過敏性哮喘患者外周血循環TFR細胞的變化及臨床意義①

季 拓 龔 芳 呂蓓麗 申衛紅 白仲虎 金 堅 （江南大學生物工程學院，無錫 214122）

過敏性哮喘是指由過敏原引起以免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）水平升高為主要特征的慢性呼吸道炎癥反應，流行病學調查顯示過敏性哮喘患者占哮喘患者的50%以上，且隨著工業化的推進、過敏原的增多，其發病率逐年提升［1-2］。傳統觀點認為過敏性哮喘主要受2 型輔助性T 細胞（T helper 2 cell，TH2）免疫反應主導［3］。近年來一些新T 細胞亞群如輔助型T細胞17（helper T cell 17,TH17）、輔助型T 細胞9（helper T cell 9,TH9）、調節性T 細胞（regula?tory T cell，TREG）在哮喘炎癥中的作用也逐漸被認識［1，4］。本課題組對濾泡輔助性T 細胞（follicular helper T cells,TFH）開展了系統研究，發現哮喘中TFH細胞異常活化并發生極化偏移，其中TFH2 細胞亞群通過分泌細胞因子IL-21、IL-4 促進B 細胞向漿細胞分化、Ig 類別轉換和IgE 親和力成熟等環節，使得IgE水平異常增高從而加重哮喘炎癥［5-10］。

濾泡調節性T 細胞（T follicular regulatory cell，TFR）是近年來發現的一類負向調控生發中心體液免疫反應的最主要CD4＋T 細胞亞群，TFR兼具TREG細胞及TFH細胞的雙重特性［11］：不僅表達TREG細胞特征分子如特異轉錄因子叉頭翼狀轉錄因子3（Foxp3）、細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）和Blimp-1，而且表達TFH細胞標志物如程序性死亡受體1（PD-1）、趨化性細胞因子受體5（CXCR5）、特異轉錄因子B 細胞淋巴瘤基因6（Bcl-6）和Ki67 等［12-13］。TFR細胞在次級淋巴器官生發中心通過抑制TFH細胞和B 細胞的過度活化，維持生發中心抗體生成的免疫平衡［14］。由于TFR細胞定位于淋巴濾泡，且淋巴組織取材的困難一度遲滯臨床研究。2014 年，外周血循環TFR（circulating TFR，cTFR）細胞一經發現便引起了眾多學者關注，相繼有越來越多的文獻報道在多種自身抗體相關疾病如系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征和類風濕性關節炎中cTFR細胞數量或功能變化，且cTFR細胞數量與疾病相關自身抗體水平高度相關［15-18］。然而，cTFR在過敏性哮喘發病中的作用尚未明確。本研究通過檢測過敏性哮喘患者的外周血cTFR細胞比例及其相關細胞因子表達的變化，旨在探討cTFR在過敏性哮喘中的作用及可能機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 招募江南大學附屬醫院2021 年1 月至2021 年12 月收治的25 例過敏性哮喘患者，采集臨床資料（表1）。過敏性哮喘患者選擇標準參照全球哮喘防治創議（the global initiative for asthma，GINA）和2020 年中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組制定的《支氣管哮喘防治指南》［19］，即有胸悶、喘息、咳嗽的臨床癥狀，有可逆性氣流受限的客觀證據，且排除其他可導致哮喘樣癥狀的疾病；暴露于過敏原環境可誘發或加重癥狀；過敏原SPT 或IgE 中至少有一項陽性。所有病例在入選前一周內未使用糖皮質激素或其治療哮喘的藥物，無其他慢性病史且一周內無急性感染。選擇同期在醫院體檢的健康志愿者為對照，均無慢性疾病以及過敏史，皮膚過敏原點刺試驗為陰性，血清過敏原特異性抗體為陰性。兩組受試者的性別、年齡的差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究獲得江南大學附屬醫院學術倫理委員批準，所有受試對象均簽署知情同意書。

