響應面優化桑葚白蘭地原料酒發酵工藝

鄭升海，田樹林，王宇，樊蓉，龔大剛，杜鴻，曲都，徐升東，韓保林*

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.四川省閬州圣果酒業有限公司，四川 南充 637000）

桑葚，又名桑果、桑葚子等。桑葚營養豐富，富含黃酮類、萜類物質、維生素、有機酸和微量元素等，為我國規定的藥食同源水果之一[1-2]，具有極高的保健價值和藥用價值，用于保護肝臟、腎臟，預防高血壓、糖尿病等，而且桑葚含有的糖類物質可以作為免疫調節劑[3-5]。

桑葚季節性強，不易于保存，容易造成桑葚資源的大量浪費。隨著食品科研的進步和食品產業的發展，為了提高桑葚資源的利用率，減少資源浪費，桑葚深加工產品也越來越多。目前，孫方丹[6]進行了桑葚果醋的發酵工藝條件及生理活性研究，研制出具有獨特香氣的桑葚果醋；吳均等[7]進行了響應面試驗優化桑葚果酒發酵工藝及其品質分析，釀造出了酒香馥郁的桑葚果酒；劉於[8]進行了桑葚成分分析及低糖果醬的工藝參數優化，研制出營養豐富的低糖果醬。這些桑葚深加工食品得到了廣大群眾的喜愛和認可[9]。

桑葚果酒作為桑葚主要深加工產品之一，具有獨特的風味，營養價值高，為果酒中的佳品[10]。Tao等[11]研究了不同釀酒酵母菌株發酵桑葚酒的化學成分和感官特征；胡永正[12]進行了桑葚酒發酵工藝動力學研究。關于桑葚果酒的研究多集中在桑葚果酒的發酵工藝優化、風味物質分析、混合發酵應用等，對于桑葚白蘭地的研究鮮有報道。為了提高桑葚的利用率，本試驗采用干桑葚作為發酵原材料進行果酒發酵，優化其發酵工藝，以期釀造出優質的桑葚白蘭地原料酒，提升與拓展桑葚食品產業的市場發展空間和潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干桑葚：采于四川閬中桑蠶基地；果酒專用酵母RW：安琪酵母有限公司；白砂糖（食品級）：滇鵬糖業有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸（食品級）：河南萬邦實業有限公司；焦亞硫酸鉀（食品級）：煙臺帝伯仕酵母有限公司；對二氨基苯甲醛（分析純）：上海易恩化學技術有限公司；鹽酸間苯二胺（分析純）：上海阿拉丁生化股份有限公司；甲醇、異戊醇、異丁醇（色譜純）：上海安普實驗科技股份有限公司。

1.2 主要儀器設備

BJ-800A粉碎機：德清拜杰電器有限公司；DZKW-4水浴鍋：北京中興偉業世紀儀器有限公司；OHAUS-ST2C pH計：奧豪斯儀器有限公司；ZWYRD2403恒溫培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；T6分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；LB50T ATC糖度折光儀：廣州市銘睿電子科技有限公司；三支組酒精計（0%vol～100%vol）：四川省申聯生物科技有限責任公司。

1.3 試驗及檢測方法

1.3.1 桑葚白蘭地原料酒工藝流程

干桑葚篩選→破碎→復水→滅菌→酶解→調節初始糖度→酵母活化接菌→控溫發酵→過濾→桑葚白蘭地原料酒。

工藝要點如下。

篩選、破碎：選取優質的干桑葚，通過粉碎機破碎成粉粒狀。

復水：稱取80 g干桑葚果粉粒加入發酵瓶，按料水比1∶4（g/mL）加水，制備成干桑葚果漿。

酸度調節：使用檸檬酸調節干桑葚果漿的pH值為3.5。

酶解：加入0.1%的果膠酶，并在50℃條件下酶解2h。

糖度調節：將干桑葚果漿使用白砂糖調節為不同的初始糖度（16、20、24、28、32、36 °Bé）。

滅菌：向干桑葚果漿中加入0.1%焦亞硫酸鉀，滅菌2 h～8 h。

酵母菌活化：將酵母菌加入糖度為2°Bé的無菌水中，于35℃下活化15 min～30 min。

發酵：向干桑葚果漿中添加適量的活化酵母菌進行恒溫發酵。

1.3.2 單因素試驗

發酵溫度：固定酵母添加量為0.1%、初始糖度為28 °Bé、發酵時間為 15 d，測定不同發酵溫度（18、21、24、27、30、33℃）對桑葚白蘭地原料酒發酵工藝的影響。

初始糖度：固定酵母添加量為0.1%、發酵溫度為21℃、發酵時間為 15 d，測定不同初始糖度（16、20、24、28、32、36°Bé）對桑葚白蘭地原料酒發酵工藝的影響。

酵母接種量：固定初始糖度為28°Bé、發酵溫度為21℃、發酵時間為15 d，測定不同酵母接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）對桑葚白蘭地原料酒發酵工藝的影響。

