2 阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60凋亡的影響Fig.2 Effects of cytarabine on apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60

2.3 阿糖胞苷對miR-126表達(dá)的影響 與NC 組比較，阿糖胞苷組miR-126 的表達(dá)水平顯著升高（1.00±0.08vs5.86±0.34，t=41.742，P＜0.05）。

2.4 miR-126 對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60 增殖和凋亡的影響 與miR-NC 組比較，miR-126 組細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Ki67 蛋 白 水 平 顯 著 降 低（P＜0.05），Cleaved-caspase-3 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-126 組細(xì)胞增殖率顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Ki67蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖3、表3。

表3 miR-126對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of miR-126 on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

表3 miR-126對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of miR-126 on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05；compared with antimiR-NC group，2）P＜0.05.

Apoptotic rate/%5.53±0.38 16.34±1.261）5.67±0.33 3.01±0.112）682.957 0.000 Groups Ki67 miR-NC miR-126 anti-miR-NC anti-miR-126 FP 0.85±0.07 0.46±0.031）0.82±0.08 1.05±0.092）106.936 0.000 Cleavedcaspase-3 0.35±0.03 0.76±0.061）0.33±0.02 0.11±0.012）529.140 0.000 Rate of cell proliferation/%100.33±9.24 44.27±3.241）101.57±9.83 136.12±10.292）174.323 0.000

圖3 Western blot檢測Ki67、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blot was used to detect expressions of Ki67 and Cleaved-caspase-3 protein

2.5 anti-miR-126 可以逆轉(zhuǎn)阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60增殖、凋亡的影響 與阿糖胞苷+anti-miR-NC 組比較，阿糖胞苷+anti-miR-126 組細(xì)胞增殖率顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Ki67 蛋 白 水 平 顯 著 升 高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖4、表4。

表4 Anti-miR-126可以逆轉(zhuǎn)阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.4 Anti-miR-126 could reverse effect of cytarabine on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

表4 Anti-miR-126可以逆轉(zhuǎn)阿糖胞苷對急性髓系白血病細(xì)胞HL-60增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.4 Anti-miR-126 could reverse effect of cytarabine on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia cells HL-60（±s，n=9）

Note：Compared with cytarabine+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

Apoptotic rate/%20.88±1.37 10.26±0.821）19.954 0.000 Groups Cytarabine+anti-miR-NC Cytarabine+anti-miR-126 tP miR-126 1.00±0.11 0.46±0.041）13.841 0.000 Ki67 0.40±0.03 0.72±0.061）14.311 0.000 Cleaved-caspase-3 0.77±0.07 0.35±0.031）16.545 0.000 Rate of cell proliferation/%51.38±4.03 85.26±7.161）12.371 0.000

圖4 Western blot檢測Ki67、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blot was used to detect expression of Ki67 and Cleaved-caspase-3 protein

2.6 PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 與NC組比較，阿糖胞苷組p-PI3K、p-AKT蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與阿糖胞苷+anti-miR-NC組比較，阿糖胞苷+anti-miR-126 組p-PI3K、p-AKT 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖5、表5。

圖5 Western blot檢測p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)Fig.5 Western blot was used to detect expressions of p-PI3K and p-AKT protein

表5 PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)（±s，n=9）Tab.5 PI3K/AKT signaling pathway related protein expression（±s，n=9）

表5 PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)（±s，n=9）Tab.5 PI3K/AKT signaling pathway related protein expression（±s，n=9）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05；compared with cytarabine+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

p-AKT 0.62±0.06 0.32±0.031）0.34±0.04 0.52±0.052）87.628 0.000 Groups NC Cytarabine Cytarabine+anti-miR-NC Cytarabine+anti-miR-126 FP p-PI3K 0.72±0.07 0.41±0.031）0.38±0.04 0.65±0.062）94.909 0.000

3 討論

急性髓系白血病屬于常見的惡性腫瘤之一，目前臨床采用氟達(dá)拉濱、地西他濱、高三尖杉酯堿等藥物劑型治療，可有效殺死白血病細(xì)胞，但存在較大的副作用，還可導(dǎo)致部分患者產(chǎn)生耐藥性［8-10］。因而積極探究化療藥物治療白血病的分子機(jī)制，試圖尋找其作用靶點，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)部分化療藥物的耐藥性，最終提高治療效果及增強(qiáng)化療藥物的敏感性。

阿糖胞苷屬于嘧啶類抗代謝藥物，其可殺傷腫瘤細(xì)胞，還可與順鉑聯(lián)用從而抑制鼻咽癌細(xì)胞生長及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11-12］。阿糖胞苷可抑制急性髓系白血病細(xì)胞生長，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PRDX 表達(dá)有關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示阿糖胞苷可顯著抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖，并可抑制Ki67 表達(dá)，研究表明Ki67 表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖［14］。本研究結(jié)果顯示阿糖胞苷可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)從而抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖。本研究進(jìn)一步分析顯示阿糖胞苷可顯著增高急性髓系白血病細(xì)胞凋亡率，并可促進(jìn)Cleaved-caspase-3 表達(dá)，已有報道指出caspase 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，線粒體損傷時可促進(jìn)細(xì)胞色素C 釋放至細(xì)胞質(zhì)從而激活caspase 級聯(lián)反應(yīng)，caspase 被激活后可形成Cleaved-caspase-3 等從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］。提示阿糖胞苷可能通過線粒體途徑從而誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡。

miR-126 卵巢癌中表達(dá)下調(diào)，LncRNA LNC01133 通過充當(dāng)miR-126 的海綿分子而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生［16］。miR-126 通過靶向ADAM9 抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移及侵襲［17］。LncRNA-XIST通過充當(dāng)miR-126的海綿分子從而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖［18］。本研究結(jié)果顯示miR-126過表達(dá)后細(xì)胞增殖率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Ki67 表達(dá)下調(diào)，Cleaved-caspase-3 表達(dá)上調(diào)，而抑制miR-126 表達(dá)后細(xì)胞增殖率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，Ki67 表達(dá)上調(diào)，Cleaved-caspase-3 表達(dá)下調(diào)，提示miR-126在急性髓系白血病發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮抑癌基因作用。同時本研究結(jié)果顯示阿糖胞苷處理后急性髓系白血病細(xì)胞中miR-126的表達(dá)水平顯著升高，由此推測阿糖胞苷可能通過促進(jìn)miR-126 表達(dá)從而抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為驗證上述推測，本研究將抑制miR-126 表達(dá)并使用阿糖胞苷處理，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，Ki67 蛋白水平顯著升高，Cleaved-caspase-3 蛋白水平顯著降低，提示阿糖胞苷可通過上調(diào)miR-126 表達(dá)從而抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明PI3K/AKT 信號通路被激活后可促進(jìn)前列腺癌、肝細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［19-20］。本研究結(jié)果顯示阿糖胞苷可顯著降低p-PI3K、p-AKT 的表達(dá)，而干擾miR-126 表達(dá)后可顯著促進(jìn)p-PI3K、p-AKT 表達(dá)，提示阿糖胞苷可能通過調(diào)控miR-126表達(dá)及抑制PI3K/AKT 信號通路的激活從而抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，阿糖胞苷可能通過上調(diào)miR-126 表達(dá)從而抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT 信號通路的激活有關(guān)，可為白血病的治療提供潛在靶點。但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。