基于SPME-GC-MS萃取荸薺揮發性風味物質研究

李官麗，伍淑婕，羅秀娟，林亞南，黎小椿*，羅楊合，*

（1.賀州學院食品科學與工程技術研究院，廣西 賀州 542899；2.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006）

我國荸薺的產量占全球95%以上。因荸薺的外形和顏色像馬蹄，在廣西和廣東等地稱之為馬蹄。荸薺果肉脆嫩多汁，清甜可口，具有獨特的清香風味[1-2]。食品風味?？扛泄僭u價，但感官評價極易受品評員感情、情緒和偏好的影響[2-3]。因此，采用現代儀器分析方法分析荸薺風味物質，可將抽象的感覺量化為相關數據，對研究荸薺獨特風味具有重要意義。目前，揮發性風味物質提取技術主要有同時蒸餾萃取法（simultaneous distillation extraction，SDE）[4]、溶劑萃取法（solvent extraction，SE）[5]、動態頂空制樣法（dynamic headspace sampling，DHS）[6]、固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）[7]等。SPME 是目前應用最廣泛的樣品前處理技術，具有簡便、快速、高效、綠色環保等優點。SPME萃取頭狀表面涂漬一層具有吸附劑的熔融高分子聚合物，涂層材料的種類、厚度對萃取效果影響很大，故需要通過優化萃取條件來盡可能吸附更多的物質[6-7]。固相微萃取結合氣相色譜-質譜技術（solidphase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS） 可實現對復雜樣品或多組分混合物中未知樣品的定性定量分析，具有可靠、靈敏度高、無需溶劑、更接近樣品真實性等特點，已成為各種領域揮發性風味物質分析的必備檢測手段[8-9]。本文采用SPME-GC-MS優化荸薺揮發性成分萃取方法，并結合氣味活度值確定荸薺主要揮發性風味物質，為我國特色農產品荸薺風味研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荸薺（桂蹄2號，產自廣西賀州）：市售，挑選新鮮、無腐爛、無病蟲害、大小均勻為試驗材料；2，4，6-三甲基吡啶（98.0%）：上海甄準生物科技有限公司；氦氣（純度≥99.999%）：賀州華嗵實驗儀器貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

MR Hei-Tec（CN）磁力攪拌器：德國 Heidolph 公司；JJ 1000型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；PTX-FA110S電子天平：美國康州HZ電子科技有限公司；TRACE 1300-ISQQD GC-MS聯用儀：美國Agilent公司；固相微萃取手動進樣手柄、20 mL固相微萃取頂空瓶、50/30 μmDVB/CAR/PDMS Gray（二乙烯基苯/碳分子篩/聚二乙基硅氧烷）萃取頭、85 μm PA White（聚丙烯酸酯）萃取頭、100 μm PDMS Red（聚二乙基硅氧烷）萃取頭、75 μm CAR/PDMS Black（碳分子篩/聚二乙基硅氧烷）萃取頭、65 μm CAR/PDMS Blue（碳分子篩/聚二乙基硅氧烷）萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將新鮮荸薺洗凈、削皮后用破碎機破碎30 s，迅速稱取一定量樣品置于20 mL頂空瓶中，封口，將老化好的萃取頭置于轉速為100 r/min的恒溫磁力攪拌器中萃取，萃取結束后立即插入GC-MS聯用儀解吸。每組樣品3個平行。

1.3.2 SPME萃取條件的優化

1.3.2.1 單因素試驗

以新鮮荸薺為原料，選取對萃取效果影響較大的因素，進行單因素試驗。以化合物含量和總峰數為主要考察指標，研究萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS Gray、85 μm PA White、100 μm PDMS Red、75 μm CAR/PDMS Black、65 μm CAR/PDMS Blue）、萃取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、萃取時間（30、35、40、45、50 min）、解吸時間（1、2、3、4、5 min）、樣品量（3、4、5、6、7 g）對萃取效果的影響?？疾炷骋粏我蛩貢r，其他固定條件：萃取頭 65 μm CAR/PDMS Blue、萃取溫度 60℃、樣品用量5 g、萃取時間為40 min、解吸時間為3 min。