1.3.3 響應面優化試驗

基于單因素試驗結果，以發酵溫度（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）為考察因素，利用 Design-Expert8.06軟件以酒精度、甲醇含量為響應值，進行Box-Behnken響應面試驗設計，對試驗所得的結果進行分析，獲得最優預測發酵條件參數，并進行驗證試驗。響應面試驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design test

1.3.4 測定方法

總酸含量、總酯含量、總糖含量、酒精度均采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的檢測方法進行測定[13]；pH值測定采用酸度計法；糖度測定采用折光計檢測法；甲醇含量測定采用品紅亞硫酸比色法[14]。甲醇標準曲線回歸方程：y=0.735x-0.015 7，R2=0.997 9；高級醇含量測定采用對二甲氨基苯甲醛比色法[14]，高級醇標準曲線回歸方程：y=174.65x+0.084 2，R2=0.998 9。

揮發性風味物質采用固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）和氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 相結合的方法進行檢測[12]。

樣品萃取：取5 mL樣品加入15 mL頂空瓶中，加入1 g NaCl，40℃條件平衡30 min，將以活化好的萃取針插入頂空瓶，在距離液面1 cm處吸附30 min，取出萃取針迅速插入GC-MS進樣口，解吸附5 min。

色譜條件：高純氦氣（載氣），6 mL/min（吹掃流速），升溫條件：42℃（初始柱溫、恒溫8 min），升溫至130℃（速度5℃/min），再升至 220℃（速度10℃/min，恒溫10 min），最后升至230℃（速度10℃/min，恒溫 5 min）。

質譜條件：電子離子源；電子能量：70 eV；采集模式：全掃描，質量掃描范圍20 amu～550 amu，溶劑延遲2.5 min；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃，接口溫度：230℃。

2 結果與分析

2.1 桑葚白蘭地原料酒發酵工藝單因素試驗結果

2.1.1 發酵溫度對桑葚白蘭地原料酒發酵工藝的影響

發酵溫度對桑葚白蘭地原料酒總酸、總酯、總糖、甲醇、高級醇、揮發性風味物質的含量及酒精度的影響見表2。

表2 發酵溫度對總酸、總酯、總糖、甲醇、高級醇、揮發性風味物質的含量及酒精度的影響Table 2 Effects of fermentation temperature on the content of total acid，total ester，total sugar，alcohol，methanol，higher alcohol，and volatile flavor substances

由表2可知，隨著發酵溫度升高，總酸含量整體呈先升高后下降再升高趨勢；總酯含量整體呈波動升高趨勢；總糖含量整體呈先下降后升高趨勢，當發酵溫度為21℃時，其總糖含量達到最低，為（4.23±0.24）g/L，原因是溫度升高會抑制酵母菌的生長，導致糖代謝減少，從而影響酒體品質[15]；酒精度整體呈先升高后下降趨勢，21℃時，酒精度達到最大值，為（13.8±0.4）%vol；甲醇含量整體呈先下降后升高趨勢，在21℃時達到最小值，為（120.5±3.5）mg/L；高級醇含量隨溫度升高呈上升趨勢，溫度升高使酵母菌由生長對數期過早進入穩定期，從而發酵速度變快，發酵結束的時間早，導致酒精濃度下降，高級醇含量反而增加；揮發性風味物質含量呈先升高后下降趨勢，21℃時達到最大值，為（1.44±0.04）g/L，低溫發酵有利于形成更好的果酒品質，這與Tian等[16]研究的結果相一致。綜上，選取18、21、24℃的發酵溫度作為響應面優化試驗的3個水平。

2.1.2 初始糖度對桑葚白蘭地原料酒發酵工藝的影響

初始糖度對桑葚白蘭地原料酒總酸、總酯、總糖、甲醇、高級醇、揮發性風味物質的含量及酒精度的影響見表3。

表3 初始糖度對總酸、總酯、總糖、甲醇、高級醇、揮發性風味物質的含量及酒精度的影響Table 3 Effects of initial sugar content on the content of total acid，total ester，total sugar，alcohol content，methanol，higher alcohol，and volatile flavor substances

由表3可知，隨著初始糖度的升高，總酸含量整體呈下降趨勢；總酯含量呈先下降后升高趨勢；總糖含量呈升高趨勢，當初始糖度為36°Bé時，其總糖含量達到最高，為（56.19±0.33）g/L，由于初始糖度的升高，導致發酵液的滲透壓升高，抑制酵母菌代謝生長，使糖分利用不充分，導致總糖含量升高[17]；酒精度呈先升高后下降趨勢，當初始糖度為28°Bé時，其酒精度達到最高，為（13.6±0.6）%vol；甲醇含量呈先下降后升高再下降趨勢，當初始糖度為28°Bé時，其甲醇含量達到最低，為（121.4±6.1）mg/L，當發酵初始糖度低于 28 °Bé時，由于糖分含量不足，酵母菌代謝途徑為糖類物質代謝和其他物質代謝，其他類物質代謝產生甲醇，從而導致甲醇含量相對較高[18]；高級醇含量呈先下降后升高再下降趨勢；揮發性風味物質含量整體呈先升高后下降趨勢，當初始糖度為28°Bé時，揮發性風味物質含量達到最高，為（1.44±0.03）g/L，由于低初始糖度的糖含量不足與高初始糖度的糖含量過高對酵母菌代謝生長產生的抑制作用，從而導致揮發性風味物質在低初始糖度與高初始糖度時的含量減少。綜上，選取24、28、32°Bé的初始糖度作為響應面優化試驗的3個水平。

