小龍蝦下腳料中蝦青素和甲殼素提取工藝研究

張樂宏，蓋永強*，王鵬，王耀宗，程致遠，甄天元，樸美子，李巖*

（1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.濟寧海關，山東 濟寧 272000；3.濰坊英軒實業有限公司，山東 濰坊 262499；4.青島農業大學海洋科學與工程學院，山東 青島 266109）

小龍蝦，作為一種淡水蝦，其肉質鮮美，且肉中蛋白質與必需氨基酸含量豐富，脂肪含量低，深受廣大人民群眾的歡迎[1]。由于其龐大的銷量，每年會產生大量的蝦殼（含12%～16%的鈣、10%～15%的甲殼素和7%以上的殼聚糖）[2]、蝦頭等下腳料（含有豐富的蝦青素[3]、蛋白質[4]、氨基酸[5]等）。這些下腳料如處理不當，會造成環境污染和資源浪費。目前，關于小龍蝦下腳料精深加工方面的研究主要集中在提取蝦青素和蝦紅素、提取甲殼素和殼聚糖、制作小龍蝦調味料、提取蛋白質及類脂、提取蝦油、提取抗氧化小肽類與生物鈣類等方面[6]。然而，由于小龍蝦下腳料中不同成分的提取工藝存在差異性，實際生產過程中，一般僅對某種成分進行提取，難以做到對多種成分連續、高效提取，制約了小龍蝦產業可持續發展。

蝦青素，是一種經濟價值非常高的類胡蘿卜素[7]。研究表明，蝦青素素有“超級維生素E”[8]的美譽，其具有抗氧化[9]、抗炎[10]、抑制腫瘤[11]、養眼[12]、增進機體免疫力[13]等生理功能。目前，蝦青素提取的方法分為兩大類：天然提取、化學合成?；瘜W合成工藝復雜，生成副產物，且化學合成的蝦青素在生物活性、生物吸收以及著色性能等方面都比不上天然蝦青素。提取天然蝦青素的方法有以下幾種：油溶法、有機溶劑提取法、堿提法、超臨界CO2流體萃取法[14]。甲殼素，又稱幾丁質，是一種線性高分子多糖[15]。研究表明，甲殼素可調節機體pH值、提高免疫力、預防癌變[16]、控制血糖[17]等。常見的甲殼素提取方法主要有以下幾種：化學法（工業常用，易對環境造成危害）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）法（成本過高）、酶解法（成本高、耗時長）[18]、微生物發酵法（耗時長）[19]、離子液體提取法（不可回收循環，存在安全風險）[20]等。

本研究通過有機溶劑（乙酸乙酯）浸提法提取蝦青素，之后利用浸酸浸堿法提取甲殼素。連續浸提工藝可以最大程度利用下腳料資源，有利于工業化連續生產。本研究利用小龍蝦下腳料中的蝦殼，經單因素和響應面試驗分別優化了蝦青素、甲殼素最佳提取工藝，實現兩種成分的高效、連續提取，為小龍蝦副產物高值化利用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小龍蝦：市售；蝦青素標準品：上海江萊生物科技有限公司；鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）、無水乙醇、草酸（分析純）：萊陽市康德化工有限公司；乙酸乙酯、高錳酸鉀（KMnO4）、二氯甲烷（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

高速萬能粉碎機（FW135）：北京市永光明醫療儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HHW-21CU-600）：上海福瑪實驗設備有限公司；恒溫振蕩器（SHA-B）：武漢格萊莫檢測設備有限公司；高速臺式冷凍干燥機（TGL-16M）：浙江賽德儀器設備有限公司；冷凍干燥機（FD-A10N-50）：冠森生物科技有限公司；紫外可見分光光度計（WFZUV-2000）：美國貝克曼公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9023A）：上海廷翌儀器設備廠；酸堿指示計（PHS-3C）、電子分析天平（AR1140）：上海奧豪斯國際貿易有限公司；循環水真空泵（SHZ-D）：上海貝侖儀器設備有限公司。

1.3 蝦青素提取工藝操作要點

蝦殼預處理：將小龍蝦殼肉分離，小龍蝦殼用清水洗凈、瀝干、-80℃冷凍，然后置于冷凍干燥機中凍干處理24 h，干燥后的蝦殼于粉碎機中24 000 r/min破碎1 min，獲得208 g蝦殼粉，干燥保存待用。

