miRNA參與類風濕關節炎的調控機制及中藥干預研究的新進展①

陳 杰 趙夜雨 高明利 （遼寧中醫藥大學，沈陽 110847）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種免疫介導的慢性、炎癥性自身免疫性疾病，其炎癥反應不僅導致關節進行性破壞，亦可引起肺部、心血管系統等關節外表現［1］。RA 發病率約為1%～3%，臨床常見于50～60 歲中年女性，若不能及時、有效治療，可發生不可逆轉的關節及器官損傷，嚴重影響患者生命健康及生活質量［2］。目前，RA 具體發病機制尚不能完全明確，但大量研究已證實，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在調節自身免疫與炎癥方面具有重要作用［3］。作為RA 調節因子，ncRNA 已成為RA 診斷及治療的新生物標志物。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為18～25 個核苷酸的短鏈ncRNA，通過降解或翻譯抑制靶信使RNA（messenger RNA，mRNA），實現基因調控作用［4］。因此，進一步闡明miRNA 參與機制可為更好地治療RA提供新的視角與思路。

1 miRNA參與RA發生發展的機制

STANCZYK 等［5］2008 年首次描述RA 異常表達的miR-155與miR-146a，證明炎癥環境對RA滑膜細胞miRNA 表達的影響，引起國內外學者對于RA 及其相關miRNA 研究的重視。近年來已有眾多研究證實，miRNA 通過多種通路及途徑參與RA 發生發展，形成極其復雜的調控網絡。

1.1 miRNA 調控RA 滑膜組織細胞 RA 關節破壞的主要原因為關節滑膜過度異常增殖，成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocyte，FLS）為參與以上過程的關鍵細胞。正常情況下FLS位于滑膜內膜襯里層，參與正常炎癥反應，組織損傷時可調節白細胞功能、修復關節囊、重塑基質。RA-FLS 被異常激活，發生獨特侵襲行為，FLS 過度增殖，分泌大量炎癥細胞因子，于關節處堆積，導致滑膜組織增生及骨破壞。

蔡松濤等［6］實驗發現，RA-FLS miR-23b-3p 顯著下調，且miR-23b-3p 可通過負向調控X 連鎖凋亡抑制蛋白（x-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP），抑制RA-FLS增殖，促進其凋亡。黃勤等［7］應用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激FLS異常增殖，模擬RA 環境，miR-146 表達顯著下調；轉染miR-146 后，FLS增殖能力抑制，TNF-α、IL-1β與IL-6等炎癥細胞因子釋放降低，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）及其下游分子蛋白激酶B（Akt）表達下調；miR-146 可能通過PI3K/Akt 信號通路抑制FLS。SIRT3 是一種去乙酰化蛋白，可參與RA 線粒體代謝調節、能量代謝酶調節及抗氧化應激酶調節等多種生物過程。ZU 等［8］經熒光素酶報告分析驗證SIRT3 為miR-140-3p 靶點，且SIRT3表達與FLS miR-140-3p表達呈負相關。進一步研究顯示，RA-FLS SIRT3 過表達，FLS細胞活性升高，凋亡受到抑制；miR-140-3p 可通過靶向SIRT3抑制FLS過度增殖，促進其凋亡。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）可介導眾多炎癥疾病發生發展，通過激活核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路，促進炎癥細胞因子表達，參與RA炎癥反應［9］。BAO 等［10］應用生物信息學分析預測到TLR4 為RA-FLS miR-23a-5p 的靶基因，miR-23a-5p過表達可顯著抑制RA-FLS 增殖與炎癥反應，促進細胞凋亡。進一步研究結果表明，miR-23a-5p 模擬物可誘導TNF-α處理的MH7A細胞活性與遷移率下降，TLR4 基因敲除可加強以上過程，同時亦可進一步抑制NF-κB 信號激活并產生促炎因子，證實miR-23a-5p可能通過TLR4/NF-κB信號通路抑制RA-FLS增殖及炎癥過程。

