紫穗槐蜂蜜理化指標(biāo)及揮發(fā)性成分測(cè)定與分析

王桃紅，祖鐵紅，鄭軍紅，賈光群，曹彥忠，陳輝，崔宗巖*

1(秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北 秦皇島，066004)2(山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東 泰安，271000)3(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京，100176)

紫穗槐蜂蜜是蜜蜂以紫穗槐(Amorphafruticosa)為主要蜜源植物釀造而成的一種中國(guó)特色蜂蜜，其一般流蜜季節(jié)為5～6月，多產(chǎn)自中國(guó)西北地區(qū)[1]。紫穗槐蜜呈紫紅色，又稱“血蜜”，可有效預(yù)防酒精性胃潰瘍[1]，其種植面積少，產(chǎn)量低，是較為稀缺的特色小蜜種。蜂蜜的理化指標(biāo)是評(píng)價(jià)其質(zhì)量品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，主要包括水分、酸度、5-羥甲基糠醛、淀粉酶值、還原糖、蔗糖等。目前已有對(duì)大宗蜜種如棗花蜜[2]、椴樹蜜[3]、荊條蜜[4]、洋槐蜜[5]及部分小蜜種如枇杷蜜、薰衣草蜜[6]和麥盧卡蜂蜜[7]等理化指標(biāo)的報(bào)道，但國(guó)內(nèi)外尚缺乏紫穗槐蜂蜜理化指標(biāo)的系統(tǒng)性數(shù)據(jù)。蜂蜜的風(fēng)味主要與揮發(fā)性成分有關(guān)，揮發(fā)性成分不僅是影響蜂蜜口感和品質(zhì)的重要因素，而且大量數(shù)據(jù)表明揮發(fā)性成分可作為蜜種鑒別的依據(jù)[8-9]。JERKOVI等[10]發(fā)現(xiàn)紫穗槐蜜中主要揮發(fā)性成分為苯乙醇、芳樟醇氧化物和丁香酸乙酯，但針對(duì)我國(guó)紫穗槐蜂蜜的揮發(fā)性成分研究尚未見報(bào)道。

本研究采用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)紫穗槐蜜的理化指標(biāo)(水分、酸度、淀粉酶值、5-羥甲基糠醛、還原糖、蔗糖)進(jìn)行測(cè)定，采用頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜(headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)技術(shù)對(duì)紫穗槐蜂蜜的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定，對(duì)其理化指標(biāo)和揮發(fā)性成分組成進(jìn)行了系統(tǒng)分析，對(duì)紫穗槐蜂蜜的質(zhì)量和品質(zhì)特征情況進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 蜂蜜樣品

研究所用蜂蜜樣品均是在紫穗槐植物開花流蜜時(shí)節(jié)(5～6月)采集，其中7份采自中國(guó)陜西，1份采自中國(guó)山西。紫穗槐蜜為小蜜種蜂蜜，其產(chǎn)情受年份影響較大，因而樣品采集自產(chǎn)情較好的2017年和2019年(表1)。

表1 紫穗槐蜂蜜樣品采集信息表Table 1 Sample information of collected Amorpha fruticosa honeys

1.2 試劑與材料

XBridge BEH Amide色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國(guó)Waters公司；HP-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，美國(guó)Sepax Technologies公司；DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國(guó)Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維，美國(guó)Sigma-Aldrich Supelco公司，實(shí)驗(yàn)前在270 ℃條件下，老化30 min；20 mL頂空瓶，配置硅膠/聚四氟乙烯隔墊和20 mm鐵蓋，德國(guó)Gerstel公司；壓蓋器和啟蓋器，德國(guó)CNW公司。

甲醇(≥99.9%)、乙腈(≥99.9%)，均為色譜純，北京迪科馬科技有限公司；碘(≥99%)、KI(≥99%)、NaCl(≥99.5%)、乙酸鈉(≥99%)、可溶性淀粉，均為分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司；冰乙酸(≥99.7%)，美國(guó)Tedia有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：5-羥甲基糠醛(≥99%)，美國(guó)Sigma-Aldrich Supelco公司；果糖(≥99%)、葡萄糖(≥99.5%)、麥芽糖(≥98.0%)，上海阿拉丁公司；蔗糖(≥99%)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

