產芽孢菌調控五羥色胺促進胃腸動力的機制研究

黃薏佳，陳燕敏，陳豐連，王術玲

（廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

功能性胃腸疾病包括腸易激綜合征、功能性消化不良、慢傳輸性便秘等多種消化疾病，主要體現為胃腸的運動與分泌機能失調、無組織學器質性病理改變的胃腸道功能紊亂[1-2]。目前已有眾多相關研究表明，功能性胃腸疾病與腸道菌群的失調密切相關[3-4]，該類疾病的腸道菌群紊亂主要體現在瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、多爾氏菌屬（Dorea）、大腸桿菌（Escherichia coli）、鏈球菌（Streptococcus）、擬桿菌屬（Bacteroides）以及乳桿菌屬（Lactobacillus）等的豐度異常改變[5-6]，其中發生變化的多數菌屬均屬于產芽孢菌（spore-forming microbes，Sp.）。產芽孢菌作為腸道菌群的重要組成部分在近年來的研究中受到了廣泛關注，出現了越來越多關于產芽孢菌的研究與應用，其中包括食物與藥品領域的相關研究。在益生菌發酵豆奶酸奶的研究中發現，產芽孢菌中部分益生菌如凝結芽孢桿菌等被用于酸奶的發酵以提高酸奶品質[7-8]。而在臨床藥品應用上發現地衣芽孢桿菌活菌膠囊配合莫沙必利可以有效治療功能性便秘[9]，凝結芽孢桿菌也被證實對于胃腸道疾病有治療作用，已被制成凝結芽孢桿菌活菌片應用于臨床[10]。通過前期文獻調研結果推測產芽孢菌可能與功能性胃腸疾病的胃腸運動功能失調密切相關。本研究選擇以偽無菌（pseudo-germfree，PGF）小鼠為研究對象，通過體外提取產芽孢菌進行小鼠體內定殖，探討產芽孢菌能否調節小鼠胃腸動力及運動功能，并進一步研究其潛在的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康C57BL/6J雄性小鼠[（20±2）g，SPF級]：珠海百試通生物科技有限公司，動物合格證號SCXK（粵）2020-0051。實驗動物飼養在廣州中醫藥大學中藥學院實驗動物中心SPF級動物房，實驗獲得了廣州中醫藥大學中藥學院實驗動物倫理審查委員會批準。動物飼養在恒溫環境（23±1）℃，12 h明暗交替下，自由飲食飲水，定時更換小鼠墊料，適應性喂養1周。實驗前，根據體質量和隨機數字表進行完全隨機化分組，分為偽無菌小鼠組（PGF組）和產芽孢菌定殖鼠組（PGF+Sp.組），每組 6只。

1.2 試劑

TB GreenRPremix Ex TaqTMII（Tli RNase H Plus）試劑盒：TaKaRa公司；糞便基因組DNA提取試劑盒D2700：北京索萊寶科技有限公司；氨芐青霉素（98%）、硫酸新霉素（美國藥典級）、甲硝唑（99%）、萬古霉素（≥900μg/mg，V2002）：上海麥克林生化科技有限公司；2×TransTaqR-T PCR SuperMix（-dye）、Trans2KRDNA Marker：北京全式金生物技術有限公司；氯仿：天津市大茂化學試劑廠；苯酚紅：天津市致遠化學試劑有限公司；厭氧培養基（gifu anaerobic medium，GAM，HB8518）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（HB0177-1）：青島海博生物技術有限公司。

1.3 儀器與設備

Sub-Cell GT1704484水平式核酸電泳儀：美國BIO-RAD公司；6460三重四極桿質譜儀、1260液相色譜儀：美國Agilent公司；ABI7500熒光定量PCR儀：美國Applied Biosystems公司；JXFSTPRP-CL全自動樣品冷凍研磨儀：上海凈信實業發展有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀：賽默飛世爾科技公司；HYQX-I厭氧培養箱：上海躍進儀器有限公司；TGL-16R冷凍高速離心機：黑馬醫學儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 PGF小鼠模型建立及評價