1.3.2.2 正交試驗設計

綜合單因素試驗結果，選擇萃取溫度、萃取時間、樣品量、解吸時間設計四因素三水平L9（34）正交試驗，確定SPME分離富集揮發性成分的條件。

表1 正交試驗因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiments

1.3.3 SPME-GC-MS分析條件

SPME條件：萃取頭在使用前應在GC進樣口老化一定時間（65 μm CAR/PDMS Blue萃取頭在280℃老化35 min，85 μm PA White萃取頭在 280℃老化 60 min，50/30 μm DVB/CAR/PDMS Gray萃取頭在270℃老化30 min，100 μm PDMS Red、75 μm CAR/PDMS Black 萃取頭分別在250℃老化30 min）。

GC條件：色譜柱為TG-5MS型色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為 250℃；載氣為高純He（純度≥99.999%）；流速為 1.000 mL/min；分流方式：不分流進樣；程序升溫：初始溫度45℃，保持2 min，以4℃/min上升到250℃，保持3 min。

MS條件：電離方式為電子轟擊（elector ionization，EI）模式；電離能量70 eV；離子源溫度230℃；接口溫度280℃；掃描方式為全掃描監測模式，質量掃描范圍3 m/z～500 m/z。

1.4 定性與定量分析

定性方法：揮發性氣味物質采用Xcalibar軟件進行分析，將檢測到的質譜信息與Library-Mainlib標準普庫相匹配，僅報道正反匹配度均超過800或有一個超過900（最大值為1 000）的揮發性風味物質。

定量方法：參考程華峰等[10]的方法采用內標法定量，以 2，4，6-三甲基吡啶作內標物，按式（1）計算各揮發性物質的含量。

式中：V1為揮發物的峰面積；V2為內標的峰面積；0.2為內標的含量，μg。

1.5 氣味活度值評價方法

采用氣味活度值（odor activity value，OAV）評價各化合物對總體風味的貢獻[11-12]，通過式（2）計算OAV。

式中：C為揮發性風味物質的濃度，ng/g；T為揮發性風味物質的氣味閾值，ng/g。

1.6 數據處理

采用Origin8.5及SPSS20.0軟件進行數據處理和繪圖，采用Excel 2016軟件對荸薺中揮發性物質測定結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 荸薺揮發性物質萃取條件優化

2.1.1 固相微萃取頭對萃取效果的影響

萃取頭是固相微萃取裝置的核心部件。根據相似相溶原理，萃取頭富集能力的差異取決于涂層的極性、厚度和揮發性物質的極性、沸點和分配系數等因素，選擇合適的萃取頭可富集更多揮發性物質[13]。PA型萃取頭適宜極性半揮發性化合物，DVB/CAR/PDMS型萃取頭對非極性和混合極性化合物富集能力較強，PDMS型萃取頭對非極性揮發性物質萃取效果較好，CAR/PDMS型萃取頭對小分子化合物萃取效果較好[14-15]。當萃取溫度60℃、萃取時間40 min、解吸時間3 min、樣品量5 g時，不同型號萃取頭對荸薺揮發性物質萃取效果見圖1。

圖1 萃取頭對荸薺揮發性物質萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction head on the extraction effect of volatile substances from CWC

從化合物含量來看，65 μm CAR/PDMS Blue萃取頭所得到揮發性物質含量最多，其余依次為85 μm PA White、100 μm PDMS Red、75 μm CAR/PDMS Black、50/30 μm DVB/CAR/PDMS Gray。從總峰數來看，65 μm CAR/PDMS Blue＞85 μm PA White＞50/30 μm DVB/CAR/PDMS Gray ＞100 μm PDMS Red ＞75 μm CAR/PDMS Black。由此可知，65 μm CAR/PDMS Blue型萃取頭吸附荸薺揮發性物質種類和含量最多，故選取85 μm CAR/PDMS Blue萃取頭進行檢測。