7890B—5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置分流/不分流進(jìn)樣口和固相微萃取專用襯管，美國(guó)Agilent公司；MPS多功能樣品前處理平臺(tái)，配置自動(dòng)化頂空固相微萃取手柄，德國(guó)Gerstel公司；ACQUITY超高壓液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器)、S2690液相色譜儀(配置示差檢測(cè)器)，美國(guó)Waters公司；ARIAS500阿貝折光計(jì)，美國(guó)REICHERT公司；UV-2600紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 紫穗槐蜂蜜理化指標(biāo)的測(cè)定

水分含量測(cè)定參照SN/T 0852—2012《進(jìn)出口蜂蜜檢驗(yàn)規(guī)程》附錄A水分的測(cè)定；酸度測(cè)定參照SN/T 0852—2012《進(jìn)出口蜂蜜檢驗(yàn)規(guī)程》附錄B酸度的測(cè)定；還原糖含量測(cè)定參照GB 5009.8—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》；淀粉酶值測(cè)定參照GB/T 18932.16—2003《蜂蜜中淀粉酶值的測(cè)定方法 分光光度法》；5-羥甲基糠醛測(cè)定參照GB/T 18932.18—2003《蜂蜜中羥甲基糠醛的測(cè)定方法 液相色譜紫外檢測(cè)法》。

1.4.2 紫穗槐樣品揮發(fā)性成分測(cè)定

樣品處理：準(zhǔn)確稱取(2.0±0.1) g蜂蜜樣品于20 mL頂空瓶中，密封后置于樣品前處理平臺(tái)上進(jìn)行固相微萃取。

固相微萃取條件：采用實(shí)驗(yàn)室先前優(yōu)化建立的分析方法[11]，萃取纖維選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS；萃取溫度60 ℃；萃取時(shí)間45 min；平衡時(shí)間10 min；振蕩速率250 r/min；進(jìn)樣口解析時(shí)間5 min。

色譜條件：色譜柱為Agilent DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序：初始溫度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升溫至160 ℃，然后以10 ℃/min升溫至270 ℃，保持6 min，總運(yùn)行時(shí)間為60 min。載氣為高純氦，流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度270 ℃，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(electron impact，EI)70 eV，離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度270 ℃；全掃描模式，掃描范圍m/z25～450。

定性定量方法：將各組分質(zhì)譜圖經(jīng)NIST14譜庫(kù)檢索，正相和反相匹配度均在800以上，且相似度得分值最高的化合物計(jì)入結(jié)果，同時(shí)應(yīng)用保留指數(shù)(retention index，RI)值、標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證輔助定性。采用面積歸一化法測(cè)定樣品中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫穗槐蜂蜜的主要理化指標(biāo)

蜂蜜的理化指標(biāo)是評(píng)定蜂蜜品質(zhì)的重要因素之一。利用國(guó)家現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)8批紫穗槐蜜的理化指標(biāo)(水分、酸度、淀粉酶值、5-羥甲基糠醛、還原糖、蔗糖)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表2所示。

表2 紫穗槐蜂蜜主要理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical parameters of A.fruticosa honeys

水分含量是鑒別蜂蜜質(zhì)量的指標(biāo)之一，是評(píng)價(jià)蜂蜜自然成熟度的標(biāo)準(zhǔn)[12]。水分含量過(guò)高，蜂蜜會(huì)產(chǎn)生一定程度的發(fā)酵，進(jìn)而會(huì)影響其感官和品質(zhì)。成熟蜂蜜的水分含量一般在20%以下[12]。由表2知，紫穗槐蜂蜜的水分含量為15.5%～17.8%，平均值為16.8%，表明8批紫穗槐蜂蜜均為自然成熟蜂蜜，達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 18796—2012《蜂蜜》(以下簡(jiǎn)稱GH/T 18796)規(guī)定的一級(jí)蜜水平。

蜂蜜的酸度與有機(jī)酸和無(wú)機(jī)離子有關(guān)。酸度大小會(huì)一定程度上影響蜂蜜的抗菌活性[13]。GH/T 18796中規(guī)定蜂蜜的酸度<40 mL/kg，紫穗槐蜂蜜的酸度范圍為14.8～25.8 mL/kg，平均值為20.0 mL/kg，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

淀粉酶值是反映蜂蜜新鮮度和營(yíng)養(yǎng)功能的重要指標(biāo)，該酶與蜂蜜中糖類的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[14]。GH/T 18796中規(guī)定淀粉酶值≥4 mL/(g·h)。由表2可知，紫穗槐淀粉酶值范圍為27.2%～70.6%，平均含量高達(dá)51.8%，不僅符合標(biāo)準(zhǔn)要求，且明顯高于棗花蜜[2]、荊條蜜[4]、油菜蜜[15]和椴樹蜜[3]等大宗蜜源蜂蜜的淀粉酶值(圖1)。

