乳源肽的抗衰老功效研究

欒媛媛，謝雨佳，李政，王娟，彭小杰，李明逸，肖珊珊，曾星星，張少輝,

（1.上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 200240；2.浙江輝肽生命健康科技有限公司，浙江 溫州 325800）

0 引言

人體的皮膚老化分為內在老化和外在老化兩種形式。內在老化即隨著時間流逝人體正常的老化現(xiàn)象；外在老化則是由于一些外部因素導致的老化，其中紫外線(UV,Ultraviolet)照射被認為是誘發(fā)皮膚損傷和老化的主要外部環(huán)境因素，占外在老化的80%[1]。UV根據波長范圍的不同可以劃分為3種：長波紫外UVA（320～400 nm）、中波紫外UVB（290～320 nm）和短波UVC（100～290 nm）[2]。其中UVB造成的輻射最強，能夠穿透表皮到達真皮細胞，導致DNA的損傷[3]；誘導ROS的產生和促炎因子的增加[4]。UVB照射的皮膚內ROS的含量會出現(xiàn)顯著升高，從而導致基質金屬蛋白酶含量的升高，進一步導致I型膠原蛋白的降解[5]。

近幾年有研究表明某些植物提取物具有抗光老化的效果，如當歸根提取物可通過抑制MAPK/AP-1通路磷酸化和誘導TGF-β的激活，抑制基質金屬蛋白酶（MMPs）的活性，從而促進膠原蛋白合成[6]；佛手柑多酚組分可通過促炎細胞因子IL-1β的調節(jié)恢復細胞活力，增強端粒酶活性[7]，以及茶葉提取物[8]、廢咖啡渣[9]、大豆肽[10]和海洋生物中提取的膠原蛋白肽[11]均具有抗光老化的效果。而對于乳源多肽的研究多集中于抗癌[12]、抗氧化[13]、降血壓[14-15]、降血糖[16]等。

本文旨在探討牛乳蛋白經酶解后產生的多肽，其在經UVB照射后的人皮膚成纖維細胞中的抗光老化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人皮膚成纖維細胞(human foreskin fibroblasts-1,HFF-1)，中國科學院上海細胞庫；乳源肽，浙江輝肽生命健康科技有限公司；96孔和6孔細胞培養(yǎng)板，血球計數板等。

DMEM高糖不完全培養(yǎng)基和胎牛血清，美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素溶液(100×)、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；胰酶細胞消化液（含酚紅）和1×PBS緩沖液，Biosharp；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、活性氧ROS檢測試劑盒，南京凱基生物生物技術股份有限公司；逆轉錄試劑盒 (PrimeScriptTMRT reagent Kit)、SYBR green法實時定量PCR試劑盒(TB Green Premix Ex TaqTM)，日本Takara公司。

1.2 儀器與設備

倒置顯微鏡，日本尼康公司；離心機，中國醫(yī)療器械（上海）股份有限公司；GI36T高壓滅菌鍋，廈門至微儀器公司；BJ-2CD超凈工作臺，上海屹明凈化設備有限公司；Froma 700低溫冰箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；多功能酶標儀，瑞士帝肯公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，德國MEMMERT公司；NanoDrop超微量分光光度儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Thermal熱循環(huán)儀，美國Applied Biosystems公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

將HFF-1細胞用含1%100×雙抗、15%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃，二氧化碳5%，濕度95%。將凍存細胞復蘇培養(yǎng)2～3 d后，置于倒置顯微鏡下觀察，當細胞達到80%～90%聚合度時，用PBS清洗，胰酶消化后進行傳代培養(yǎng)，傳代后的細胞接種于96孔板或6孔板，用于下一步實驗。

1.3.2 細胞活力測定和UVB照射

本實驗主要探討不同濃度的乳源肽對細胞的毒性作用。將傳代后的HFF-1細胞以1×104/mL的密度接種于96孔板（100μL/孔），經24 h培養(yǎng)后，將不同濃度（0.05、0.08、0.10、0.12、0.50、1.00、2.50、5.00 mg/mL）的乳源肽添加到96孔板中，設為實驗組，對照組添加15%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)48 h。根據MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑使用方法，將5×MTT溶液稀釋成1×MTT溶液，以50μL/孔的量添加到96孔板中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，震蕩使甲臜充分溶解后，迅速用酶標儀于490 nm波長處檢測OD值，以對照組為基礎計算細胞活力。