1.1.2 材料 Ficoll-PaqueTMPREMIUM 購自GE Healthcare（貨 號17-1440-02）；PBS 購 自CORNING（貨號21-040-CV）；DMSO 購自Sigma（貨號D2650）；FBS 購自Biological Industries（貨號BI04-001-1A）；細胞因子檢測試劑盒購自Quanto Bio（貨號C191016）。流式抗體見表2。

1.2 方法

1.2.1 PBMCs 和血清的分離 采集健康志愿者和哮喘患者空腹靜脈血4 ml，置于含有EDTA 抗凝劑的真空采血管中，Ficoll 密度梯度離心法分離PBMCs。用1 ml 含10% DMSO 的FBS 將2.5×106個PBMCs 置于細胞凍存管中，轉入凍存盒并置于-80 ℃冰箱過夜，次日轉入液氮罐進行長期凍存。采集健康志愿者和哮喘患者空腹靜脈血5 ml，置于含促凝劑的真空采血管中，3 000 r/min，離心10 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 流式細胞術檢測外周血cTFR細胞比例 復蘇PBMCs，取1×106個PBMCs，重懸于50 μl 含2%FBS 的PBS 中，根據說明書加入熒光抗體（CD3-AF532、CD19-SB436、TCRγδ-BV480、CD4-BV750、CD8a-BV570、CD25-PE、CD127-APC-R700、CXCR5-APC、CD45RA-AF488），4 ℃避光孵育45 min。孵育完成后用PBS 洗滌2 次，細胞重懸于100 μl 含2%FBS 的PBS 中，加入1 μl 7-AAD，避光孵育5 min。38 通道光譜流式細胞儀Cytek NL-CLC-3000 上檢測，使用FlowJo v10.6.2 軟件進行流式數據分析。參考國內華中科技大學的劉爭教授團隊的圈門策略，將cTFR細胞定義為CD3+CD4+CD25highCD127lowCXCR5+CD45RAlow［20］。

1.2.3 流式細胞微球芯片捕獲技術法檢測血清細胞因子水平 根據細胞因子檢測試劑盒說明書，檢測血清5 種CD4+T 細胞相關炎癥因子水平。具體步驟如下：在孔板中加入微球，抽濾去除孔中液體；在孔板中加入樣品或標準品，避光震蕩孵育60 min；抽濾孔板中液體，洗液洗滌3 次；在孔板中加入二抗，避光震蕩孵育30 min；抽濾孔板中液體，洗液洗滌3 次；在孔板中加入藻紅蛋白標記的鏈霉親和素，避光震蕩孵育20 min；抽濾孔板中液體，洗液洗滌3 次；每孔加入100 μl 讀數液，混勻吸入流式管中，使用MECKMAN Navios流式細胞儀檢測。

1.3 統計學處理 組間數據應用SPSS23.0進行統計學分析，采用t檢驗和非參數檢驗。指標間相關性采用Spearman 秩相關分析。數據以±s表示。使用GraphPad Prism 8軟件和RStudio進行數據作圖。

2 結果

2.1 過敏性哮喘患者外周血cTFR細胞比例變化使用Cytek 全光譜流式細胞儀，對過敏性哮喘患者和健康志愿者外周血cTFR細胞進行分析，圈門策略如圖1A。結果顯示，過敏性哮喘組中cTFR細胞顯著低于健康對照組［（0.42±0.08）vs（0.91±0.12），P＜0.01］（圖1B、C）。

圖1 健康對照組和過敏性哮喘組cTFR細胞比較Fig.1 Comparison of cTFR cells between healthy control group and allergic asthma group

2.2 過敏性哮喘患者血清細胞因子變化 使用流式細胞微球芯片捕獲技術，對過敏性哮喘患者和健康志愿者CD4+T 細胞相關血清細胞因子進行分析（圖2A）。結果顯示，與健康對照組相比，過敏性哮喘組IL-10［（10.03±5.71）vs（23.00±9.95），P＜0.001］和IFN-γ［（9.26±4.52）vs（15.88±2.39），P＜0.05］顯著降低，IL-4［（15.67±8.03）vs（6.28±3.41），P＜0.001］、IL-5［（16.25±6.16）vs（6.87±3.28），P＜0.01］和IL-13［（77.41±33.15）vs（31.64±15.53），P＜0.01］顯著升高（圖2B）。

