食品有害物誘發細胞焦亡的研究進展

李浩,袁莉,駱瑩

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，西部果品資源高值利用教育部工程研究中心,陜西 西安,710119)

2001年,COOKSON等[1]首次使用細胞焦亡(pyroptosis)來形容在巨噬細胞中發現的半胱天冬酶-1(Caspase-1)依賴性細胞死亡方式,并證實細胞焦亡是一種新的程序性細胞死亡方式,其特征為依賴于Caspase-1活化,并伴有大量促炎癥因子釋放。直至2015年,邵峰院士團隊研究發現,Caspase-1并不是細胞焦亡發生的必要條件,細胞焦亡還可由脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)激活 Caspase-4/5/11引起,活化的Caspase-4/5/11通過切割激活Gasdermin家族蛋白最終誘發細胞焦亡[2-3]。因此,細胞死亡命名委員會進一步修正了細胞焦亡的定義：由Gasdermin家族蛋白介導的質膜膜孔形成的可調控性細胞死亡,經常但并不總因炎癥性Caspase的活化而完成的細胞程序性壞死[4]。

1 細胞焦亡的概念及形態學特征

細胞焦亡的形態學特征、發生及調控機制等均不同于凋亡、壞死等其他細胞死亡方式(表1)[5-8]。當細胞發生焦亡時,細胞核濃縮、DNA碎片化,細胞膜上出現直徑10～20 nm孔洞,細胞電解質平衡喪失,細胞腫脹破裂、胞內容物外釋,激發固有免疫并使之過度活化,最終導致細胞炎性死亡。可通過透射電子顯微鏡觀察細胞膜孔洞生成,以及Caspase-1 FLICA和SYTOX blue染色呈現雙陽性來觀測細胞是否發生焦亡。

表1 細胞焦亡、凋亡、自噬、壞死的特征Table 1 Characteristics of pyroptosis,apoptosis,autophagy and necrosis

2 細胞焦亡途徑及相關蛋白

細胞焦亡,是一種依賴炎性Caspase蛋白,并伴有炎癥反應的程序性細胞死亡方式,長期、過度的細胞焦亡會導致細胞死亡、機體組織損傷、器官衰竭、膿毒性休克等病理狀態[9-10]。最新研究表明,細胞焦亡本質上由炎性Caspase蛋白切割其共同底物Gasdermin-D(GSDMD)蛋白形成的N端結構域(GSDMD-NT)介導發生,即GSDMD蛋白才是細胞焦亡的執行者[2]。

2.1 Caspase家族與NLRP3炎癥小體

Caspase家族全稱為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶,共有14個成員,在細胞死亡及炎癥過程中發揮核心作用。根據細胞生物學功能和底物特異性將Caspase家族蛋白分為兩大類：與炎癥相關的Caspase和與細胞凋亡相關的Caspase。其中,炎癥相關的Caspase也與細胞焦亡密切相關[11],包含：Caspase-l、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11。

炎癥小體是一種多聚蛋白復合物。已發現的炎癥小體有NLRP3、AIM2、Pyrin、NLRC4、NLRP1,其中NLRP3炎癥小體的研究最為廣泛、深入。NLRP3炎癥小體由NLRP3受體蛋白先后募集凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD)和Caspase-1前體(Pro-Caspase-1)構成。NLRP3炎癥小體形成后,Pro-Caspase-1蛋白會自剪切形成具有活性的Caspase-1,從而啟動細胞焦亡。據報道,細胞內、外源刺激物或危險信號,如：二氧化硅、石棉、細菌、病毒、真菌、細菌毒素、三磷酸腺苷等,均可激活NLRP3炎性小體,繼而誘發細胞焦亡[12]。

2.2 細胞焦亡途徑

最新研究指出,細胞焦亡是GSDMD蛋白介導發生的一種程序性細胞死亡方式,同時伴有大量炎性因子釋放,如IL-1β和IL-18等[2-3]。它是機體受到病原微生物侵襲時啟動的一種保護性免疫防御反應,但是長期、過度的細胞焦亡會誘發多種炎癥性和免疫性疾病。細胞焦亡廣泛參與動脈粥樣硬化、肝炎和肝纖維化等疾病的發生發展[13-14]。

