基于GC-MS結合化學計量學方法鑒定四川郫縣豆瓣醬

張蕾蕾，吳劍榮，張洪濤，高敏杰，詹曉北

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

郫縣豆瓣醬作為中國著名的地理標志產品，具有“口感香辣、酯香濃郁、色澤油亮”的特點[1]。根據豆瓣醬發酵的時間，可將其分為紅油郫縣豆瓣醬和傳統郫縣豆瓣醬(特級、一級、二級)。一般來講，紅油郫縣豆瓣醬的發酵周期為3～6個月，傳統郫縣豆瓣醬的發酵周期為6個月～5年。二級豆瓣醬發酵6個月以上，一級豆瓣醬發酵1年以上，特級豆瓣醬在3～5年。紅油郫縣豆瓣醬與傳統郫縣豆瓣醬除了發酵周期不同以外，其形態、色澤以及生產方式也有很大區別。紅油郫縣豆瓣醬形態稀薄，呈半流動狀態，色澤紅亮油潤，生產過程中還添加植物油、香料和防腐劑。傳統郫縣豆瓣醬的形態黏稠絨實，呈半固態，色澤為紅褐色，隨著發酵時間的延長顏色也會加深，在生產過程中不另外添加油脂和香料。氨基酸態氮是評價郫縣豆瓣醬質量的重要指標之一。隨著發酵時間的增加，蛋白酶的持續分解作用使豆瓣醬中氨基酸態氮含量逐漸增加，豆瓣醬品質也因氨基酸態氮含量增加而提升[2]。豆瓣醬在后熟過程中，水解蛋白質產生的氨基與還原糖的羰基發生美拉德反應，賦予長時間發酵豆瓣醬獨特的風味與顏色[3]。

由于豆瓣醬要經過長時間日曬夜露的發酵過程，發酵條件、原料選取及環境微生物的差異都對于豆瓣醬最終形成的風味具有重要影響，因此不同產地的豆瓣醬在風味組成上都具有獨特之處[2,4-5]。賈洪峰等[6]利用電子鼻對7個不同豆瓣樣品進行檢測，對獲得的數據進行主成分分析和統計質量控制分析，結果發現郫縣豆瓣和其他豆瓣樣品在氣味指紋上存在差異性，但對于造成風味差異的物質并沒有進一步的研究，且樣本偏少。近年來基于礦物元素、化學組分和揮發性物質的分析方法已經廣泛應用于對大米[7-8]、茶葉[9-10]、食醋[11]、白酒[12]等食品產地溯源的研究中。因此，本研究利用頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)結合GC-MS對郫縣和非郫縣產區的傳統豆瓣醬和紅油豆瓣醬樣品的揮發性組成進行檢測，構建不同產地豆瓣醬的指紋圖譜。結合Fisher判別分析和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)研究不同產地的豆瓣醬在香氣組成方面的差異，以期能夠通過揮發性呈香物質對不同豆瓣醬樣品進行產地溯源識別，為郫縣豆瓣醬的品質鑒別和產品溯源提供一定的參考價值和借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豆瓣醬，無錫市場。具體樣品信息如表1所示。

表1 不同豆瓣醬樣品產地信息Table 1 Information on broad bean pastes investigated in this study

1.2 實驗儀器與設備

TSQ8000三重四級桿氣質聯用儀、TG-WAXMS A石英毛細管柱，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 揮發性組分檢測與鑒定

1.3.1 SPME法萃取過程

使用三重四級桿氣質聯用儀檢測豆瓣醬中的揮發性組分，準確稱取研磨后的豆瓣醬樣品5.00 g于15 mL樣品瓶中，添加10 μL規格為50 mg/L的2-辛醇作為內標，加蓋密封待檢。置于60 ℃恒溫中預平衡15 min。將CAR/PDMS萃取頭插入頂部空間(離樣品高度20 mm)萃取30 min，完成后退回萃取頭，插入GC-MS進樣品口，解吸4 min。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為TG-WAXMS A石英毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度270 ℃。升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持2 min后，以5 ℃/min升至230 ℃，230 ℃保持8 min。其中載氣(He)為恒流模式，流速1.2 mL/min。

