LncRNA DANCR 靶向miR-656-3p 調控急性髓系白血病細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲

孔文燕 呂秋玲 肖 琛 （山東中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科，濟南 250001）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種常見的以骨髓和外周血中未分化的祖細胞累積為主要特征的血液惡性腫瘤，主要治療方法有化療和干細胞移植［1］。目前，AML 的治療取得一定進展，但對于難治復發患者治療效果較差［2］。AML的發生、發展與基因突變和基因的異常表達有關，探究AML 患者體內異常表達的分子及其對AML 發生發展的影響可為該疾病的治療提供新靶點［3］。長鏈非編碼RNA（long noncading DNA，LncRNA）可作為競爭性內源性RNA與微小RNA（microRNA，miRNA）靶向結合，調控miRNA 靶基因的表達，進而調控腫瘤細胞增殖、分化和凋亡等活動，參與腫瘤發展進程［4］。研究顯示，LncRNA DANCR 在化療耐藥白血病干細胞中表達上調，敲低其表達可降低白血病干細胞的自我更新能力，可能參與白血病的發展進程［5］。研究顯示，LncRNA DANCR 在肝細胞癌和肺癌等腫瘤中表達升高，敲低其表達可降低腫瘤細胞的增殖和侵襲，在腫瘤中發揮促癌基因作用［6-7］。但目前，LncRNA DANCR 對白血病細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等表型的影響還不清楚。

Starbase 生物信息學軟件預測顯示，LncRNA DANCR 可能與miR-656-3p 存在靶向調控關系。有報道稱，miR-656-3p 在非小細胞肺癌（non-small cell lung conter，NSCLC）患者癌組織中的表達明顯降低，過表達miR-656-3p 對NSCLC 細胞增殖和遷移發揮抑制作用［8］。但目前，miR-656-3p 是否影響白血病細胞的表型尚不清楚。因此，本研究首先檢測了53 例AML 患者外周血和細胞系中LncRNA DANCR和miR-656-3p的表達，并觀察了LncRNA DANCR 和miR-656-3p 對AML 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及LncRNA DANCR 能否靶向miR-656-3p 發揮作用，以期為AML的治療提供新的分子靶點。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選取2017年2月至2019年10月于山東中醫藥大學第二附屬醫院確診的53 例AML患者為研究對象（AML 組），其中男性32 例，女性21 例，平均年齡（46.23±12.02）歲；WHO 分型M1 型7例、M2型19例、M3型13例、M4型8例、M5型6例。另選取同時期健康體檢者為對照組，其中男性30例，女性23 例，平均年齡（48.26±13.28）歲。兩組患者年齡、性別等一般資料無顯著性差異，具有可比性。

1.1.2 細胞和試劑 AML細胞系（U-937、HL-60和NB4）及骨髓基質HS-5 細胞，上海邦景實業有限公司；RPMI1640 培養基、細胞計數試劑盒-8（CCK-8）、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國Invitrogen 公司；PCR 引物、LncRNA DANCR 小干擾RNA（si-LncRNA DANCR）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、miR-656-3p 模擬物（mimcs）及其抑制劑（anti-miR-656-3p）、模擬對照序列（miR-NC）及miR-656-3p 抑制劑陰性序列（anti-miR-NC）、LncRNA DANCR 野生型質粒（WT-LncRNA DANCR）和突變型質粒（MUT-LncRNA DANCR），上海生工生物工程有限公司；RNA 抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連生物工程有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，上海碧云天公司；兔抗人細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、活化的半胱天冬酶-3（cleaved-caspases-3），美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR 檢測外周血中LncRNA DANCR 和miR-656-3p 表達 采集對照組和AML 組患者外周血，用RNA 抽提試劑盒提取外周血中總RNA，并逆轉錄為cDNA，行PCR 擴增。擴增程序為95 ℃5 min；95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個循環。引物序列：LncRNA DANCR 正向引物5'-GC?CACTATGTAGAGGGTTTC-3'，反 向 引 物5'-ACCT?GCGCTAAGAACTGAGG-3'；miR-656-3p 正 向 引 物5'-CCGATACGAGCTGCAGAAG-3'，反 向 引 物5'-CGATACGACGCGCTCGACGAGAGG-3'；U6 正 向 引物5'-CGACTATACCCGCGCTAGCG-3'，反向引物5'-CGCTAGACGACGCTAAGAAG-3'；β-actin 正向引物5'-GTACGACTACGACGACGAG-3'，反向引物5'-CGACTACGACAACGGCTC-3'。2-ΔΔCt法 計 算LncRNA DANCR 相對于β-actin、miR-656-3p 以及β-actin、miR-656-3p相對于U6的表達水平。