根據依賴的炎性Caspase和外界刺激不同,細胞焦亡被分為依賴Caspase-1的經典焦亡途徑和依賴Caspase-4/5/11(Caspase-4、Caspase-5或Caspase-11)的非經典焦亡途徑(圖1)[15]。其中,經典焦亡途徑：細胞中Caspase-1蛋白以無活性酶原形式(Pro-Caspase-1)存在。當細胞受到外界刺激(有毒物質、病原體、輻射等)后,Pro-Caspase-1通過構成NLRP3等炎癥小體而被激活成具有酶活性的Caspase-1,Caspase-1繼而特異性地將GSDMD蛋白切割活化形成N端結構域(GSDMD-NT)和C端結構域(GSDMD-CT),GSDMD-NT進一步通過寡聚化在細胞膜上形成膜孔,最終導致細胞破裂、死亡;同時,活性Caspase-1將促炎性因子白介素1β前體(Pro-IL-1β)和白介素18前體(Pro-IL-18)剪切為成熟型IL-1β和IL-18,經膜孔釋放,并通過誘導其他炎性因子(如 IL-6,TNF-α)、黏附分子和趨化因子等合成來擴大炎癥反應。非經典焦亡途徑：細胞受到細菌LPS刺激后,LPS脂質部分直接與Caspase-4/5/11結合促進它們活化;活化的Caspase-4/5/11剪切GSDMD形成GSDMD-NT,啟動焦亡進程;同時,GSDMD-NT也可通過激活NLRP3炎癥小體活化Caspase-1,Caspase-1進而剪切Pro-IL-1β形成IL-1β,并外釋、產生炎癥。

圖1 細胞焦亡途徑Fig.1 Pyroptosis pathway

2.3 GSDMD蛋白在細胞焦亡中的作用

GSDMD蛋白是Gasdermin家族一員,是所有炎性Caspase(Caspase-1/4/5/11)的共同底物,也是人類和鼠科動物細胞焦亡的直接執行者[3]。發生細胞焦亡時,GSDMD蛋白被活化的Caspase-1/4/5/11蛋白切割成具有親脂性和成孔活性的GSDMD-NT,以及具有親水性和結構自抑作用的GSDMD-CT;GSDMD-NT繼而選擇性地與細胞膜內膜結合并寡聚化形成直徑10～20 nm的膜孔,引起細胞膜滲透性紊亂,最終導致細胞溶脹、破裂,發生焦亡性死亡;同時,GSDMD-NT還能促進炎性因子IL-1β和IL-18大量釋放[16-17],激發強烈的炎癥反應。

3 食品有害物誘發肝臟組織細胞焦亡的相關分子機制

肝臟是食品有害物損害機體的主要靶器官。大量研究報道[23-25,28],食品有害物可通過誘導肝細胞焦亡引發一系列肝臟疾病。如苯并(α)芘、黃曲霉毒素B1、As2O3等(表2);且相關分子機制如圖2所示。

圖2 食品有害物誘發細胞焦亡的相關分子機制Fig.2 Molecular mechanism of cell pyroptosis induced by food hazards

3.1 苯并芘

苯并芘作為一種多環芳烴類物質,是由苯與芘稠合而成。它有2種同分異構體,分別是：苯并(α)芘(3,4-苯并芘)和苯并(e)芘(1,2-苯并芘),前者毒性更強[18]。一方面,食品在油炸、燒烤等高溫條件下,其中的油脂、膽固醇等會發生熱裂解反應,經環化、聚合,從而生成苯并(α)芘[19];另一方面,苯并(α)芘由人類生活、生產中使用的煤炭、石油等燃料不完全燃燒產生[20]。肝臟是苯并(α)芘的主要靶器官[21-22]。前期研究發現,20 μmol/L苯并(α)芘處理HL-7702人肝細胞24 h后,細胞相對電導率、NO釋放量、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放率顯著升高;同時HL-7702人肝細胞內焦亡特征指標Caspase-1、IL-1β、IL-18的蛋白表達量增多[23]。說明苯并(α)芘可誘導HL-7702人肝細胞發生焦亡性損傷。基于此,LI等[24]研究發現天然黃酮異葒草素通過降低電導率、LDH和NO水平,抑制Pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、iNOS、Cox-2蛋白表達量,降低IL-1β和IL-18的mRNA水平,減弱由苯并(α)芘誘導的人肝細胞焦亡性損傷。同時,有研究證明苯并(α)芘通過PI3K/Akt信號通路誘導HL-7702人肝細胞焦亡性死亡[25]。