蛋白質的去除：將蝦殼粉放入燒杯，用pH2.5的HCl溶液浸泡，放入60℃保溫箱水解1 h，抽濾所得粉末進行冷凍干燥，保存待用。

蝦青素浸提液制備：稱取0.5 g蝦殼粉于離心管，加入10 mL浸提液（乙酸乙酯、二氯甲烷、無水乙醇），于35℃浸提2 h，離心，取上清液得蝦青素浸提液。

以蝦青素提取量為指標，選擇浸提試劑（乙酸乙酯、二氯甲烷、無水乙醇）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]、浸提溫度（15、25、35、45、55 ℃）、浸提時間（30、60、90、120、150、180 min）和浸提次數（1、2、3次）5個因素進行單因素試驗，分析各因素對小龍蝦下腳料中蝦青素提取量的影響。

1.4 蝦青素提取量的測定

準確稱取0.5 g蝦殼粉，用10mL乙酸乙酯將其充分溶解，在35℃環境下分別振蕩水浴2h后在4℃、6 000 r/min條件下離心10min，取其上清液在最大吸收波長471nm處測定吸光度，蝦青素提取量計算公式如下。

式中：C為樣品吸光值；D為提取液測定時的稀釋倍數；V為提取液測定前定容的體積，mL；W為蝦粉的干重，g。

1.5 響應面試驗優化蝦青素提取條件

基于單因素試驗，以蝦青素提取量為指標，對蝦青素提取的料液比、浸提溫度、浸提時間進行響應面優化設計。依據Box-Behnken的中心組合設計原理，試驗因素及水平見表1。

表1 蝦青素提取量Box-Behnken試驗因素編碼值Table 1 Encoding values of astaxanthin extraction amount Box-Behnken test factors

1.6 甲殼素提取工藝操作要點

將提取蝦青素后所得剩余固體用清水洗凈，干燥后進行以下處理。

礦物質的去除：在常溫下，在小龍蝦殼粉中分別加入不同濃度的HCl溶液，在1∶20（g/mL）料液比條件下于40℃恒溫水浴鍋中反應一定時間，用玻璃棒不斷攪拌至不產氣為止，棄溶液，水洗固體至中性。

蛋白質的去除：向錐形瓶中加入不同濃度的NaOH溶液，在1∶30（g/mL）料液比條件下于80℃恒溫水浴鍋中加熱一定時間。靜置，冷卻，過濾得固體，水洗固體至中性，抽濾后得甲殼素粗品。

甲殼素的精制：根據試驗因素，每個試驗因素分3組，每組稱取0.5g甲殼素粗品于錐形瓶中，加入10mL 0.1 mol/L的KMnO4溶液，浸泡1 h，抽濾，水洗至無色，然后加入20 mL草酸溶液，水浴加熱，直到樣品皆為白色，靜置至室溫，水洗剩余固體至中性，室溫放至真空干燥箱中干燥24 h，得白色精制甲殼素固體。

以甲殼素提取率為指標，選擇HCl濃度（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L）、HCl浸泡時間 （10、20、30、40、50 min）、NaOH 濃度（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L）和 NaOH 浸泡時間（3.5、7.0、10.5、14.0、17.5 min）4 個因素進行單因素試驗，分析各因素對小龍蝦下腳料中甲殼素提取率的影響。

1.7 甲殼素提取率的測定

稱取得到的精制甲殼素固體質量，通過以下公式計算甲殼素的提取率。

1.8 響應面試驗優化甲殼素提取條件

基于單因素試驗，以甲殼素提取率為指標，根據Box-Behnken的中心組合設計原理，對甲殼素提取工藝中HCl濃度、HCl浸泡時間、NaOH濃度、NaOH浸泡時間4個因素進行響應面設計，試驗設計因素和水平見表2。

表2 甲殼素提取率Box-Behnken試驗因素編碼值Table 2 Encoding values of chitin extraction ratio Box-Behnken test factors

1.9 數據處理

利用SPSS Statistics 26和OriginPro 9.1進行數據統計分析及繪圖，采用Design-Export10軟件對Box-Behnken中心組合試驗設計的試驗數據進行回歸分析，P＜0.05表示存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 小龍蝦下腳料中蝦青素提取工藝單因素試驗

小龍蝦下腳料中蝦青素提取工藝單因素優化結果如圖1所示。

圖1 小龍蝦下腳料中蝦青素提取工藝單因素優化結果Fig.1 Single-factor optimization results of extraction process of astaxanthin from crayfish leftovers