1.3.3 質譜條件

以EI為離子源，電子能量和溫度分別為70 eV和200 ℃；質譜掃描范圍(m/z)為45～400 amu；氣相色譜與質譜連接口溫度為200 ℃，采用不分流模式。

1.3.4 揮發性化合物鑒定

檢出組分的譜圖與標準質譜數據庫(NIST 2014)比對，結合相同分析條件下正構烷烴標準品的出峰情況計算出各個峰的相對保留指數(retention index，RI)，與文獻報道的保留指數進行對比綜合定性，當且僅當匹配度大于700(最大值為1 000)的鑒定結果才予以報道；某些具有多環或復雜結構的化合物，僅作試驗性的鑒定。

1.4 數據處理

使用Xcalibur軟件對GC-MS的結果進行處理，根據峰面積歸一化法確定各化合物相對含量。采用SPSS Statistics 26.0對不同豆瓣醬樣品進行主成分分析和Fisher判別分析。采用SIMCA 14.0進行OPLS-DA。應用Origin 2020軟件進行數據圖形化處理。

2 結果與分析

2.1 不同品牌豆瓣醬中揮發性成分分析

為了探究以辣椒和蠶豆為原料的郫縣豆瓣醬和非郫縣豆瓣醬的區別，一共選取105種豆瓣醬樣品，包括郫縣地區的24種傳統豆瓣醬和30種紅油豆瓣醬，非郫縣地區的33種傳統豆瓣醬和18種紅油豆瓣醬。將所有豆瓣醬樣品的色譜峰面積歸一化后，以相對峰面積>0.1%為限定值挑選用于判別分析的風味化合物，篩選結果見表2，一共篩選到87種風味化合物，圖1為各樣本中揮發性物質相對含量歸一化后繪制的熱圖。

圖1 105種豆瓣醬樣品中的87種揮發性物質相對含量熱圖Fig.1 Heat map of relative content of 87 volatile substances in 105 kinds of broad bean paste samples

表2 105種豆瓣醬樣品中的87種揮發性物質Table 2 Eighty-seven volatile compounds in 105 broad bean paste samples

酯類主要為山梨酸乙酯、棕櫚酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯等27種物質。在豆瓣醬樣品中，酯類化合物的檢出種類是最多的。酯類即使在很低的濃度條件下也對食品的香味起著非常重要的作用。山梨酸乙酯的平均相對含量最高(5.02%)，這是因為豆瓣醬中添加了食品添加劑山梨酸鉀，造成山梨酸乙酯相對含量較高，但是山梨酸乙酯是一種被國際公認的低毒高效食品防腐劑，可以防止豆瓣醬腐敗變質。月桂酸乙酯、十四酸乙酯和棕櫚酸乙酯的平均相對含量為1.19%～2.58%，分別為豆瓣醬貢獻花果香、椰子香和奶油香氣。這3種酯類物質在郫縣產區傳統豆瓣醬中的平均相對含量明顯比非郫縣產區高，可能是郫縣產區豆瓣醬重要的標志性物質。

醇類主要為乙醇、 β-苯乙醇、芳樟醇等18種物質。醇類是酯化反應的重要前體，也是構成郫縣豆瓣特征風味的一類重要化合物，通常呈現出令人愉快的香味及甜味，比如β-苯乙醇具有花果香；芳樟醇具有甜嫩新鮮的花香，似鈴蘭香氣。乙醇是豆瓣醬中含量最高的醇類物質，平均相對含量為21.46%，但在不同產地之間沒有明顯區別。β-苯乙醇在郫縣產區豆瓣醬之間有明顯差異，郫縣產區的傳統豆瓣醬和紅油豆瓣醬中β-苯乙醇平均相對含量分別為5.07%和0.92%。