3.2 黃曲霉毒素B1

黃曲霉毒素是一組毒性極強的二吹喃香豆素的衍生化合物,1993年被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)認定為I類致癌物[26]。其中,黃曲霉毒素B1毒性最強,可嚴重損傷肝臟組織[27]。張力引[28]研究發現,采用1 mg/kg黃曲霉毒素B1隔天灌胃C57BL/6小鼠,4周后處理組小鼠肝組織中NLRP3、ASC、IL-1β、GSDMD的蛋白水平升高、IL-1β分泌增多,表明黃曲霉毒素B1能誘發肝臟組織炎癥反應;另外采用20 μmol/L黃曲霉毒素B1對HepaRG人肝細胞進行處理,24 h后處理組細胞LDH釋放率、IL-1β、活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量均顯著升高,NLRP3、ASC、IL-1β、GSDMD蛋白表達量增多,焦亡細胞數目增多。張力引[28]在成功建立焦亡細胞模型的基礎上利用環氧合酶-2去磷酸化修飾調控處理組細胞,結果顯示焦亡細胞數目、NLRP3等焦亡相關蛋白表達量有所降低,同時間接說明黃曲霉毒素B1可誘導肝細胞發生依賴于NLRP3炎癥小體的焦亡性損傷。

3.3 As2O3

大量流行病學調查顯示,砷的長期暴露會導致肝損傷、心血管代謝異常等疾病[29]。其中,肝臟是砷代謝的主要器官[30]。邱天明[31]研究了As2O3誘導非酒精性脂肪肝/非酒精性脂肪性肝炎的相關機制,結果發現As2O3能夠促進NLRP3炎癥小體、Caspase-1等參與HepG2細胞焦亡,為砷中毒相關疾病控制提供新的思路。

除以上食品有害物外,有研究發現攝入過量的銅離子和長期高脂飲食也會導致肝臟組織細胞焦亡性損傷。SU等[32]發現雞肝細胞經CuCl2處理后ROS含量、膜電位升高,焦亡細胞數目增多,說明Cu2+通過刺激肉雞肝線粒體呼吸產生大量ROS,造成細胞脂質過氧化,發生焦亡性損傷。張裕恒[33]研究結果表明,活性氧清除劑NAC、Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK的加入均可降低雞肝細胞中Caspase-1、IL-1β、IL-18的蛋白表達量,表明Cu2+是通過ROS介導的Caspase-1途徑誘導雞肝細胞焦亡。此外,隨著人們生活水平不斷提高,高脂肪食物攝入量占飲食結構的比例逐年升高。大量研究表明,高脂飲食是肝臟疾病發生發展的主要誘因之一[34]。陳璐等[35]研究發現C57BL/6小鼠攝入高脂飲食后,肝組織中Caspase-1、NLRP3等蛋白表達量升高,同時使得下游炎癥因子IL-1β分泌變多,從而導致焦亡細胞增多,肝臟損傷加重,充分證實NLRP3-Caspase-1信號通路與焦亡的關聯性。

唐標等[36]指出,降脂理肝湯能夠減輕高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝癥狀,其干預機制與抑制非經典的細胞焦亡途徑有關。降脂理肝湯的干預能顯著降低Caspase-11的水平,較低的Caspase-11水平會影響GSDMD蛋白活化,進而減輕非酒精性脂肪肝癥狀。同時,吳柳等[37]利用下瘀血湯干預改善非酒精性脂肪性肝炎,其機理之一是降低NLRP3蛋白表達、下調NLRP3炎癥小體相關基因。因此可將細胞焦亡關鍵基因作為靶點,研發干預和治療非酒精性脂肪肝/非酒精性脂肪性肝炎的相關保健食品和藥品。

4 食品有害物誘發免疫組織細胞焦亡的相關分子機制

免疫細胞是免疫系統的主要組成部分,在防御病原體入侵、協調機體系統等方面有重要作用。當機體細胞因外來病原微生物入侵可能發生焦亡性死亡時,免疫細胞將會被招募用于清除病原物,以維持機體內環境穩定,從而緩解機體細胞的焦亡性損傷[38]。據報道,一些食品有害物也可通過誘發免疫組織細胞焦亡損害機體健康,如表2所示。