2.1.2 萃取溫度對萃取效果的影響

萃取溫度對目標物的萃取效果具有雙重影響。在一定范圍內，溫度升高揮發性物質的分子運動速率加快，使其在兩相中迅速達到平衡，可有效提高萃取效率。但SPME是一個放熱過程，長時間高溫萃取會使固定相發生分解，從而降低固定相與樣品的分配系數，影響萃取頭對目標化合物的吸附。因此，選擇合適的萃取溫度可有效提高后續分析的靈敏度[16]。萃取溫度對荸薺揮發性物質萃取效果的影響見圖2。

圖2 萃取溫度對荸薺揮發性物質萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperatures on the extraction of volatile compounds from CWC

由圖2可知，當選擇65 μm CAR/PDMS Blue萃取頭、萃取時間40 min、解吸時間3 min、樣品量5 g時，隨著萃取溫度的升高，揮發性物質總峰數和含量先呈遞增趨勢，當達到80℃時化合物含量和總峰數基本趨于穩定。雖然90℃時揮發性物質總峰數略有增加，但溫度過高會使部分不穩定物質發生異構化或降解，不能較好反映荸薺的真實風味特征。此外，高溫會縮短萃取頭使用壽命[17]。綜合考慮，選取80℃作為最佳萃取溫度。

2.1.3 萃取時間對萃取效果的影響

當氣固兩相達到吸附與解吸動態分配平衡時，固相微萃取有最大吸附量。萃取時間是指兩相達到平衡時所需的時間[14]。萃取時間對荸薺揮發性物質萃取效果的影響見圖3。

圖3 萃取時間對荸薺揮發性物質萃取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of volatile compounds from CWC

由圖3可知，當選擇65 μm CAR/PDMS Blue萃取頭、萃取溫度80℃、解吸時間3 min、樣品量5 g時，在25 min～30 min內揮發性物質含量和總峰數略有下降，到30 min～35 min內揮發性物質含量和總峰數呈急劇增加趨勢，35 min時達到最大值，說明此時萃取頭已達到飽和狀態。繼續延長萃取時間，會導致某些不穩定化合物從萃取頭解吸，反而使荸薺揮發性物質含量和種類呈下降趨勢[18]。綜合考慮，選取35 min為最佳萃取時間。

2.1.4 解吸時間對萃取效果的影響

解吸時間對萃取頭的解吸程度和萃取效果影響較大。若解析時間過長，萃取頭在高溫下使用壽命縮短，導致大量硅氧化物脫落降低目標物含量，影響檢測效率。反之則可能導致解吸不完全而污染下一個樣品的分析檢測，影響分析結果的準確性[19-20]。解吸時間對荸薺揮發性物質萃取效果的影響見圖4。

圖4 解吸時間對荸薺揮發性物質萃取效果的影響Fig.4 Effect of desorption time on the extraction of volatile compounds from CWC

由圖4可知，當選擇65 μm CAR/PDMS Blue萃取頭、萃取溫度80℃、萃取時間35 min、樣品量5 g時，解吸時間為2 min時荸薺揮發性物質含量和總峰數達到最大，隨后兩者均在減小，說明此時已基本上完全解吸，故選取2 min作為最佳解吸時間。

2.1.5 樣品量對萃取效果的影響

樣品量對荸薺揮發性物質萃取效果的影響見圖5。

圖5 樣品量對荸薺揮發性物質萃取效果的影響Fig.5 Effect of sample amount on the extraction of volatile compounds from CWC

由圖5可以看出，當選擇65 μm CAR/PDMS Blue萃取頭、萃取溫度80℃、萃取時間35 min、解吸時間2 min時，樣品量在3 g～7 g內荸薺的揮發性物質含量與總峰數整體上隨著樣品量的增大呈先升后降的變化趨勢，當樣品用量為5 g時達到最大值，繼續增加樣品量則出現下降趨勢。這是因為樣品量過多時，一方面會使樣品受熱不均勻萃取頭無法過量吸附，另一方面萃取頭容易接觸到樣品造成污染[21]。故選取樣品量為5 g較為適宜。