為探討UVB對HFF-1細胞造成的亞細胞毒性的輻照劑量，采用不同紫外輻照劑量（1.2、2.4、3.6、4.8 J/cm2）對HFF-1細胞進行照射，輻照劑量用紫外輻照計進行測定，將傳代后的HFF-1細胞以1×104/mL的密度接種于96孔板（100μL/孔），經48 h培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS緩沖液覆蓋薄薄的一層連續(xù)3次照射，每次間隔12 h，在最后一次照射后24 h測定細胞活力。

為探究預給予不同濃度的乳源多肽對UVB損傷的HFF-1細胞活力的修復作用，將傳代后的HFF-1細胞以1×104/mL的密度接種于96孔板（100μL/孔），經24 h培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)液為含有不同濃度（0.08、0.1 mg/mL）的乳源多肽，對照組為含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS緩沖液覆蓋薄薄的一層，用3.6 J/cm2的紫外輻照劑量對細胞進行紫外照射（對照組避光），照射結束后，棄掉PBS緩沖液，加入培養(yǎng)液，每次間隔12 h，共照射3次，在最后一次照射結束后24 h進行細胞活力測定。每組設6個平行。

1.3.3 ROS測定

在UVB照射后12、24 h時后分別進行ROS的測定。ROS用2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)熒光探針進行測定，將用無血清培養(yǎng)液稀釋后的DCFH-DA加入到96孔板中，37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌3次，多功能酶標儀測定熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。同時將96孔板中加入MTT，孵育4 h后用酶標儀測定OD值，作為內參。每組設6個平行。

1.3.4β-半乳糖苷酶測定

與衰老有關的胞內β-半乳糖苷酶在細胞衰老時可表現(xiàn)出高酶活性，為測定乳源肽的抗衰老情況，在最后一次照射后48 h，吸棄培養(yǎng)液，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min后，用PBS洗滌3次，加入染色工作液，于37℃孵育過夜，在倒置顯微鏡下觀察計數，每次計400個，計3次。

1.3.5 ELISA測定

用ELISA方法對I型膠原蛋白和基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）的活性進行測定。將細胞接種于96孔板中，在最后一次照射24 h后使用ELISA試劑盒進行活性測定。

1.3.6 RT-qPCR測定

在最后一次照射后12 h和24 h分別用RNA提取試劑盒提取RNA，提取的RNA用NanoDrop超微量分光光度儀進行濃度及純度測定，用逆轉錄試劑盒進行RNA逆轉錄（20μL），逆轉錄條件為：37℃、15 min；85℃、5 s；4℃。逆轉錄后的cDNA根據試劑盒使用說明用PCR儀進行擴增，反應分兩步：95℃、30 s(Step 1);95℃、5 s，60℃、30 s，GOTO 39(Step 2)。溶解曲線條件為：95℃，65～95℃，增量0.5℃。每次實驗取3個平行。1.4 數據分析

實驗結果以實驗平均值±標準差（SD）的形式表示，用EXCEL，SPSS和GraphPad 9軟件對實驗數據進行分析，分析結果顯著性以*：P＜0.05表示。

2 結果與討論

2.1 細胞活力測定和UVB照射

對細胞給予不同濃度的乳源肽，來測定乳源肽對細胞的毒性作用。如圖1所示，與多肽濃度為0 mg/mL的對照組相比，乳源肽在0.5～2.5 mg/mL的范圍內，對于細胞增殖均無明顯的抑制作用，其中0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的乳源肽對細胞增殖均有顯著性的促進作用。這與本實驗室之前乳源肽相關實驗結果一致[17]，說明乳源肽在0.1 mg/mL的添加量以下對細胞增殖有較好的促進作用，因此選用0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的乳源肽進行功效實驗。

圖1 乳源肽濃度對細胞活力的影響

為確定合適的UVB輻照劑量，對HFF-1細胞分別進行1.2、2.4、3.6、4.8 J/cm2劑量的照射。24 h后的細胞活力測定結果如圖2所示。結果表明，當紫外輻照計量達到3.6 J/cm2時，對細胞增殖有顯著性抑制作用，可顯著降低細胞活力，而當輻照劑量為2.4 J/cm2時，對細胞活力無顯著性影響。因此，選用3.6 J/cm2的紫外輻照強度用于測定預給予乳源肽對UVB照射后的細胞活力的影響，選用2.4 J/cm2的紫外輻照強度用于預給予乳源肽對UVB損傷細胞的抗光老化影響研究。