1.4.1.1 混合抗生素溶液的配制

取抗生素適量，配制成含0.5 g/L萬古霉素及氨芐青霉素、硫酸新霉素、甲硝唑各1 g/L的混合水溶液。

1.4.1.2 PGF小鼠模型的建立

實驗動物適應性飼養1周后，設定小鼠單位給藥劑量為0.2 mL/10 g，每天灌胃混合抗生素溶液兩次，連續給藥12 d，期間將飲用水換成混合抗生素溶液，以無菌飼料飼養，自由飲食、飲水。

1.4.1.3 PGF小鼠模型評價

每日定時收集小鼠糞便，置于-80℃保存。參照文獻[11-12]，選擇糞便懸液涂板法和腸桿菌基因間保守重復序列-聚合酶鏈式反應（enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）法對PGF小鼠模型進行評價。

涂板法：取0.1 g小鼠糞便于0.9 mL生理鹽水中振蕩混勻，用三層紗布過濾，得糞便菌懸液，稀釋為10-4濃度，分別涂布于GAM固體培養基和胰酪大豆胨瓊脂培養基上，前者置于厭氧培養箱，后者置于37℃培養箱，分別倒置培養2 d后，進行菌落計數。

ERIC-PCR法：取小鼠糞便，按照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書，提取細菌總DNA。以Versalovic等[13]設計的 ERIC-PCR 引物（上游 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，下游 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′）對糞便中的細菌進行擴增。反應體系：細菌總 DNA 2 μL（50 ng）、2× EasyTaq PCR SuperMix（-dye）12.5 μL、上游引物 F 1 μL、下游引物 R 1 μL、ddH2O 8.5 μL，總體積 25 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94℃變性 1 min，52℃退火 1 min，72℃延伸3 min（35個循環）；72℃終延伸10 min。取擴增產物5 μL加入1 μL上樣緩沖液，經1%瓊脂糖凝膠電泳（100 V、40 min；75 V、100 min）后，取膠塊于凝膠成像儀進行成像分析。條帶識別由天能凝膠成像系統自帶軟件進行處理。

1.4.2 產芽孢菌的提取、驗證及定殖

參照文獻[14]，本實驗采用氯仿提取法提取產芽孢菌菌液。收集3名健康志愿者的新鮮糞便，志愿者3個月內未接受抗生素治療，取樣前未攝入益生元或益生素，并且無腸道疾病史，收集過程盡量保持無菌狀態，樣本于-80℃保存。提取前在4℃下解凍糞便樣本，將不同志愿者的糞便混合均勻，稱取糞便樣本3 g于50 mL離心管內，在超凈臺中加入30 mL無菌的L-半胱氨酸鹽酸鹽預還原磷酸緩沖鹽溶液，渦旋混合后加入3%氯仿，混合均勻，并在厭氧培養箱內37℃孵育2 h。孵育結束后，用三層紗布過濾，將濾液轉移至新試管中，通入二氧化碳氣體以去除氯仿，得產芽孢菌菌液。取產芽孢菌菌液和糞便菌懸液各3 mL，4 000 r/min離心10 min，保留沉淀菌體，按照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書，提取細菌總DNA。

根據產芽孢菌常見菌屬（Clostridium、Ruminococcus、扭鏈瘤胃球菌屬（Ruminococcus_torques_group）、Dorea）設計引物，并選擇非產芽孢菌菌屬（Lactobacillus和Bacteroides）作為陰性對照，取產芽孢菌菌液及糞便菌懸液DNA進行菌屬聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）驗證鑒定。反應體系：菌液DNA 1 μL、2× EasyTaq PCR SuperMix（-dye）12.5 μL、上游引物 F 1 μL、下游引物 R 1 μL、ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。PCR擴增反應在PCR儀上進行，反應程序設置：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 10 s，30個循環；72℃保持 10 min。取5 μL PCR擴增產物加入1 μL的上樣緩沖液，經2%瓊脂糖凝膠電泳（110 V，45 min）后，取膠塊于凝膠成像儀進行成像分析。

PGF造模后的實驗動物隨機分為2組，偽無菌小鼠組（PGF組）和產芽孢菌定殖組（PGF+Sp.組），每組6只，PGF+Sp.組按照0.1 mL/10 g的劑量灌胃給予產芽孢菌菌液，持續給菌兩周，PGF組灌胃同體積磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）。收集小鼠糞便，提取細菌總DNA，通過熒光定量核酸擴增檢測方法（quantitative polymerase chain reaction detecting system，qPCR）檢測產芽孢菌定殖情況。按照SYBR GreenRPro Taq HS預混型qPCR試劑盒操作說明，在7500 Real Time PCR System進行qPCR反應，并按照儀器默認程序進行熔解曲線的繪制，評價反應產物的特異性。