2.2 正交試驗結果與分析

正交試驗結果如表2所示。

表2 正交試驗結果及極差分析Table 2 Orthogonal test results and range analysis

由表2可知，以荸薺中揮發性物質的總峰數和化合物含量為評價指標時，各因素主次順序均為萃取溫度＞萃取時間＞樣品量＞解吸時間，因此選擇D因素作為誤差進行方差分析。從表3可知，萃取溫度、萃取時間對總峰數和化合物含量均具有顯著性影響（P＜0.05），對統計學有重要意義；但是樣品量對結果的影響不顯著（P＞0.05），無統計學意義。

表3 方差分析結果Table 3 Results of analysis of variance

將最優組合A2B3C1D3、A2B3C1D1與正交試驗（表2）中萃取效果最好的第6組（A2B3C1D2）試驗結果進行比較驗證，得到最優組合A2B3C1D1總峰數為65，化合物含量464.10 ng/g，均比A2B3C1D3（總峰數為62，化合物含量421.36ng/g）組合和A2B3C1D2（總峰數為64，化合物含量430.24ng/g）組合的總峰數和化合物含量大，最終確定的最優組合為A2B3C1D1，即選用萃取溫度為80℃，萃取時間為40 min，樣品量為4 g，解吸時間為1 min。

2.3 荸薺揮發性成分分析

根據上述所得最優萃取條件，對荸薺揮發性物質進行分析，所得色譜峰分離效果良好，結果見圖6。

圖6 荸薺揮發性成分總離子流圖Fig.6 Total ion flow of volatile components of CWC

通過SPME-GC-MS分析得到的荸薺揮發性物質共65種，其中烴類化合物種類最豐富，共檢出19種（含量20.64%），其次是醇類13種（含量18.42%）、醛類12種（含量 38.68%）、酯類 10種（含量16.28%）、其他類6種（含量3.73%）、酸類3種（含量1.70%）、酮類2種（含量0.55%）。由此可見，醛類化合物含量最高。

荸薺揮發性物質SPME-GC-MS分析結果見表4。

表4 荸薺揮發性物質SPME-GC-MS分析結果Table 4 SPME-GC-MS analysis results of the volatile substance of CWC

續表4 荸薺揮發性物質SPME-GC-MS分析結果Continue table 4 SPME-GC-MS analysis results of the volatile substance of CWC

醛類主要來源于脂肪的氧化降解，主要呈現花香、脂香及果香味。在所檢測到的揮發性成分中含量高且嗅覺閾值極低，對荸薺總體風味有重要貢獻[10]。由表4可見，本文共檢測到12種醛類，其中含量最高的壬醛是油酸氧化產物，占揮發性物質總含量的17.50%，其氣味閾值為1 μg/kg，具有令人愉快的花香、果香和清香，但也常被認為是土腥味的重要成分。含量第二高的癸醛具有濃郁的水果香氣、甜香氣以及花香，其氣味閾值較低，為2 μg/kg，對荸薺風味有重要的貢獻。此外，（E，E）-2，4-壬二烯醛、反式-2-癸烯醛含量也較高，分別呈現明顯的脂肪香氣、肉香味的氣味[10]，對荸薺的風味有較大貢獻。

烴類被認為不具有香氣的化合物，且其氣味閾值較高，對風味的貢獻較小[21]，但也有少量烯烴或芳香族化合物除外。如在荸薺中檢出含量較高的D-檸檬烯、檸檬烯環氧化物，它們屬于單環單萜類化合物，具有典型的新鮮橙子香味和檸檬香味[22]，對荸薺的香氣有一定的貢獻。

酯類主要由游離脂肪酸和脂肪醇經酯化形成，主要呈現脂香、芳香的氣味，但其氣味閾值較高，對荸薺總體風味貢獻不大[22]。在荸薺中檢測到含量較高的原膜散酯主要呈現甜香味，含量第二高的棕櫚酸乙酯具有奶油香、脂香味，但棕櫚酸乙酯的氣味閾值較高，為1 500 μg/kg[11]，因此其對荸薺風味影響不大。

醇類來源于脂肪酸氧化，氣味閾值一般為500μg/kg～20 000 μg/kg[23]，但 1-辛烯-3-醇較為特殊，它是亞油酸的氫過氧化物降解產物，其閾值僅為1 μg/kg，表現出類似蘑菇香氣和泥土的氣味，對荸薺總體風味具有重要貢獻[24]。其他含量較高的醇類物質如正辛醇、1-壬醇、E，E，Z-1，3，12-癸三烯-5，14-二醇，主要呈現脂香、青草香、花香，但它們閾值較高對荸薺風味貢獻不大。