由圖1A可以看出，二氯甲烷作為提取溶劑時蝦青素提取量最高，無水乙醇作為提取溶劑時提取量最低，且與二氯甲烷、乙酸乙酯作為浸提溶劑時的蝦青素提取量存在顯著性差異（P＜0.05）；由于乙酸乙酯與二氯甲烷作為浸提溶劑時的蝦青素提取量差值較小，且二氯甲烷有麻醉作用，大量吸入會引起呼吸和循環中樞麻痹，不利于身體健康，為了保證試驗的持續性與安全性，將乙酸乙酯作為后續試驗中蝦青素的提取溶劑。

由圖 1B 可以看出，在料液比 1∶20（g/mL）時，蝦青素提取量最高，且與其他料液比組別的蝦青素提取量存在顯著性差異；當溶劑添加量較低時，蝦青素提取量較少，浸提效果不佳；當溶劑添加量過多時，蝦青素提取量呈下降趨勢。這可能是因為溶劑添加量較高時，提取出的蝦青素濃度低穩定性較差。因此，選取料液比為 1∶20（g/mL）進行后續試驗。

由圖1C可以看出，浸提溫度為15℃～35℃時，隨著浸提溫度的增大，蝦青素提取量也隨之增加，當浸提溫度為35℃時，蝦青素提取量達到最大值后，隨著浸提溫度增加，蝦青素提取量減少。這表明在一定范圍內，升溫有利于蝦青素的提取，而溫度過高會造成溶劑的汽化，導致提取效率降低，再者高溫會影響蝦青素的穩定性。因此，選取浸提溫度35℃進行后續試驗。

由圖1D可以看出，浸提時間在30 min～120 min時，隨著浸提時間的增加，蝦青素提取量也提高；當浸提時間為120 min時，蝦青素提取量達到最大值；當浸提時間大于120 min時，蝦青素提取量下降。這可能因為浸提時間過長，蝦青素的穩定性會遭到破壞，導致蝦青素提取量的降低。因此，選取浸提時間120 min進行后續試驗。

由圖1E可以看出，此工藝提取1次的蝦青素提取量高達60.93 μg/g，2次提取的蝦青素的提取量為4.92 μg/g，3 次提取的蝦青素提取量僅有 0.41 μg/g?？紤]到提取的工作效率和試驗成本，決定對蝦青素提取1次。

2.2 響應面法優化提取小龍蝦下腳料中蝦青素工藝

利用小龍蝦下腳料提取蝦青素的響應面試驗結果如表3所示，方差分析如表4所示。合較好，可解釋97.34%的響應值變化。料液比（A1）對蝦青素提取量有顯著影響（P＜0.05）；浸提時間（B1）、浸

表3 蝦青素提取量響應面試驗結果Table 3 Results of astaxanthin extraction amount by response surface methodology optimization

表4 方差分析結果Table 4 Results of variance analysis

在Box-Behnken Design試驗結果的基礎上將所得數據進行多元回歸擬合，得到如下回歸方程：Y=46.4+7.05A1+3.94B1+1.43C1-3.67A1B1+12.66A1C1+5.76B1C1+6.43A12+1.12B12+1.83C12。

模型F=2.65，P＜0.05意味著該回歸模型具有統計學意義，可以用模型分析預測蝦殼粉蝦青素提取方法的結果。失擬項F=2.58，P=0.190 8＞0.05，表示失擬項不顯著。相關決定系數R2=0.973 4，表明該模型與試驗擬提溫度（C1）對蝦青素提取量影響不大，且三者對蝦青素提取量影響大小為：A1＞B1＞C1。

料液比（A1）、浸提時間（B1）、浸提溫度（C1）之間的交互作用關系如圖2所示。

圖2 各因素交互作用對蝦青素提取量的影響Fig.2 Effects of interaction of various factors on the extraction amount of astaxanthin

其中料液比（A1）與浸提溫度（C1）交互作用對蝦青素提取量的影響顯著（P＜0.05），料液比（A1）與浸提時間（B1）、浸提時間（B1）與浸提溫度（C1）交互作用不顯著（P＞0.05），料液比（A1）與料液比（A1）交互作用顯著（P＜0.05）（見表4和圖2）。綜上，料液比（A1）是從小龍蝦下腳料中提取蝦青素的影響最顯著因素。這說明，控制好料液比（A1）有利于小龍蝦下腳料蝦青素的最大幅度提?。豢蛇m當減少浸提時間，降低浸提溫度，既能減少時間成本，又能降低能耗，且不會顯著影響蝦青素提取量。