圖2 紫外輻照劑量對細胞活力的影響

用3.6 J/cm2的紫外輻照強度測定預給予0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的乳源肽對UVB照射后的細胞活力的影響，同時選用棕櫚酰五肽-4作為陽性對照。棕櫚酰五肽-4能很好地促進膠原蛋白的合成，具有抗皺效果，其商品名為Matrixyl，目前已廣泛的用于抗皺化妝品中[18]。結果表明，如圖3所示，UVB（3.6 J/cm2）照射后的細胞較未被照射的細胞活力均有下降，而預給予乳源肽和棕櫚酰五肽-4的細胞相較于陰性對照組來說，其細胞活力均有增長，但都沒有顯著性差異，說明乳源肽對于UVB照射的細胞活力無顯著影響，且會一定程度的促進細胞活力的增長。

圖3 預給予乳源肽對紫外損傷細胞的細胞活力影響

2.2 乳源肽可抑制ROS的生成

炎癥反應和ROS的產生是導致光損傷主要原因[19]。ROS的產生會對下游多個信號通路產生影響，如MAPK信號通路，TGF-β/SMAD信號通路等，對信號通路中的多種衰老因子，如JNK,p38,NF-kB,TGF-β產生影響。最終導致細胞內抗氧化酶的效率降低，抗氧化物質的減少，導致DNA損傷的累積，并對胞外基質產生影響[4,20-21]。研究表明，對于紫外誘導的小鼠細胞來說，在紫外照射后1 h內會有明顯的變化，在輻照后25 min內ROS含量會顯著性的增高，25 min后逐漸下降并恢復到正常水平[5]。

因此，ROS在紫外輻照導致的光老化中發(fā)揮巨大的作用，可用于探究乳源肽對于抗光老化的效果。如圖4所示，在2.4 J/cm2的亞細胞毒性劑量下分別測定了紫外照射后12 h和24 h的ROS產量，結果表明在紫外照射12 h后，經紫外照射后的細胞內ROS呈極顯著的升高(P<0.001)，而預給予乳源肽組及陽性對照組都呈現(xiàn)極顯著性的降低，其中預給予0.08 mg/mL的乳源肽相較于0.1 mg/mL的乳源肽添加量效果更為顯著；在紫外照射24 h后，實驗組與陰性對照組細胞內的ROS都逐漸趨于正常生長的細胞水平，說明對于紫外照射的細胞來說，ROS含量會顯著升高并在24 h后恢復正常，而預給予乳源肽的細胞會在細胞接受紫外照射時起到修復作用，防止ROS的升高。說明在紫外照射前預先添加乳源肽有助于紫外損傷的細胞內ROS的清除，并降低ROS的產量，有效防止紫外輻照所導致的氧化損傷。

圖4 乳源肽對紫外誘導的ROS產量的影響

2.3 乳源肽可抑制紫外照射的細胞中β-半乳糖苷酶活性

正常體細胞在培養(yǎng)過程中在經過有限數量的細胞分裂后，即進入不可逆的衰老階段[22]。而β-半乳糖苷酶是測定衰老細胞的常見指標，其主要以pH為6.0時細胞內的β-半乳糖苷酶活性為衰老指標，細胞老化越嚴重，β-半乳糖苷酶活性就越高[23]。β-半乳糖苷酶試劑盒可使衰老細胞呈深藍色，即陽性，在普通光學顯微鏡下即可觀察。該指標在多個研究中被用于判斷細胞衰老情況[24-25]。

如圖5所示，乳源肽組可明顯抑制紫外照射后的細胞衰老，對于紫外照射的細胞，其β-半乳糖苷酶陽性細胞的比例是對照組的3.29倍，而乳源肽組和陽性組的陽性細胞都出現(xiàn)了顯著性的降低，說明預給予乳源肽可能會有效延緩紫外照射所導致的細胞衰老現(xiàn)象。

圖5 β-半乳糖苷酶活性及陽性細胞比例

2.4 預給予乳源肽可抑制MMP-1的分泌，促進I型膠原蛋白的合成

細胞經一定程度的紫外照射后，會產生細胞損傷，而損傷累積到一定程度時，便會出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，產生一系列衰老相關的分泌表型（SASP,senescenceassociated secretory phenotype），包括一些細胞因子，生長因子和基質金屬蛋白酶等[26]。同時，早有研究表明紫外輻照引起的光老化會導致膠原蛋白、彈性蛋白等胞外基質的減少，從而產生皺紋，阻礙傷口的愈合[27]。