1.2.2 細胞培養 復蘇U-937、HL-60、NB4及HS-5細胞，均用含10%FBS的RPMI1640培養基培養。將對數生長期的各細胞均以5.0×105個/孔接種于6 孔板中，培養24 h，收集細胞。RT-qPCR法檢測細胞中LncRNA DANCR 和miR-656-3p 表 達 水 平，方 法 同1.2.1 并選擇較HS-5 細胞表達差異最顯著的AML細胞系U-937進行后續實驗。

1.2.3 U-937 細胞轉染 將U-937 細胞接種于6 孔板中（5.0×105個/孔），用LipofectamineTM2000 脂質體轉染法，分別轉染si-LncRNA DANCR（si-LncRNA DANCR 組）、si-NC（si-NC 組）、miR-656-3p mimcs（miR-656-3p 組）、miR-NC（miR-NC 組）、共轉染si-LncRNA DANCR 與miR-656-3p 抑制劑（si-LncRNA DANCR+anti-miR-656-3p 組）、si-LncRNA DANCR 與miR-NC（si-LncRNA DANCR+anti-miR-NC 組），轉染時間為6 h。然后更換培養基，培養24 h 后，收集細胞，RT-qPCR法檢測細胞中LncRNA DANCR 或miR-656-3p 表達水平，驗證轉染效果，并用于后續實驗。同時設置對照組（NC 組），細胞常規培養，不進行轉染操作。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖 將各組細胞接種于96 孔板中（2.5×104個/孔），培養24 h。加10 μl CCK-8試劑。再孵育2 h，于酶標儀450 nm處測吸光度（A）值。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組細胞接種于6孔板中（5.0×105個/孔），培養24 h，收集細胞，PBS 清洗2 次。利用Annexin V-FITC/PI 試劑盒，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲 調整各組細胞密度為5.0×104個/ml。遷移實驗：Transwell 小室置于24 孔板中，上室加100 μl 細胞懸液，下室加500μl 培養基。培養24 h 后，棄培養基。經多聚甲醛固定30 min、結晶紫染色15 min 后，顯微鏡觀察，隨機取5 個視野，計數。侵襲實驗：預先在Transwell上室鋪Matrigel 基質膠，自然晾干后，加100μl 細胞懸液，后續操作同遷移實驗。

1.2.7 Western blot 法檢測細胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2 和MMP9 蛋白表達 將各組細胞接種于6 孔板中（5.0×105個/孔），培養24 h后，收集細胞。RIPA 試劑提取細胞中總蛋白，BCA法檢測蛋白含量后，行10%SDS-PAGE 電泳，并將分離蛋白濕轉至PVDF 膜。將PVDF 膜于5%脫脂奶粉中封閉1 h 后，分別于CyclinD1（1∶500）、Cleavedcaspase-3（1∶1 000）、MMP2（1∶500）和MMP9（1∶500）一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。再加山羊抗兔二抗（1∶2 000），37 ℃孵育1 h。加顯影液避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗 將U-937細胞以5.0×105個/孔接種于6 孔板中，利用LipofectamineTM2000脂質體轉染法，分別共轉染WT-LncRNA DANCR與miR-656-3p mimcs或miR-NC、MUT-LncRNA DANCR與miR-656-3p mimcs 或miR-NC，轉染6 h。然后更換培養基，再培養24 h，收集細胞并裂解，檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件分析實驗數據。本實驗每組設3 個復孔，實驗重復3 次。計量資料以±s表示。兩組間比較用獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 在AML 患者外周血中LncRNA DANCR 和miR-656-3p 的表達 與對照組比較，AML 患者外周血中LncRNA DANCR 表達升高（P＜0.05），miR-656-3p表達降低（P＜0.05）。見表1。

表1 AML 患者外周血中LncRNA DANCR 和miR-656-3p的表達（xˉ±s，n=53）Tab.1 Expressions of LncRNA DANCR and miR-656-3p in peripheral blood of AML patients（xˉ±s，n=53）