圖1 紫穗槐蜂蜜與大宗蜂蜜淀粉酶值含量對(duì)比圖Fig.1 Amylase activity of A.fruticosa honey and other common honeys

5-羥甲基糠醛含量是一項(xiàng)反映蜂蜜新鮮度的重要指標(biāo)。新鮮蜂蜜中羥甲基糠醛的含量一般較低，而一旦經(jīng)過(guò)加熱或長(zhǎng)期貯存，蜂蜜中的還原性糖與部分氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，致使5-羥甲基糠醛含量升高[16]，嚴(yán)重影響蜂蜜色澤和口感。GH/T 18796中規(guī)定羥甲基糠醛含量<40 mg/kg。由表2可知，絕大多數(shù)紫穗槐蜂蜜中羥甲基糠醛含量較低，最高為3.5 mg/kg，部分未檢出，說(shuō)明其新鮮度較高。No.1樣品羥甲基糠醛含量較高，達(dá)到為28.7 mg/kg，盡管其含量低于40 mg/kg，符合標(biāo)準(zhǔn)要求，但其含量遠(yuǎn)高于其它樣品，說(shuō)明該樣品新鮮度較差，推測(cè)其原因是由于此樣品采集時(shí)間較早，采集后沒(méi)有及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行冷藏或冷凍保存，導(dǎo)致其新鮮度變差。

還原糖含量是評(píng)價(jià)蜂蜜質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要參數(shù)[14]，主要包含葡萄糖和果糖。GH/T 18796和食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 14963—2011《蜂蜜》均規(guī)定果糖和葡萄糖的總含量≥60%。由表2可得，紫穗槐蜂蜜中果糖的含量為38.7%～43.1%，平均值為40.4%，葡萄糖的含量為26.1%～30.1%，平均值為28.3%，葡萄糖和果糖的總含量為65.9%～71.1%，平均值為68.7%，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。大宗蜜源蜂蜜如荊條蜜[4]、棗花蜜和洋槐蜜[17]中還原糖的含量分別為69.4%、62.9%、62.0%，小蜜種蜂蜜如野桂花蜜[18]和茴香蜜[19]的還原糖分別為61.9%和61.0%。對(duì)比結(jié)果表明，紫穗槐蜂蜜還原糖含量相比棗花蜜、洋槐蜜、野桂花和茴香蜜均較高，與荊條蜜中還原糖含量相當(dāng)。

果葡比(果糖/葡萄糖，F(xiàn)/G)是預(yù)測(cè)蜂蜜結(jié)晶性的重要參數(shù)。已有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)F/G>1.33時(shí)，則蜂蜜長(zhǎng)時(shí)間不易結(jié)晶，當(dāng)F/G<1.11時(shí)，則蜂蜜極易結(jié)晶[20]。紫穗槐蜂蜜的F/G范圍為1.33～1.55，高于油菜蜜0.95[21]、棗花蜜1.20[17]和荊條蜜1.31[17]，與洋槐蜜數(shù)值1.43[22]相當(dāng)，說(shuō)明紫穗槐蜂蜜不易形成結(jié)晶，與實(shí)際情況一致。

蜂蜜在釀造過(guò)程中，蔗糖在消化酶的作用下轉(zhuǎn)化為還原糖，因而一般成熟蜂蜜中的蔗糖含量較低[3]。GB 14963—2011中規(guī)定一般蜂蜜中蔗糖含量不高于5%。由表2可知，紫穗槐蜂蜜中蔗糖含量均小于2.42%，平均值為0.96%，均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2 揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果與分析

蜂蜜中揮發(fā)性成分的種類和數(shù)量是衡量蜂蜜品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)測(cè)定紫穗槐蜜揮發(fā)性成分，代表性樣品總離子流色譜圖如圖2所示。紫穗槐蜂蜜中共檢測(cè)出78種，其中醇類14種，芳香類6種，醛類16種，酸類11種，萜烯類3種，酮類13種，烷烴類8種，酯類4種等，詳見電子增強(qiáng)出版附表(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.028912)。

1-甲苯；2-庚醛；3-苯甲醛；4-苯乙醛；5-順式芳樟醇氧化物；6-芳樟醇；7-壬醛；8-苯乙醇；9-苯基腈；10-癸醛圖2 紫穗槐蜜揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in A.fruticosa honey