上述研究結果表明，RA-FLS中存在多種miRNA異常表達，且miRNA 在RA 患者FLS 增殖過程中發揮重要調控作用。通過靶向這些miRNA，可抑制FLS 增殖，促進其凋亡，提示干預miRNA 存在治療RA的巨大潛力。

1.2 miRNA 調控RA 炎癥細胞因子 細胞因子作為機體免疫細胞之間的“通訊員”，肩負協調免疫網絡的重任。在RA 發病過程中，涉及多種炎癥細胞因子，形成復雜的細胞因子通路網絡。其中最關鍵的炎癥細胞因子包括TNF-α、IL 家族（IL-1β、IL-6、IL-17）及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulo?cyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等［11］。眾多研究證實miRNA 可調控RA相關炎癥細胞因子表達，影響RA發生發展（見表1）。

表1 有調控參與致RA炎癥的主要細胞因子作用的miRNATab.1 miRNA that regulate main cytokines involved in RA inflammation

1.2.1 TNF-α TNF-α 是一種單核巨噬細胞分泌的小分子蛋白，在RA 發病過程中起重要炎癥介導作用。TNF-α可刺激RA-FLS發生增殖，促進炎癥細胞因子表達［12］。鋅指蛋白36（tristetraprolin，TTP）是一種可抑制TNF-α 合成的RNA 結合蛋白，可靶向TNF-α并提升其mRNA 的不穩定性。SEMAAN 等［13］發現，抑制miR-346 可降低TTP 在RA-FLS 中表達；相反，在LPS 激活的THP-1 細胞中轉染miR-346 可上調TTP mRNA 表達并抑制TNF-α 釋放；證明miR-346 可能通過上調TTP 表達從而控制RA TNF-α 釋放。miR-155 是TNF-α 刺激的RA-FLS 誘導率最高的miRNA［14］。LI 等［15］實驗亦表明RA 患者外周血miR-155表達上調，且與TNF-α、IL-1β高表達顯著相關；細胞因子信號傳導抑制蛋白1（suppressor of cyto?kine signaling 1，SOCS1）可反饋性阻斷TNF-α、IL-1β信號傳導，進一步體外研究發現，miR-155 可靶向SOCS1并抑制其表達，導致TNF-α、IL-1β的上調。

1.2.2 IL-1β、IL-6 及IL-17 IL-1 是第一個被發現的IL，其中，IL-1β 已被證實在誘導RA-FLS 增殖、加重其炎癥發展方面發揮重要作用［16］。IL-1β 刺激可顯著提升RA-FLS 活性，提高相關炎癥細胞因子表達［17］。IL-6 在RA 滑膜組織中發揮類似TNF-α 的效應，其由單核細胞、T 淋巴細胞、成纖維細胞與內皮細胞等多種類型細胞產生［18］。IL-6可增強機體炎癥反應，誘導IL-6和其他炎癥細胞因子（如IL-1、TNF-α等）產生［19］。同時，IL-1 和TNF-α 可進一步刺激IL-6產生［20］。

WANG 等［21］證實，miR-365 模擬物可降低RA 模型小鼠滑膜組織細胞IL-1β 表達。ZHANG 等［22］發現miR-125b 過表達可上調TNF-α、IL-1β 與IL-6 等細胞因子水平，下調NF-κB抑制蛋白激酶α表達，表明miR-125b可能通過激活NF-κB途徑促進RA IL-1β與IL-6 等炎癥細胞因子釋放。此外，也有研究證明miR-155與miR-410-3p參與RA-FLS中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細胞因子表達［23-24］。

IL-17 由T 細胞產生，在T 細胞誘導的炎癥反應中發揮著重要作用。IL-17 在RA 中水平較高，可刺激滑膜細胞產生多種炎癥介質，包括IL-6、IL-8、GMCSF 及前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等［25］。SU 等［26］觀 察 到，miR-19a 可 與 基 質 金 屬 蛋 白 酶（matrix metalloproteinase，MMP）13 下 游3′UTR 結合，調控MMP13可激活RA IL-17信號通路。后續實驗結果表明，過表達MMP13 可促進RA-FLS 細胞增殖中，miR-19a 可通過IL-17 信號通路抑制RA-FLS中MMP13 表達，降低RA 炎癥水平。HU 等［27］驗證了RA 關節軟骨細胞miRNA 功能：miR-23a 可抑制IL-17 炎癥因子誘導的關節軟骨細胞NF-κB 活化及多種促炎介質表達。最終得出結論：miR-23a 靶向RA關節軟骨細胞IKKα。