表2 食品有害物誘發細胞焦亡性損傷Table 2 Food hazards induce pyroptosis

4.1 晚期糖基化產物

晚期糖基化終產物(advanced glycation end products,AGEs)是葡萄糖或其他還原糖(如半乳糖和果糖)與氨基酸、核苷酸堿基或脂肪酸反應形成糖基化分子時形成的一組不同的化合物[39]。體內AGEs水平過高可導致疾病[40]。大量研究表明,AGEs通過與細胞表面受體結合或與機體蛋白質交聯,改變其結構和功能,從而促進氧化應激和炎癥反應[41]。

晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin,AGE-alb)是AGEs的代表物質之一。張昭強等[42]使用AGE-alb預處理RAW264.7巨噬細胞,與空白組相比細胞活力降低,LDH釋放率升高、IL-1β和IL-18分泌增多,NLRP3蛋白表達量增加,Caspase-1活性增強,充分證明AGE-alb成功誘導RAW264.7巨噬細胞焦亡性損傷。為驗證AGE-alb是否通過NLRP3-Caspase-1信號通路引起細胞焦亡,張昭強等[42]采用NLRP3特異性抑制劑MCC950作用RAW264.7巨噬細胞,結果發現MCC950可以顯著抑制AGE-alb誘導的細胞焦亡,同時證實AGE-alb通過NLRP3-Caspase-1信號通路誘導免疫細胞焦亡性損傷。

4.2 棉酚

棉酚(gossypol,GOS)是從棉花的種子、根和莖中提取的天然產物[43]。GOS一方面因為多種藥理學活性,在防御害蟲和病原體方面發揮重要作用[44]。另一方面因其細胞毒性,可誘導山羊精原干細胞、小鼠生精細胞發生細胞凋亡[45-46]。GOS作為一種具有毒性的多酚類化合物,關于其是否對免疫細胞中炎癥小體和細胞焦亡產生影響等,目前尚未清楚。為此,林秋茹[47]以小鼠腹腔巨噬細胞以及RAW 264.7細胞系為研究對象,進行深入探究。結果發現GOS可以誘導經LPS刺激產生的巨噬細胞細胞膜破碎及Pro-IL-1β、Pro-Caspase-11的大量釋放,最終使其發生細胞焦亡;GOS也可以誘導缺乏ASC的RAW 264.7細胞發生焦亡,說明GOS誘導巨噬細胞焦亡并不依賴于經典的Caspase-1活化。雖然GOS可以致使大量Pro-IL-1β的產生,但僅能誘導低水平的成熟IL-1β的分泌。同時,利用其他的經典焦亡抑制劑并沒有能夠抑制GOS誘導的細胞焦亡,表明GOS可能是通過非經典炎癥小體通路誘導細胞發生焦亡性損傷。

4.3 鎘

大量研究顯示,攝入過量的鎘會導致免疫組織損傷,引發骨質疏松癥、腎功能不全、糖尿病、癌癥等[48]疾病。血管內皮細胞是鎘的重要靶細胞,鎘會通過誘導血管內皮細胞釋放多種炎性因子,產生一系列心血管疾病[49]。為研究鎘誘導細胞焦亡的機制,陳海燕[50]使用80 μmol/L CdCl2對HUVECs人臍靜脈內皮細胞進行處理,24 h后鎘處理組HUVECs人臍靜脈內皮細胞Caspase-1活性增強,LDH釋放率升高,細胞發生焦亡性損傷。另外分別使用Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK、NLRP3 siRNA以及ROS和mt ROS特異性抑制劑NAC和Mito-TEMPO對HUVECs細胞進行預處理,結果顯示均可以緩解細胞發生焦亡性損傷。因此鎘誘導細胞發生焦亡的機制為：首先通過誘導氧化應激,產生大量ROS和mt ROS刺激活化NLRP3炎癥小體,從而發生Caspase-1的經典焦亡途徑。

5 小結

細胞焦亡是一種不同于壞死、自噬、凋亡等的細胞死亡方式,它分為依賴Caspase-1的經典焦亡途徑和依賴Caspase-4/5/11的非經典焦亡途徑。食品有害物可通過誘導肝臟組織細胞和免疫組織細胞發生焦亡,損傷機體健康。全面深入研究細胞焦亡的分子機制,可以為食品有害物毒性控制提供新的思路。目前研究發現,細胞焦亡的發生會引發各種炎癥反應,因此應當更加著眼于充分了解焦亡參與炎癥反應發生發展的關系和機制,將有助于開發相關靶向藥物,對臨床患者的康復治療具有重要意義。