醛類主要為苯乙醛、2-甲基丁醛等12種物質。酮類主要為丙酮、香葉基丙酮等6種物質。醛類和酮類都是羰基類化合物，它們均屬不穩定的中間體化合物，易被還原成相應的醇[13]。醛酮類物質主要經過脂質氧化產生，也可能是用于豆瓣發酵的微生物的生長代謝產物，主要以花果香貢獻于郫縣豆瓣的風味。醛酮類物質在豆瓣醬中的含量比醇類和酯類低。苯乙醛是醛類物質中平均相對含量最高的(1.33%)，郫縣產區紅油豆瓣醬苯乙醛的平均相對含量比非郫縣產區紅油豆瓣醬的高，但在不同產地的傳統豆瓣醬中的區別不大。酮類物質的相對含量都較低，丙酮是酮類物質中相對含量最高的物質，其最大的相對含量僅為0.88%。郫縣產區豆瓣醬的香葉基丙酮的平均相對含量為0.19%，而非郫縣產區豆瓣醬的香葉基丙酮的平均相對含量僅為0.04%，香葉基丙酮有可能是郫縣產區豆瓣醬的標志性物質。

酸類主要為山梨酸、苯甲酸等6種物質。大多數豆瓣醬中會添加山梨酸鉀作為防腐劑使山梨酸的相對含量偏高(2.53%～47.98%)，其中傳統豆瓣醬的山梨酸含量相對較低，為2.53%～21.66%，紅油豆瓣醬的山梨酸含量相對較高，為19.86%～47.98%。苯甲酸的平均相對含量僅次于山梨酸，達到5.58%。郫縣產區的紅油豆瓣醬中苯甲酸的平均相對含量較高(9.42%)，其他豆瓣醬樣品中苯甲酸的相對含量比較相近。

4種酚類物質中，4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-乙基-苯酚的平均相對含量較高，分別為2.00%和1.17%。郫縣產區傳統豆瓣醬中這2種酚類物質的平均相對含量達到4.36%和2.71%，明顯高于其他豆瓣醬。4-乙基-2-甲氧基苯酚具有典型的醬香和煙熏氣味，也被鑒定是醬油香氣的主要成分之一；4-乙基-苯酚具有木質香、酚香和甜香，可以認為它們是賦予郫縣豆瓣特征風味的代表性化合物之一。多項研究表明這2種酚類物質是郫縣豆瓣醬的主體揮發性成分[2,14-15]。

烯類為D-檸檬烯和α-姜烯等5種物質。D-檸檬烯具有檸檬果香及新鮮橙子的香氣，同時具有消炎、預防和治療癌癥的作用[16]。D-檸檬烯主要存在于郫縣產區的紅油豆瓣醬和非郫縣產區的傳統豆瓣醬中，前者的最高相對含量達到13.92%，后者的最高相對含量達到8.15%。部分非郫縣產區的傳統豆瓣醬添加生姜作為輔料，α-姜烯是生姜中主要活性成分之一，具有鮮花的香氣特征，同時具有抗病毒、抗氧化的特性[17]。生姜的添加使α-姜烯的含量也較高，最高相對含量達到20.10%。

雜環類為2-乙酰基吡咯、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪。2-乙酰基吡咯的平均相對含量最高(1.03%)，其余3種雜環類物質最高的相對含量均在0.60%左右。豆瓣醬中鑒定的雜環類物質主要是吡嗪類化合物。吡嗪類物質一般具有烤香、堅果香，主要在后發酵過程中由Maillard反應和Strecker降解產生的氨基酮經縮合反應生成[18]。羅靜等[19]發現2-乙酰基吡咯是郫縣豆瓣中相對含量最高的雜環類物質，與本研究結果一致。2-乙酰基吡咯可能是豆瓣醬所用辣椒原料中含有的[4,20]。除此之外，王雪梅等[4]在生產豆瓣醬的5種辣椒原料中還檢測到2,5-二甲基吡嗪，為郫縣豆瓣醬提供醬香味。