1.2.3 GM-CSF GM-CSF 除了是一種公認造血生長因子，亦可作為促炎細胞因子，參與調節固有免疫應答。GM-CSF 可調節巨噬細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞等多種免疫細胞分化與活化，影響自身免疫性疾病的免疫應答及炎癥反應，許多研究均證實GM-CSF 在RA 發 病 機 制 中 有 重 要 作 用［28-30］。O'CONNELL 等［31］發現，miR-155 可上調GM-CSF 來源的樹突細胞，對炎癥細胞因子產生發揮促進作用，提示miR-155 在自身免疫性疾病治療方面具有潛在價值。Th17 細胞不僅可分泌IL-17，亦可產生GM-CSF；GM-CSF影響Th17分化與激活，在RA發病中起重要作用［32］。有學者通過Targetscan 分析，發現GM-CSF 與IL-17 mRNA 3'UTR 是miR-466i 潛 在靶點，miR-466i可靶向GM-CSF與IL-17 mRNA并介導其衰減，提示miR-466i存在靶標治療RA的可能［33］。

目前，已有大量研究證實，miRNA 通過靶向蛋白與基因，激活特定信號通路的途徑，影響RA 相關炎癥細胞因子分泌，進而可減輕RA 炎癥反應，延緩其發展進程。但miRNA 對RA 的調控機制極其復雜，尚不能完全闡明。目前，miRNA 在RA 發病及炎癥過程中的重要作用已證實，可為RA 診治提供新的研究視角。

2 中藥通過miRNA調控治療RA

相較于西藥治療，中藥治療不僅有顯著臨床療效，且安全性高、不良反應較少。但中藥作用機制不明確，給祖國醫學發展帶來一定阻礙。隨著時代和科技進步，中醫學者們也不斷采用現代醫學方式對中藥作用機制進行探索與研究（表2）。

表2 中藥調控miRNA治療RATab.2 Chinese medicine regulates miRNA to treat RA

2.1 中藥提取成分 雷公藤多苷是由中藥雷公藤根部提取的多種有效成分混合物，有抗炎及免疫抑制作用。CHEN等［34］研究發現，RA患者miR-146a表達上調，其水平與疾病活動度呈正相關，雷公藤多苷可顯著下調miR-146a 表達；提示雷公藤多苷可能通過影響miR-146a 治療RA。青藤堿是中藥青風藤主要活性成分之一，可抑制RA 炎癥反應，調節其免疫功能。李嘉等［35］實驗發現，經青藤堿處理后RAFLS活性降低，細胞凋亡率升高，同時miR-23b-3p水平升高，成纖維細胞生長因子9（fibroblast growth factor 9，FGF9）水平降低，miR-23b-3p 與FGF9 存在靶向關系；初步表明青藤堿可能通過調控miR-23b-3p/FGF9 抑制RA-FLS 增殖，促進細胞凋亡。黃芩苷是傳統中藥黃芩有效成分之一，其藥理作用廣泛，有抗炎、抗菌、抗氧化等多種功效。段海政等［36］發現，黃芩苷不僅抑制RA-FLS 活性，亦可降低miR-21表達，同時TGF-β1 合成抑制，且促進其抑制物Smad7表達。miR-21已證實可靶向結合Smad7蛋白并抑制其表達，引起組織纖維化［37］。提示黃芩苷可能通過抑制miR-21 表達，上調Smad7 表達，抑制TGF-β1 合成，起抗RA 滑膜纖維化作用。小檗堿是一種黃連提取的生物堿化合物，在臨床上應用廣泛，有抗炎鎮痛作用。SUJITHA 等［38］實驗表明，RA TLR4與TNF受體關聯因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2）表達上調，其下游細胞凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）激活，miR-23a 表達抑制。小檗堿處理后可上調miR-23a 表達，抑制TLR4 與TRAF2 表達及ASK1/p38 磷酸化，減少促炎細胞因子分泌，提示小檗堿可能通過上調miR-23a 表達抑制TLR4/TRAF2 介導的ASK1 信號通路，發揮延緩RA 炎癥進程的作用。丹皮酚是中藥牡丹皮有效成分之一，有抗炎、止痛、調節免疫等多種作用。LIU 等［39］發現，丹皮酚或miR-155 抑制劑處理均可抑制TNF-α 誘導的RA-FLS 叉頭轉錄因子O3（forkhead box O3，FOXO3）蛋白表達，減少炎癥因子釋放。FOXO3 是miR-155-5p 的直接靶點，抑制FOXO3可導致丹皮酚保護作用消失。綜上所述，丹皮酚可能通過降低miR-155表達，上調其靶基因FOXO3，抑制FLS增殖及細胞因子釋放。