響應面試驗得到蝦青素最佳提取工藝條件為料液比 1∶19.05（g/mL）、浸提時間 119.46 min、浸提溫度34.19℃。小龍蝦下腳料中蝦青素預測值Y為69.13μg/g。

為驗證響應面法所得結果的準確性，考慮到實際操作的可能性，將提取參數調整為料液比1∶19（g/mL）、浸提時間120min、浸提溫度34℃。在此條件下重復3次，得蝦青素提取量為67.40 μg/g，為預測值的97.50%。與理論預測值相比，其相對誤差小于10%。因此，本試驗所得的最佳提取工藝可靠，具有實用價值。

目前，宋慶洋等[21]研究表明，以丙酮作為蝦青素的浸提溶劑，潛江小龍蝦蝦殼中蝦青素提取量達到148.2 μg/g[料液比 1∶20（g/mL）、溫度 30 ℃、時間 2 h]。何立堅等[22]研究表明，以乙酸乙酯作為蝦青素的浸提溶劑，明蝦蝦殼中蝦青素提取量為 38.285 μg/g[料液比 1∶20（g/mL）、溫度60℃、時間2 h]。陳西廣等[23]研究表明，以乙酸乙酯作為蝦青素的浸提溶劑，海蝦蝦殼中蝦青素提取量為 45.5 μg/g[料液比 1∶2（g/mL）、溫度 60 ℃、時間 3 h]。上述研究表明，不同蝦種類、不同提取工藝下所得蝦殼中蝦青素提取量存在差異?？紤]到浸提溶劑安全性和蝦青素氧化問題，在保證提取效率的同時，相對安全的乙酸乙酯和低溫（30℃）更有利于蝦青素的提取及其穩定性，這與本試驗結果一致。

2.3 小龍蝦下腳料中甲殼素提取工藝單因素試驗

小龍蝦下腳料中甲殼素提取工藝單因素優化結果如圖3所示。

圖3 小龍蝦下腳料中甲殼素提取工藝單因素優化結果Fig.3 Single-factor optimization results of extraction process of chitin from crayfish leftovers

由圖3A可以看出，在HCl濃度逐漸增大的過程中，甲殼素的提取率出現了先升高后下降的現象，這可能是濃度過高的HCl會對甲殼素造成破壞，進而甲殼素的提取率隨之下降。因此，確定1.0 mol/L為HCl提取甲殼素的最佳濃度。

由圖3B可以看出，隨著浸泡時間的增加，甲殼素的提取率隨著時間的增加出現了先升高后降低逐漸趨于平穩的趨勢，在20 min之前，甲殼素的提取率隨時間的延長而增加，20 min達到最大值以后，出現了較大幅度的下降。這可能是由于隨著HCl浸泡時間的延長，會使得蝦粉中的甲殼素遭到破壞。因此，試驗將20 min作為最佳HCl浸泡時間。

由圖3C可以看出，NaOH溶液濃度為0.6 mol/L～0.8 mol/L時，甲殼素的提取率不斷升高；NaOH溶液濃度為1.0 mol/L時，甲殼素的提取率最大，且與其他NaOH濃度下甲殼素的提取率存在顯著性差異（P＜0.05）；超過1.0 mol/L時，甲殼素的提取率有較大幅度的下降。這可能是由于小龍蝦下腳料中的甲殼素在NaOH溶液作用下逐漸溶出，使得甲殼素的提取率增加；但在NaOH濃度過大時，甲殼素也會被分解，使得甲殼素的提取率下降。因此，本試驗選擇1.0 mol/L作為NaOH溶液的最佳濃度。

由圖3D可以看出，NaOH溶液浸泡時間在3.5min～7 min時，甲殼素的提取率不斷上升；NaOH溶液浸泡時間為7 min時，甲殼素的提取率達到最大值，且此時的甲殼素提取率與NaOH溶液其他浸泡時間的甲殼素提取率存在顯著性差異（P＜0.05）；NaOH溶液浸泡時間大于7 min時，甲殼素提取率處于下降趨勢。這可能是由于隨著時間的推移，蝦殼粉中的甲殼素在NaOH溶液作用下被逐漸溶出分解，使得甲殼素的提取率增加；但是隨著NaOH溶液浸泡時間的延長，甲殼素存在被分解的風險，使得甲殼素的提取率下降。因此，試驗將7 min作為NaOH溶液的最佳浸泡時間。