取測量平均擴增循環數（cycle threshold，CT）值做數據分析。常用管家基因16S rRNA用作內參基因來標定目標mRNA的相對表達。目標mRNA相對表達采用2-ΔΔCT法。測定的目標基因和內參基因的引物序列見表1。

表1 測定菌屬表達所用基因引物序列Table 1 Gene primers used to determine the expression of bacteria

1.4.3 小腸推進率與胃殘留率測定

小鼠末次給菌定殖后需禁食不禁水24 h，解剖前20 min，以0.1 mL/10 g灌胃體積給小鼠灌胃0.002 g/mL苯酚紅溶液。

1.4.3.1 小腸推進率測定

沿腹部中線剪開皮膚，用棉簽將腹部腸道脂肪清理干凈以免影響觀測，暴露胃組織后剪取胃及小腸。取幽門至回盲部的完整小腸輕輕平鋪于解剖板上，測量全長。觀察苯酚紅推進的最終位置，測量其到幽門的距離。可借助滴加適量的0.1 mol/L NaOH溶液是否變為紫色來判斷苯酚紅推進位置，測量最終位置到胃幽門的長度，作為苯酚紅推進的距離。小腸推進率的計算公式如下。

1.4.3.2 胃殘留率測定

吸取0.75mL苯酚紅溶液（0.002g/mL）加入0.1mol/L NaOH溶液定容至25 mL，上下顛倒混勻后，精密量取0.050、0.225、0.500、0.725、0.950、1.175 mL 混合溶液并分別加入純水定容至10 mL，即得各系列梯度的標準溶液。采用紫外可見分光光度計測定標準溶液于560 nm處吸光度，并繪制標準曲線。

精密量取NaOH溶液（0.1 mol/L）10 mL置于表面皿中，將胃組織浸于NaOH溶液中并沿胃大彎剪開，將胃組織內容物充分洗滌，收集洗滌溶液并上下顛倒混勻，室溫下5 000 r/min離心15 min，吸取上清液2 mL并用純水定容至10 mL，充分混勻后，利用紫外可見分光光度計測定其吸光度（測定波長為560 nm），即為測定液OD值。胃殘留率的計算公式如下。

1.4.4 液相色譜-質譜法檢測結腸和血漿中五羥色胺、色氨酸（tryptophan，TRP）的含量

采用液相色譜-質譜法（liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS）[17]檢測 5-HT、TRP的含量。取50μL血漿加入5μL9μg/mL茶堿溶液和200μL預冷乙腈，稱取約20mg結腸組織加入9倍量生理鹽水勻漿，勻漿液加入5μL內標和800μL預冷乙腈。渦旋1min后，離心（4℃，14000r/min，15min），取上清液氮吹干燥，以100 μL流動相（0.1%甲酸-水）復溶。

色譜條件：Waters XSelect HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；溫度 30℃；流動相 A 為 0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液；流速0.2 mL/min；梯度洗脫條件如表2所示。

表2 LC-MS/MS梯度洗脫條件Table 2 LC-MS/MS Gradient elution condition

質譜條件：電噴霧離子源；離子源溫度300℃；錐孔氣為氮氣，流速為5 L/min，去溶劑氣為氮氣，流速為11 L/min。其中去溶劑氣溫度為300℃；質量掃描范圍m/z 100～1 000；正離子模式下毛細管電壓為3 500 V，噴嘴電壓為500 V。

1.4.5 逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-qPCR）測定結腸色氨酸羥化酶 1（tryptophan Hydroxylase 1，TPH1）mRNA 表達

取20 mg結腸組織提取總RNA，以磁珠研磨法在全自動勻漿機中勻漿（60 Hz，120 s），離心抽提結腸組織中總RNA，用無酶水復溶。采用Evo M-MLV反轉錄試劑盒進行去gDNA反應后，進行逆轉錄反應。逆轉錄成功后的cDNA置于-20℃冰箱保存待測。