2.2 AML 細胞系中LncRNA DANCR 和miR-656-3p的表達 與HS-5 細胞比較，AML 細胞系中LncRNA DANCR 表達升高（P＜0.05），miR-656-3p 表達降低（P＜0.05）。見表2。

表2 AML 細 胞 系 中LncRNA DANCR 和miR-656-3p 的表達（xˉ±s，n=9）Tab.2 Expressions of LncRNA DANCR and miR-656-3p in AML cell lines（xˉ±s，n=9）

2.3 敲減LncRNA DANCR 對AML 細胞系U-937 增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與NC 組或si-NC 組比較，si-LncRNA DANCR 組U-937 細胞中LncRNA DANCR 表達水平降低（P＜0.05），細胞A 值、遷移和侵襲數量及細胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達水平降低（P＜0.05），凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達水平升高（P＜0.05）。NC組與si-NC組各檢測指標比較均無顯著差異（P＞0.05）。見圖1、表3。

表3 敲減LncRNA DANCR 對U-937細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響（xˉ±s，n=9）Tab.3 Effects of knocking down LncRNA DANCR on proliferation，apoptosis，migration and invasion of U-937 cells（xˉ±s，n=9）

圖1 敲減LncRNA DANCR后U-937細胞凋亡及CyclinD1、MMP2、MMP9、Cleaved-caspase-3蛋白表達情況Fig.1 Apoptosis of U-937 cells and protein expression of CyclinD1，MMP2，MMP9 and Cleaved-caspase-3 after knocking down LncRNA DANCR

2.4 過表達miR-656-3p 對U-937 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-656-3p組miR-656-3p 水平升高（P＜0.05），細胞A 值、遷移和 侵 襲 數 量 降 低（P＜0.05），CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達降低（P＜0.05），凋亡率和Cleavedcaspase-3蛋白表達升高（P＜0.05）。見圖2、表4。

表4 過表達miR-656-3p對U-937細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響（xˉ±s，n=9）Tab.4 Effects of over-expressing miR-656-3p on proliferation，apoptosis，migration and invasion of U-937 cells（xˉ±s，n=9）

圖2 Western blot 檢測CyclinD1、MMP2、MMP9、Cleavedcaspase-3蛋白表達Fig.2 Western blot detected protein expressions of CyclinD1，MMP2，MMP9 and Cleaved-caspase-3

2.5 LncRNA DANCR 靶 向 調 控miR-656-3p Star?base 靶基因預測軟件顯示，LncRNA DANCR 與miR-656-3p存在連續結合位點，見圖3。共轉染WT-Lnc-RNA DANCR 與miR-656-3p mimics 的細胞熒光素酶活性低于共轉染WT-LncRNA DANCR 與miR-NC 的細胞（0.43±0.03vs1.00±0.10，t=16.379，P＜0.05），而共轉染WT-LncRNA DANCR與miR-656-3p mimics的細胞熒光素酶活性與共轉染WT-LncRNA DANCR與miR-NC 的細胞比較差異無統計學意義（0.98±0.07vs1.03±0.08，t=1.411，P=0.177）。與si-NC 組 比 較，si-LncRNA DANCR 組U-937 細 胞 中miR-656-3p 表 達 水 平 升 高（1.97±0.15vs1.00±0.09，t=16.635，P＜0.05）。

圖3 miR-656-3p 和LncRNA DANCR 核苷酸序列的結合位點Fig.3 Binding sites of nucleotide sequence between miR-656-3p and LncRNA DANCR

2.6 敲減miR-656-3p逆轉敲減LncRNA DANCR 對U-937 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與si-LncRNA DANCR+anti-miR-NC 組 比 較，si-LncRNA DANCR+anti-miR-656-3p 組U-937 細胞中miR-656-3p 表達降低（P＜0.05），細胞A 值、遷移和侵襲數量及細胞中CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達升高（P＜0.05），凋亡率和Cleaved-caspase-3 蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖4、表5。

表5 敲減miR-656-3p逆轉敲減LncRNA DANCR 對U-937細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響（xˉ±s，n=9）Tab.5 Knocking down miR-656-3p reversed effect of knocking down LncRNA DANCR on proliferation，apoptosis，migra?tion and invasion of U-937 cells（xˉ±s，n=9）

圖4 Western blot 檢測CyclinD1、MMP2、MMP9、Cleavedcaspase-3蛋白表達Fig.4 Western blot detected protein expression of Cy?clinD1，MMP2，MMP9 and Cleaved-caspase-3