2.2 中藥復方 中藥復方治療RA 為多藥物、多成分、多靶點協同作用。王慧蓮等［40］通過臨床研究發現宣痹方可有效緩解RA 患者癥狀，其機制為抑制NF-κB 信號通路及miR-155 表達，減輕RA 炎癥反應。王志文等［41］研究麝香烏龍丸含藥血清對RA 患者外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）miRNA 的影響，發現麝香烏龍丸可通過調控miR-181a、miR-16及miR-18a表達，減少炎癥細胞因子釋放，發揮治療RA 的作用。周玲玲等［42］將滋腎通絡方分為3 個不同功效單元，通過實驗發現各個功效單元可靶向CIA 小鼠CD4+T 細胞不同miRNA，發揮相應功效，全方對miRNA 的調控作用最強，提示滋腎通絡方可靶向調控多種miRNA，協同增效，發揮整體治療RA 的作用。劉喜德等［43］通過前期研究觀察到溫化蠲痹方可下調RA 患者PBMCs miR-146a 表達，上調DNA 甲基化轉移酶（DNA methyltransferase，DNMTs），恢復其甲基化水平，通過多靶點干預治療活動期RA。進一步研究發現，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activited protein kinases，MAPKs）阻斷劑干預RA 活動期患者，其miR-146a 與RAS 鳥嘌呤釋放蛋白1（RAS guang releasing protein 1，RASGRP1）水 平 下 降，DNMTs表達上調［44］。溫化蠲痹方干預后，RASGRP1表達同樣下降，提示溫化蠲痹方可能通過降低RAS?GRP1 水平，作用于MAPKs 信號通路，參與RA 患者miR-146a 對DNMTs 的調控過程，發揮治療作用。WANG 等［45］發現RA 患者血清lncRNA uc. 477 表達上調，miR-19b 表達下調，LncRNA uc.477 可能干擾miR-19b 成熟，起到促炎作用。化瘀強腎通痹方治療后可抑制RA-FLS lncRNA uc.477，miR-19b 上升，減少炎癥細胞因子釋放，提示化瘀強腎通痹方可能通過抑制lncRNA uc.477 水平，促進miR-19b 成熟，發揮減緩RA炎癥進程的作用。

3 結語

有關miRNA 調控影響RA 的研究廣泛，涉及多通路、多靶點。但應用中藥干預miRNA 調控治療RA 的研究存在諸多問題。首先中藥干預miRNA 調控治療RA 的研究仍然處于初級階段，整體數量較少；其次相關研究大多欠缺深度，僅為描述實驗結果，并未深入挖掘其分子機制；中藥復方治療疾病為多途徑、多環節共同產生作用，僅研究其中某一條通路有局限性。

隨著科研技術水平地不斷發展進步，未來可從多角度、多途徑進行系統深入研究。結合miRNA 調控作用，闡明中藥治療RA 的作用機制，有望成為研究RA的下一個熱點。