RT-qPCR反應參照SYBR GreenRPro Taq HS預混型qPCR試劑盒操作說明書進行。反應結束后，進行熔解曲線的繪制，評價反應產物的特異性。目標mRNA相對表達采用2-ΔΔCT法計算，內參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。目的基因引物序列見表3。

表3 目的基因引物序列Table 3 Primers of target genes

1.5 數據分析

運用Graphpad Prism 6.0統計軟件進行數據分析，2組數據間進行單因素方差分析（獨立樣本t檢驗），檢驗標準為P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 PGF小鼠模型評價

2.1.1 涂板培養驗證

PGF小鼠糞便懸液平板涂板見圖1。

圖1 PGF小鼠糞便懸液平板涂板Fig.1 Pseudo-germfree mice’s fecal suspension coated plate

小鼠口服抗生素飲用水后，GAM培養基平板及胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上菌落數目隨給藥時間的延長逐漸減少，造模第11天時，基本達到無菌落狀態，證明小鼠糞便中厭氧菌及需氧菌在造模后含量下降，達到偽無菌狀態，造模成功。

2.1.2 ERIC-PCR驗證

PGF小鼠糞便懸液腸道菌總DNA ERIC-PCR指紋圖譜見圖2。

圖2 PGF小鼠糞便懸液腸道菌總DNA ERIC-PCR指紋圖譜Fig.2 ERIC-PCR fingerprinting of intestinal bacteria obtained from pseudo-germfree mice

如圖2所示，通過天能凝膠成像系統自帶軟件標記條帶，隨抗生素給藥時間的延長，糞便細菌DNA的ERIC-PCR條帶亮度變暗，條帶數目減少，證明隨造模時間變化，小鼠糞便細菌豐度及數目減少。抗生素給藥第11天，ERIC-PCR條帶數目減少至1條且條帶亮度較暗，證明小鼠已達到偽無菌狀態，造模成功。

2.2 產芽孢菌液菌屬PCR驗證

根據文獻[14]產芽孢菌菌液16S rRNA測序結果，本實驗選擇其中最為常見的4個產芽孢菌菌屬：Clostridium、Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group和Dorea，對提取得到的產芽孢菌菌液DNA進行PCR鑒定，并選擇腸道菌群中常見的非產芽孢菌菌屬Lactobacillus和Bacteroides作為陰性對照，結果如圖3所示。

圖3 產芽孢菌液菌屬PCR驗證Fig.3 PCR verification of spore-forming microbes

由圖3可知，電泳可見有不同長度的特異條帶，與糞便菌懸液PCR電泳條帶相比，產芽孢菌菌液仍保留有屬產芽孢菌的 Clostridium、Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group和Dorea的菌屬條帶，而并未擴增出非產芽孢菌Lactobacillus和Bacteroides條帶。電泳結果與文獻報道的16S rRNA測序結果相一致，表明此方法成功提取出了糞便菌懸液中的產芽孢菌。

2.3 qPCR驗證產芽孢菌定殖情況

用 Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group 和Dorea的特異性引物，以各組小鼠糞便細菌DNA為模板進行qPCR擴增有單峰的熔解曲線及特異熒光曲線生成，并給出了定量結果，見圖4。

圖4 qPCR驗證產芽孢菌定殖情況Fig.4 Real-time quantitative PCR analysis of colonization of spore-forming microbes

由圖4可知，PGF+Sp.組小鼠體內屬產芽孢菌的Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group 及 Dorea顯著富集，相對含量顯著上升，證明小鼠體內產芽孢菌定殖成功。

2.4 產芽孢菌對小鼠胃腸動力的影響

2.4.1 小腸推進率測定

產芽孢菌對小鼠胃腸動力的影響見圖5。

圖5 小腸推進率測定Fig.5 Determination of intestinal thrust rate

由圖5可知，將產芽孢菌定殖體內后，小鼠小腸中的苯酚紅溶液推進距離更遠，小腸推進率顯著提高，與PGF小鼠相比差異顯著（P＜0.01）。結果表明，產芽孢菌的定殖可以有效推進小腸運動，增強腸道蠕動功能。