2.2 基于OPLS-DA方法的豆瓣醬產地區分模型

圖2為OPLS-DA模型得分散點圖。可以看出各個產區樣品群體內有明顯的聚集趨勢，僅有2個非郫縣紅油樣本完全落在Hotelline’T2橢圓圖外，4種類型豆瓣醬樣品均較好的分離。

圖2 OPLS-DA 模型得分散點圖Fig.2 OPLS-DA scoring plot

載荷圖表示各指標與不同產區不同工藝的相關性大小，即圖中X變量與Y變量越靠近，其相關性越高。如圖3所示，異丁醛(C2)和2-乙基吡咯(C71)與FC的相關性較高；十四酸乙酯(C74)和月桂酸乙酯(C63)與PC的相關性較高；山梨酸乙酯(C40)與FH的相關性較高；甲醇(C6)與PH的相關性較高。

圖3 OPLS-DA模型載荷散點圖Fig.3 Loading plot of OPLS-DA model

變量權重系數(variable importance for the projection, VIP)值可以量化由OPLS-DA的每個變量對樣品分類的貢獻，VIP>1的變量被認為是貢獻較大的變量。如圖4所示，45個變量的VIP>1(圖4中前45種物質)，VIP值越大，變量對分類的貢獻度越高。其中變量對分類貢獻最高的5種物質依次為月桂酸乙酯(C63)、十四酸乙酯(C74)、香葉基丙酮(C65)、9-十六烯酸乙酯(C82)和二氫獼猴桃內酯(C83)。

圖4 VIP得分圖Fig.4 VIP scoring plot

運用統計推斷分析進一步驗證鑒別模型，圖5-a為OPLS-DA模型置換驗證圖。Q2代表累積交叉有效性，Q2值越大表示模型可預測度越高；R2代表累積方差值，R2值越大表示模型解釋能力越強。圖5-a中R2和Q2的截距分別為0.259和-0.326，位于左邊綠色的R2值和藍色的Q2值均低于最右邊的值，且Q2的回歸線截距為負值，說明建立的OPLS-DA模型沒有出現過擬合現象，具有較好的預測能力，可用于后續特征揮發性物質的確定。利用建立的模型對驗證集樣品進行原產地判別，具體結果見圖5-b。驗證集中的98～103號樣本都實現了準確的預測(共8個樣品，75%預測準確)，其中僅104和105號樣品預測不準確(共8個樣品，25%預測不準確)，尤其是105號樣品偏差過大，可能是因為該豆瓣醬樣品具有明顯的重慶地理風味特征，與其他樣品差異過大，使結果無法準確預測，后續會通過其他判別方法進一步分析。

a-置換驗證圖；b-預測圖圖5 OPLS-DA 模型置換驗證圖和模型預測圖Fig.5 OPLS-DA permutation test and prediction

2.3 基于Fisher判別分析方法的豆瓣醬產地判別模型

Fisher判別分析能夠實現最大的類間距離以及最小的類內距離，使得樣本有最佳的可分離性。由于非郫縣產區豆瓣醬樣品來源于不同產地，為了解決非郫縣產區豆瓣醬樣品之間差異性過大的問題，本研究進一步建立基于Fisher判別函數的一般判別方法對豆瓣醬樣品進行多變量判別分析。

將OPLS-DA篩選出的對原產地判別有重要貢獻作用的45種揮發性物質作為判別分析的自變量，對訓練集樣本進行逐步判別分析，結果顯示，乙醛(C1)、甲醇(C6)等15種揮發性物質對豆瓣醬產地判別顯著的物質被引入到判別模型中。不同產地和工藝豆瓣醬判別函數模型系數見表3，判別分類結果見表4。

表3 不同產地和工藝豆瓣醬判別函數模型系數Table 3 Discriminant function model coefficients of different broad bean pastes

表4 不同產地和工藝豆瓣醬的一般判別分析結果Table 4 General discriminant analysis of different broad bean pastes