圖2 過敏性哮喘患者血清細胞因子變化Fig.2 Changes of serum cytokines in patients with allergic asthma

2.3 過敏性哮喘患者外周血cTFR細胞和臨床指標相關性 見圖3，對25 例哮喘患者外周血cTFR細胞與臨床指標血清總IgE、C-反應蛋白（CRP）水平、第1 秒用力呼氣容積（FEV1）占預計值的百分比FEV1%和嗜酸性粒細胞EOS絕對數，以及細胞因子的相關性進行統計學分析。結果發現，cTFR與血清總IgE 呈負相關（r=-0.56，P＜0.05），與FEV1%呈正相關（r=0.60，P＜0.05），與血清CRP 以及EOS 無關。cTFR與IL-10 呈正相關（r=0.61，P＜0.05），與IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13無相關性。

圖3 cTFR細胞與過敏性哮喘臨床指標相關性Fig.3 Correlation between cTFR cells and clinical indica?tors of allergic asthma

3 討論

IgE 調控是過敏性哮喘研究領域熱點問題，但以往研究多聚焦于IgE正向調控。TFR細胞是新發現的具有抑制功能的一類CD4+T 細胞亞群，其在抑制生發中心B細胞過度增殖、類別轉換及高親和力抗體產生中發揮重要負向調節作用［21］。CLEMENT 等［14］研究小組揭示TFR細胞的缺失增強了抗原特異性IgE抗體的產生并加劇了肺部炎癥的實驗，提示TFR細胞可能在IgE 生成中發揮重要負向調控作用。然而在花生過敏（灌胃方式）模型小鼠中，TFR細胞的缺失反而會導致花生特異性IgE 水平顯著下降，提示在食物過敏中TFR細胞可能起正向促進作用［22］。由于TFR細胞位于生發中心，取材不易，更多團隊將目光聚焦于cTFR。劉爭教授團隊報道［20］發現過敏性鼻炎患者的cTFR細胞顯著降低，且cTFR細胞與IgE 積聚呈負相關。值得關注的是，過敏原特異免疫治療（aller?gen specific immunotherapy，AIT）后伴隨cTFR細胞水平的增高患者臨床癥狀緩解［20］。然而迄今為止，cTFR細胞在過敏性哮喘中對IgE的作用仍然不明確。

本課題組發現過敏性哮喘患者外周血cTFR細胞的比例顯著下降，且與血清總IgE 呈負相關，提示cTFR細胞可能參與負向調控IgE 生成。IL-10 是一種多細胞來源的抗炎細胞因子，通過激活巨噬細胞抑制炎癥因子的分泌，也可抑制TH2 細胞功能，減輕氣道炎癥反應［23］。小鼠實驗證明生發中心TFR細胞可以分泌IL-10 抑制B 細胞產生IgE［24-25］。課題組通過檢測血清細胞因子水平，發現過敏性哮喘患者血清IL-10 水平顯著下降，提示外周血cTFR細胞可能通過分泌IL-10 抑制IgE 的產生。TH1 和TH2 免疫失衡是哮喘公認的免疫學機制。TH1 和TH2 及其相關的細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5 和IL-13 等參與過敏性哮喘的病理過程［26］。TH1 通過分泌抗炎因子IFN-γ 抑制嗜酸性粒細胞浸潤，緩解過敏性哮喘發展；TH2 通過分泌IL-4 和IL-5 促進B 細胞的增殖活化，誘導B 細胞合成IgE，分泌IL-13 破壞氣道上皮屏障，誘發氣道高反應性［27］。本課題發現和以往的報道一致，過敏性哮喘患者血清IFN-γ 水平降低，IL-4、IL-5 和IL-13水平顯著提升［28-29］。

綜上所述，本研究發現過敏性哮喘患者外周血cTFR細胞顯著減少，cTFR細胞相關細胞因子IL-10 降低，并且cTFR細胞水平和IgE 呈負相關，與疾病病情呈正相關，結果提示cTFR細胞可能在哮喘IgE病理性增加中發揮重要作用。