3 討論

LncRNA 是一類長度約為200 個核苷酸的小分子LncRNA，在真核生物中廣泛存在。LncRNA 參與調控腫瘤細胞增殖、分化和凋亡等生命活動，探究腫瘤中異常表達的LncRNA 及其對腫瘤發生發展的影響和機制，可為腫瘤的治療提供分子靶標［9］。研究已表明，多種LncRNA 在AML 患者外周血及細胞系中異常表達，參與調控AML 細胞的增殖和凋亡等惡性表型。例如，LINC00641 在AML 標本和細胞系中呈高表達，敲低其表達可降低AML 細胞的增殖、遷移和侵襲性，并促進AML 細胞凋亡［10］；LncRNA GHET1在AML細胞系中表達升高，敲低其表達可導致AML細胞增殖受到抑制，而分化和凋亡加劇［11］。這些異常表達的LncRNA是AML治療的潛在分子靶點。

作為一種LncRNA，LncRNA DANC 參與多種腫瘤的發展進程。研究顯示，LncRNA DANCR 在卵巢惡性組織和細胞中表達上調，敲減其表達可靶向上調miR-145 進而下調血管內皮生長因子A 的表達抑制卵巢癌腫瘤血管生成，可能是卵巢癌的新型治療靶標［12］；LncRNA DANCR 在宮頸癌組織和細胞中表達升高，且與宮頸癌患者不良預后密切相關，敲除其表達可靶向miR-335-5p/ROCK1 軸抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質轉化［13］；LncRNA DANCR在鼻咽癌中表達上調，促進鼻咽癌細胞侵襲和轉移［14］。以上研究提示，LncRNA DANCR 在腫瘤中發揮促癌基因作用，通過采用有效措施降低其表達可延緩腫瘤發展進程。

本研究顯示，LncRNA DANC 在AML 患者外周血和細胞系中的表達均明顯升高，提示其可能也促進AML 的發展進程。通過轉染LncRNA DANCR 小干擾RNA 敲減AML 細胞中其表達后，AML 細胞A值、遷移和侵襲細胞數降低，而凋亡率升高，說明敲減LncRNA DANCR 可有效減弱AML 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進細胞凋亡。細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲受多種基因分子的調控，其中CyclinD1 表達增加可加速細胞周期進程，增強細胞的增殖能力［15］；MMP2 和MMP9 參與降解細胞外基質，對腫瘤細胞遷移和侵襲起促進作用［16］；caspase-3是caspase級聯反應的關鍵調控分子，受到上游信號調控被活化后生成Cleaved-caspase-3，進而誘導細胞凋亡［17］。本研究顯示，敲減LncRNA DANCR 降低了AML 細胞中CyclinD1、MMP2 和MMP9 的蛋白表達，而促進了Cleaved-caspase-3 蛋白表達，提示LncRNA DANCR 可能通過調控與增殖、凋亡、遷移和侵襲相關蛋白的表達來影響其臨床。

LncRNA可發揮miRNA分子海綿作用，與miRNA靶向結合并調控miRNA 靶基因的表達，進而影響腫瘤細胞的生物學行為［18］。為了進一步探究LncRNA DANCR 影響AML 細胞惡性表型的分子機制，本研究利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了LncRNA DANCR 可靶向結合miR-656-3p，且敲減LncRNA DANCR 促進了AML 細胞中miR-656-3p 的表達，說明LncRNA DANCR 靶向負調控miR-656-3p。研究顯示，miR-656-3p 在鼻咽癌和肝細胞癌等腫瘤中表達降低，上調miR-656-3p 可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移等惡性表型，在腫瘤中起抑癌基因作用［19-20］。本研究顯示，AML患者外周血和細胞系中miR-656-3p呈低表達，miR-656-3p 的過表達可減弱AML 細胞的增殖、遷移和侵襲性，并加劇AML 細胞凋亡，說明miR-656-3p 在AML 中也發揮抑癌基因作用，可作為AML 治療的分子靶點。本研究還顯示，敲減miR-656-3p 可逆轉敲減LncRNA DANCR 對AML 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進作用，提示LncRNA DANCR 可能通過靶向負調控miR-656-3p來抑制AML細胞的惡性表型。

綜上，AML 患者外周血和細胞系中LncRNA DANCR 表達升高，而miR-656-3p 表達降低；敲減LncRNA DANCR 可能通過靶向負調控miR-656-3p降低AML 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并加劇細胞凋亡；LncRNA DANCR/miR-656-3p軸可能為AML的治療提供了新的分子靶點。本研究接下來將進一步探究miR-656-3p 靶基因及下游信號通路在AML發生發展中的作用。