紫穗槐蜂蜜的揮發(fā)性成分種類和數(shù)量對(duì)比見圖3，表明其揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量較多的為醛類、醇類和酮類，含量最高的為醛類(38.30%)，醇類(31.70%)和萜烯類(7.54%)物質(zhì)，其總含量達(dá)到77.54%。該結(jié)果與JERKOVI等[10]報(bào)道的醇類是紫穗槐蜂蜜主要揮發(fā)性物質(zhì)的結(jié)論一致。

圖3 紫穗槐蜂蜜中不同類型揮發(fā)性成分的數(shù)量和相對(duì)含量Fig.3 Quantities and relative amounts of different kinds of volatile components in A.fruticosa honey

對(duì)紫穗槐蜂蜜中單體揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含量較高的物質(zhì)分別為苯乙醇(19.46%)、苯乙醛(14.03%)、苯甲醛(2.56%)和2,4-二叔丁基苯酚(2.56%)等。苯乙醛為棗花蜜主要揮發(fā)性成分[23]，在棗花蜜[23]、荔枝蜜[24]、蕎麥蜜[11]等蜂蜜中均有存在，但含量較低，說(shuō)明苯乙醇可能是紫穗槐蜂蜜特征性的揮發(fā)性成分，有望作為紫穗槐蜂蜜鑒別的特征標(biāo)識(shí)化合物。

壬醛在本研究的大部分紫穗槐樣品中均有檢出，且含量較高(平均含量13.54%)，是紫穗槐蜂蜜中主要的醛類物質(zhì)之一。已有研究在棗花蜜中檢測(cè)出較高含量的壬醛[23,25]，椴樹蜜、荊條蜜、洋槐蜜和苕子蜜等蜂蜜樣品中也有少量檢出[25]，對(duì)比結(jié)果表明壬醛是我國(guó)蜂蜜中一種常見揮發(fā)性成分。

芳樟醇及其衍生物是紫穗槐蜜中另一類重要化合物，主要包含順式芳樟醇氧化物(4.09%)、反式芳樟醇氧化物(1.79%)、芳樟醇(1.81%)、氧化芳樟醇(0.71%)、反式芳樟醇3,7-氧化物(0.62%)、丁香醛(0.58%)等。芳樟醇及其衍生物在大宗蜜種如棗花蜜[23]、荊條蜜[25]、油菜蜜[26]、洋槐蜜中均有檢出，順式芳樟醇氧化物是洋槐蜜中主要揮發(fā)性成分[9]。小蜜種如荔枝蜜[24]、栗子蜜[26]、柑橘蜜[27]也均有檢出，且芳樟醇衍生物為西班牙柑橘蜜的特征揮發(fā)性成分[27]。結(jié)果表明，芳樟醇及其衍生物是包括紫穗槐蜜在內(nèi)的蜂蜜中一類常見的揮發(fā)性物質(zhì)。

此外，紫穗槐蜂蜜中還含有少量的酸類揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括乙酸(1.87%)、異辛酸(1.28%)、壬酸(1.21%)等。

3 結(jié)論

采用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)8批紫穗槐蜜的理化指標(biāo)(水分、酸度、淀粉酶值、羥甲基糠醛、還原糖、蔗糖)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，其水分含量范圍為15.5%～17.8%，酸度范圍為14.8～25.8 mL/kg，淀粉酶值的范圍為27.2～70.6 mL/(g·h)，5-羥甲基糠醛含量不超過(guò)28.7 mg/kg，還原糖含量為65.9%～71.1%，蔗糖含量不超過(guò)2.42%，各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)紫穗槐蜜的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，共檢出揮發(fā)性物質(zhì)78種，主要包括醛類、醇類、酸類、萜烯類、芳香類等物質(zhì)。含量較高的物質(zhì)為苯乙醇、苯乙醛、壬醛，其中，與文獻(xiàn)比對(duì)結(jié)果表明，苯乙醇是紫穗槐蜂蜜的特征揮發(fā)性成分。綜合全文結(jié)果表明，紫穗槐蜂蜜具有酶值高、揮發(fā)性成分豐富的特點(diǎn)。

本研究對(duì)中國(guó)特色紫穗槐蜂蜜的理化指標(biāo)和揮發(fā)性成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析和評(píng)價(jià)，為紫穗槐蜂蜜的品質(zhì)評(píng)價(jià)和開發(fā)推廣提供了一定的技術(shù)和數(shù)據(jù)支撐。