提取模型前3個典型判別函數，Willks’ Lambda檢驗結果進一步證實，在α=0.05的顯著性水平下，3個函數對分類效果均為顯著，其中判別函數1、判別函數2和判別函數3累積解釋判別模型能力為100%，且典型相關系數分別為0.935、0.853和0.748，表明3個判別函數對豆瓣醬的產地和工藝分類具有重要作用。圖6為3個判別函數3的得分值散點圖。利用Fisher判別模型對所有訓練集樣品建立分類模型。在判別模型中FC的31個樣品均實現正確的判別；PC有1個樣本被誤判為PH；FH有2個樣本被誤判為PH；PH有1個樣本被誤判為FC。本研究建立的判別模型整體正確判別率為95.9%。為了進一步考查Fisher判別模型的有效性和正確性，用建立的模型對訓練集中8個未參加建模的樣品進行判別分析，判別結果見表5，其中8個樣品均實現正確判別，表明基于揮發性成分的指紋差異可以有效鑒別郫縣產區與非郫縣產區的豆瓣醬。

圖6 不同產區和工藝豆瓣醬前3個典型判別函數得分散點圖Fig.6 Scores of the first three typical discrimination functions of broad bean pastes

表5 Fisher判別分析預測結果Table 5 Prediction by Fisher model

3 結論與討論

本實驗利用HS-SPME-GC-MS技術對不同產地來源的豆瓣醬的揮發性成分進行檢測與分析，共檢測到87種香氣物質。基于OPLS-DA建立的判別模型篩選出VIP>1的45種對郫縣豆瓣醬的產地判別具有較大貢獻的揮發性物質(圖4中前45中化合物)。進一步基于篩選出來的45種揮發性物質，利用Fisher判別分析構建產地判別模型，確定15種郫縣豆瓣醬的有效溯源指標，其中包含6種酯類、3種醇類、2種酸類、2種酮類、1種醛類和1種酚類。酯類和酚類物質與前人的研究具有一定的相似性。劉超蘭等[21]發現豆瓣醬陳釀8個月后十四烷酸、棕櫚酸和反式-4-葵烯酸等乙酯衍生物等主體酯香成倍增加。劉平等[22]采用氣相色譜-嗅覺測量法及香氣活性值法初步確定4-乙基-2-甲氧基苯酚、十六酸乙酯等7種香氣化合物為一級傳統郫縣豆瓣醬的特征香氣物質。李治華等[15]發現4-乙基-2-甲氧基苯酚和水楊酸甲酯在不同發酵時間豆瓣醬之間具有明顯差異。這表明本文篩選出來的酯類和酚類物質作為有效溯源指標具有一定的代表性。除此之外，香葉基丙酮、3-羥基丁酮等8種物質也是郫縣豆瓣醬區別于其他豆瓣醬的重要成分。香葉基丙酮是具有木蘭香氣的風味物質，略帶甜蜜的玫瑰香韻味，郫縣產區豆瓣醬中香葉基丙酮的含量高于非郫縣產區。3-羥基丁酮具有令人愉快的奶油香味，其僅在非郫縣產區的紅油豆瓣醬中平均相對含量較高(0.18%)。

Fisher判別分析方法構建的判別模型的整體正確判別率為95.9%，對驗證集樣品實現了100%的正確判別。在Fisher判別模型中對非郫縣產區的紅油豆瓣醬的誤判率較高，可能是因為不同產地紅油豆瓣醬的原料相似度較高，紅油豆瓣醬樣本量較少也是影響判別模型準確率的因素之一。Fisher判別模型對驗證集的判別比OPLS-DA模型更準確，可能是因為在Fisher判別分析中進一步篩選了對原產地分類有重要貢獻作用的變量，從而排除了干擾原產地判別的變量，說明變量的選擇對判別分析的準確率影響較大。基于OPLS-DA和Fisher判別分析所構建的模型對于郫縣豆瓣醬原產地識別有一定的預測能力，對郫縣豆瓣醬地理標志性產品及消費者合法權益的保護提供了一定的技術支撐。