為研究乳源肽的抗光老化效果，用ELISA方法測定了不同處理方式的細胞其MMP-1和I型膠原蛋白的分泌量。如圖6(a)，在紫外照射后24 h，經紫外照射的細胞（NC）相較于未受紫外照射的對照組細胞（C），其MMP-1的分泌量有極顯著的升高，是對照組的1.76倍，而預給予不同濃度的乳源肽及陽性對照組相較于陰性對照組都有極顯著的下降，預給予0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的乳源肽組分別下降了30.38%和27.42%。而圖6(b)的結果顯示，細胞經紫外照射后，其I型膠原蛋白的分泌量會顯著下降，而實驗組和陽性對照組都很好地抑制了I型膠原蛋白的降解，相較于陰性對照組其分泌量有極顯著的升高。圖6的實驗結果表明，紫外照射會誘導細胞內MMP-1的分泌增多，從而導致I型膠原蛋白的降解，而乳源肽能夠很好地抑制MMP-1的分泌，從而防止I型膠原蛋白的降解。

圖6 乳源肽對紫外誘導的細胞中MMP-1及I型膠原蛋白分泌量的影響

為進一步驗證預給予乳源肽抗光老化的效果及對MMP-1的調控，分別提取了最后一次UVB照射后12、24 h細胞內的RNA進行RT-qPCR實驗以測定細胞內MMP-1及I型膠原蛋白的mRNA表達情況。如圖7(a)所示，紫外照射后的細胞在照射后24 h內MMP-1的表達量均呈現(xiàn)極顯著的升高，其中在照射后12 h的表達量是照射后24 h的1.5倍，而經乳源肽處理后的細胞與陰性對照組相比顯著的抑制了MMP-1的表達。相應的，圖7(b)的結果顯示，經紫外照射的細胞在照射后24 h I型膠原蛋白的mRNA表達量出現(xiàn)顯著性下降，而經乳源肽處理后的細胞在24 h內I型膠原蛋白的mRNA表達量均出現(xiàn)顯著性的升高，且出現(xiàn)表達量隨時間的增長而降低的趨勢。說明乳源肽通過調控MMP-1和I型膠原蛋白mRNA的表達來控制其分泌，可抑制紫外照射細胞中MMP-1的表達，并且促進I型膠原蛋白的表達。而乳源肽對MMP-1基因的下調可能與ROS含量的降低有關。

圖7 乳源肽對紫外誘導的細胞中MMP-1及I型膠原蛋白mRNA表達量的影響

之前研究表明，紫外引發(fā)的DNA氧化損傷會導致NF-κB的激活[28]。而很多細胞因子其基因的啟動子或增強子部位都存在可與NF-κB結合的位點，NFκB的激活會導致炎癥反應與光老化，其中涉及炎癥因子TNF-α,IL-6 and IL-10與光老化相關基質金屬蛋白酶MMP-2 and MMP-9的調控[29]。同時，研究表明在成纖維細胞與U937巨噬細胞的共培養(yǎng)體系中，成纖維細胞分泌的IL-6細胞因子會對U937巨噬細胞分泌MMP-1產生影響[30]。由于紫外照射會誘導炎癥因子，如IL-6的表達，IL-6會繼而誘導MMP-1的表達[31]。同時，對于紫外損傷的修復也有可能通過對損傷細胞DNA的修復來調控MMP-1的表達以及防止MAPKs的磷酸化[32]。另外紫外誘導的ROS的產生，會促進MAPK信號通路的磷酸化，繼而誘導下游激活蛋白（AP-1）的生成，AP-1能通過上調MMP-1的表達來降低I型膠原蛋白的含量，并且抑制轉化生長因子TGF-β1的表達[33]，而TGF-β1可促進膠原蛋白的合成[34]。因此本實驗中乳源肽對MMP-1調節(jié)可能是ROS及炎癥因子調控的結果，對I型膠原蛋白的調節(jié)可能與TGF-β1有關。

3 結束語

本實驗通過HFF-1細胞探究了預給予乳源肽對紫外損傷細胞的抗光老化效果。結果表明，在細胞經多次紫外照射后，會產生衰老現(xiàn)象，添加一定濃度的乳源肽會有效防止細胞的老化，0.08 mg/mL和0.1 mg/mL的乳源肽均能有效抑制紫外照射細胞內ROS的升高，通過控制MMP-1的基因表達來抑制MMP-1的分泌，從而減少對膠原蛋白的降解，同時乳源肽可促進I型膠原蛋白的表達和分泌，與未處理過的紫外損傷細胞相比，其含量顯著升高。本研究為乳源肽在化妝品行業(yè)的應用奠定了基礎，而其相關的具體機制通路還有待探究。