2.4.2 胃殘留率測定

小鼠胃殘留率測定結果見圖6。

圖6 胃殘留率測定Fig.6 Determination of gastric residual rate

由圖6可知，與PGF小鼠相比，產芽孢菌定殖后小鼠胃組織中殘留的苯酚紅溶液較少，胃殘留率下降，具有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，產芽孢菌可以增強胃動力，減少胃殘留率。

2.5 產芽孢菌對5-HT含量的影響

結腸及血漿中5-HT濃度及5-HT/TRP比值見圖7。

圖7 產芽孢菌對5-HT含量的影響Fig.7 Effect of spore-forming microbes on 5-HT

5-HT作為一種神經遞質，不僅分布于大腦中可以調節大腦皮層活動，還可以在腸道內合成以增強胃腸道蠕動功能[19]，近年來在功能性胃腸疾病中廣受關注，并且有相關研究表明部分腸道微生物可以有效調節或參與到體內5-HT代謝通路[20]。如圖7所示，與PGF小鼠相比，產芽孢菌的定殖可以提高結腸及血漿中5-HT含量以及5-HT/TRP比值，其中在結腸中的變化差異更為顯著。結果表明產芽孢菌可以有效調節機體內結腸及血漿中5-HT的含量，這與胃腸道蠕動功能的增強有密切聯系。

2.6 產芽孢菌對小鼠結腸中TPH1酶mRNA表達水平的影響

各組小鼠結腸組織中TPH1酶mRNA表達情況見圖8。

圖8 產芽孢菌對小鼠結腸中TPH1酶mRNA表達水平的影響Fig.8 Effects of spore-forming microbes on TPH1 mRNA expression in colon

TPH1是機體外周系統合成5-HT的關鍵限速酶，可以介導機體內色氨酸分解成為5-羥色氨酸，進而脫羧生成5-HT，通過此途徑產生的5-HT占體內總量的90%以上。因此，TPH1的表達與5-HT含量有密切聯系[21]。由圖8可知，通過RT-qPCR測定結腸中TPH1酶mRNA表達情況，結果表明與PGF組相比，產芽孢菌定殖導致TPH1酶mRNA表達極顯著下調（P＜0.001）。這種下調可能是機體在暴露于微生物負擔后對5-HT過度釋放的適應性反應，從而調節腸道5-HT系統的超敏性[22]。在胃腸蠕動亢進的腹瀉型腸易激綜合征患者腸道中5-HT含量升高、TPH1表達下降[23]，將正常小鼠的糞便定殖至無菌小鼠體內可以有效提高腸道內5-HT含量，并降低TPH1表達[22]。同時在體外培養實驗中發現有些產芽孢菌（如Bacillus cereus）可以直接代謝生成5-HT[24]。因此推測產芽孢菌可通過代謝生成5-HT，使血漿、結腸中5-HT含量上升，負反饋調節TPH1表達下調。

3 討論與結論

本研究通過抗生素雞尾酒法建立偽無菌小鼠模型，并采用氯仿提取法體外提取產芽孢菌菌液，通過口服灌胃的方式在偽無菌小鼠體內定殖產芽孢菌，檢測小鼠的胃腸運動功能及5-HT的含量變化情況。結果表明，產芽孢菌定殖后小鼠的小腸推進率、胃殘留率有明顯差異，胃腸蠕動能力增強。此外，產芽孢菌還可以提高小鼠結腸及血漿中5-HT的含量，其中結腸的變化情況更為顯著。結合文獻調研及實驗結果，得出以下結論：產芽孢菌的定殖可通過提高腸道和血漿中5-HT含量水平以促進胃腸運動。胃腸蠕動過慢會導致消化液分泌減少，出現食欲下降、腹脹、惡心、便秘等消化不良的癥狀，而產芽孢菌的定殖可以有效增強胃腸運動功能，這為功能性消化不良、便秘型腸易激綜合征等疾病的治療提供了一個新思路，可以通過選擇性增加有益于胃腸運動的產芽孢菌以促進相關疾病的治療。然而，為了能在腸道菌群干預措施中獲得最佳效益，還需要進一步闡明產芽孢菌的定殖對機體是否會產生其他未知的影響以及產芽孢菌中具體菌種的調節作用，相關研究內容有待后期實驗做進一步探討。