2.4 響應面法優化提取小龍蝦下腳料中甲殼素工藝

利用小龍蝦下腳料提取蝦青素的響應面試驗結果如表5所示，方差分析如表6所示。

表5 甲殼素提取率響應面試驗結果Table 5 Results of chitin extraction ratio by response surface methodology optimization

表6 方差分析Table 6 Variance analysis of test results

對試驗數據進行多元回歸擬合，得到如下回歸方程：Y=11.73-0.58A2-0.41B2+0.71C2+0.58D2+0.50A2B2+0.92A2C2-0.42A2D2-0.15B2C2+0.77B2D2-0.40C2D2-0.040A22-0.85B22+0.86C22+0.91D22。

該模型中 F=1.68，P＜0.05，R2=0.972 6，說明模型具有很好的擬合度，二次回歸方程顯著。而且HCl濃度（A2）、NaOH 濃度（C2）項 P 值均小于 0.05，說明對響應值影響顯著，尤其 HCl濃度（A2）和 NaOH 濃度（C2）的交互作用顯著。相關決定系數R2=0.972 6，表明該模型與試驗擬合較好，可解釋97.26%的響應值變化。HCl浸泡時間（B2）、NaOH浸泡時間（D2）對甲殼素提取率影響不大，且四者對甲殼素提取率影響大小為C2＞A2＞D2＞B2。

HCl濃度 （A2）、HCl浸泡時間（B2）、NaOH 濃度（C2）、NaOH浸泡時間（D2）之間的交互作用關系如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對甲殼素提取率的影響Fig.4 Effects of interaction of various factors on the extraction ratio of chitin

由圖 4 可知，HCl浸泡時間（B2）與 HCl濃度（A2）交互作用、HCl濃度（A2）與 NaOH 濃度（C2）交互作用、HCl濃度（A2）與 NaOH 浸泡時間（D2）交互作用的等高線圖呈橢圓型，且等高線橢圓分別指向HCl浸泡時間（B2）、NaOH 濃度（C2）、NaOH 浸泡時間（D2）。雖然，HCl浸泡時間（B2）與 HCl濃度（A2）交互作用、HCl濃度（A2） 與 NaOH 濃度 （C2） 交互作用、HCl濃度 （A2）與NaOH 浸泡時間（D2）交互作用、NaOH 濃度（C2）與 HCl浸泡時間（B2）交互作用、NaOH 浸泡時間（D2）與 HCl浸泡時間（B2）交互作用、NaOH浸泡時間與NaOH濃度交互作用對甲殼素提取率影響不顯著（P>0.05）（見表6和圖4），但可適當減小NaOH濃度，減少HCl浸泡時間與NaOH浸泡時間，既不會顯著影響甲殼素的提取率，又能夠減少NaOH的使用與時間成本。

響應面試驗得到最佳甲殼素提取工藝條件為HCl濃度 0.98 mol/L、HCl浸泡時間 20.2 min、NaOH 濃度0.94 mol/L、NaOH浸泡時間6.49 min。小龍蝦下腳料中甲殼素預測響應值Y為25.12%。

為驗證響應面法所得結果的準確性，考慮到實際操作的可能性，將提取參數調整為HCl濃度1 mol/L、HCl浸泡時間20 min、NaOH濃度1 mol/L、NaOH浸泡時間6.5 min。在此條件下重復3次，甲殼素提取率為24.13%，為預測值的96.06%。與理論預測值相比，其相對誤差小于10%。因此，本試驗所得的最佳提取工藝可靠，具有實用價值。

3 結論

本文通過單因素試驗與響應面試驗設計，對小龍蝦下腳料中蝦青素和甲殼素的連續提取工藝條件進行優化，研究表明，以乙酸乙酯為提取溶劑，料液比為1:19（g/mL），在34℃條件下浸泡蝦粉120 min后得到蝦青素的最大提取量為67.40 μg/g；將提取完蝦青素的固體水洗干燥后置于1 mol/L的HCl中浸泡20 min，然后置于1 mol/L的NaOH溶液浸泡6.5 min后得到甲殼素的最大提取率為24.13%。本研究對小龍蝦下腳料中蝦青素和甲殼素進行提取，即實現了資源回收利用，又為蝦青素和甲殼素的連續提取提供了參考。