酸類和酮類物質氣味閾值均明顯高于同分異構體的醛類，對風味物質的影響較小。其中，香葉基丙酮主要貢獻獨特的蠟味、木香和熱帶水果香，但其氣味閾值較高，對荸薺風味影響不大[25]；酸類化合物是醛進一步氧化的產物，且其氣味閾值較高，對荸薺整體的揮發性風味有微弱的調節作用[23]。

醚類、呋喃類、酚類物質是美拉德反應的產物，這些化合物的存在會使荸薺的風味更加濃郁、飽滿[25]。六氫-4，6，6，7，8，8-六甲基-環戊并[G]-2-苯并吡喃賦予荸薺濃郁的果香味，辛基十四烷基醚通常也呈現出令人愉悅的香甜味，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚主要貢獻木香、焦香以及煙熏味，1，2-苯異噻唑具有清香、堅果香、烤香、蔬菜香，但它們含量較低，對荸薺風味貢獻不大。甲氧基-苯基肟具有霉味、肉香味，有文獻指出甲氧基苯基等苯類物質是從受污染的環境中富集而來，表明荸薺生長環境對其風味也有一定的影響[23]。

2.4 荸薺特征揮發性風味物質分析

食品的特征風味是由揮發性物質在風味體系中的含量與氣味閾值共同決定[11]。一般認為，OAV≥1，說明該物質對總體風味有重要貢獻，在一定范圍內其值越大表明該化合物對整體風味的貢獻越大；0.1＜OAV＜1，說明該物質對總體風味有修飾作用[11，26]。通過查閱相關書籍和文獻[16-19，22-27]共找到17種揮發性氣味閾值，通過公式（2）求出各揮發性氣味物質的OAV值，結果見表5。

表5 荸薺揮發性成分的氣味活度值Table 5 Odor activity value of the volatile components of CWC

由表 5 可知，（E，E）-2，4-壬二烯醛在荸薺樣品中的OAV值最大，為253.67，具有肉香、烤香[24]，對荸薺樣品的香氣貢獻最大。其次，壬醛、癸醛、反式-2-癸烯醛在荸薺樣品中的OAV值也較大，主要呈現青草味、甜香味和典型的水果香氣[10]，對荸薺特征風味具有重要貢獻。2-十一烯醛、正己醛、十二醛、1-辛烯-3-醇這4種香氣物質在荸薺樣品中1＜OAV＜10，主要呈現清香、脂香、蘑菇香氣以及柑橘香味[26-28]，對荸薺樣品的香氣具有重要貢獻。0.1＜OAV＜1的有5種，分別是反-2-辛烯醛、十一醛、苯乙醛、正辛醇、D-檸檬烯，說明這些揮發性物質對荸薺香氣有一定的修飾作用。綜上所述，荸薺的特征揮發性風味物質為（E，E）-2，4-壬二烯醛、壬醛、癸醛、反式-2-癸烯醛，它們共同賦予新鮮荸薺特有的清香和果香。

3 結論

本研究基于SPME-GC-MS技術分析荸薺的最優SPME 參數：65 μm CAR/PDMS Blue萃取頭，萃取溫度為80℃，萃取時間為40 min，樣品量為4 g，解吸時間為1 min。在此最優條件下檢出65種化合物，其中烴類最多，為19種（含量20.64%），其次是醇類13種（含量18.42%）、醛類12種（含量38.68%）、酯類10種（含量16.28%）、其他類6種（含量3.73%）、酸類3種（含量1.70%）、酮類2種（含量0.55%）。可見，醛類化合物含量最高，達到38.68%，表明醛類是荸薺主要香氣成分。通過計算OAV值確定荸薺的特征揮發性風味物質為（E，E）-2，4-壬二烯醛、壬醛、癸醛、反式-2-癸烯醛，它們共同賦予新鮮荸薺特有的清香和果香。