2.1.3 酵母接種量對桑葚白蘭地原料酒發酵工藝的影響

酵母接種量對桑葚白蘭地原料酒總酸、總酯、總糖、甲醇、高級醇、揮發性風味物質含量及酒精度的影響見表4。

表4 酵母接種量對總酸、總酯、總糖、甲醇、高級醇、揮發性風味物質含量及酒精度的影響Table 4 Effects of yeast inoculation amount on the content of total acid，total ester，total sugar，alcohol，methanol，higher alcohol，and volatile flavor substances

由表4可知，隨著酵母接種量的增加，總酸含量呈上升趨勢；總酯含量變化不顯著（P＞0.05）；總糖含量呈下降趨勢，由于酵母接種量增加，糖分消耗也隨之增加，導致總糖含量下降；酵母接種量由0.1%增加至0.2%時，酒精度升高，當酵母接種量為0.2%～0.5%時，酒精度變化不顯著（P＞0.05），當酵母接種量過高，酵母菌利用糖類物質和其它養分，主要產生呼吸作用，產酒底物減少，導致產酒量少[19-20]；甲醇含量呈先下降后升高趨勢，當酵母接種量為0.2%時，其甲醇含量達到最低，為（104.5±5.9）mg/L；高級醇含量整體呈先下降后升高趨勢，當酵母接種量為0.2%時，其高級醇含量達到最低，為（193.5±3.6）mg/L；揮發性風味物質含量呈先升高后下降趨勢，當酵母接種量為0.2%時，其揮發性風味物質含量達到最高，為（1.64±0.05）g/L；酵母接種量過少易使發酵不充分，酵母接種量過多易使發酵過快，從而導致酒精度、揮發性風味物質含量下降，甲醇、高級醇含量升高，直接影響果酒品質的好壞[21-22]，綜上，選取0.1%、0.2%、0.3%的酵母接種量作為響應面優化試驗的3個水平。

2.2 桑葚白蘭地原料酒發酵工藝響應面試驗結果

2.2.1 Box-Behnken響應面試驗結果

利用Box-Behnken中心組合設計原理，通過單因素試驗結果結合響應面試驗，建立17組桑葚白蘭地原料酒發酵工藝試驗，試驗結果見表5。

表5 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 5 Design scheme and results of Box-Behnken test

2.2.2 以酒精度為指標的響應面試驗方差分析

以酒精度為指標的響應面試驗方差分析結果見表6。

表6 以酒精度為指標的響應面試驗方差分析Table 6 Variance analysis of response surface test with alcohol content as the indicator

二次多項回歸方程：Y=14.36＋0.68×A＋0.86×B＋0.11×C＋0.9×AB＋0.5×AC＋0.38×BC－0.79×A2－2.37×B2－0.72×C2。

由表6可知，相關系數分別為R2=0.973 8、R2adj=0.940 2，且模型P值小于0.01（表明模型極顯著），失擬項P值為0.075 5＞0.05（失擬項不顯著），證明該回歸模型方程擬合度較好，誤差小。可見該模型準確，可行性高，能用于本試驗的預測分析[23]。一次項A、B極顯著（P＜0.01），交互項 AB 極顯著（P＜0.01），AC 顯著（P＜0.05），二次項 A2、B2、C2極顯著（P＜0.01），C、BC 均不顯著（P＞0.05），由F值可知，3個因素對酒精度影響的大小順序為B>A>C。

A、B、C兩兩因素交互作用的響應面圖和等高線圖見圖1。

圖1 各因素交互作用的響應面圖和等高線圖（酒精度）Fig.1 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors（alcohol content）

由圖1可知，發酵溫度和初始糖度（AB）、發酵溫度和酵母接種量（AC）的響應面圖坡度趨勢陡峭，AB、AC等高線趨于橢圓形，表明這兩組交互作用對酒精度影響較大，AB、AC交互作用顯著，與方差分析結果一致。

2.2.3 以甲醇含量為指標的響應面試驗方差分析

以甲醇含量為指標的響應面試驗方差分析結果見表7。

表7 以甲醇含量為指標的響應面試驗方差分析Table 7 Variance analysis of response surface test with methanol content as the indicator

二次多項回歸方程：Y=115.14－2.85×A－3.26×B+0.25×C－3.21×AB－1.48×AC－2.11×BC＋5.54×A2＋12.37×B2＋6.5×C2。

由表7可知，相關系數分別為R2=0.972 8、R2adj=0.937 7，且試驗結果中P值小于0.01（模型極顯著），失擬項P值為0.067 9＞0.05（失擬項不顯著），證明該回歸模型方程擬合度較好，誤差小，該模型準確，可行性高，能用于本試驗預測分析。A、B項影響極顯著（P＜0.01），AB 項影響顯著（P＜0.05），A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），C、AC、BC 影響均不顯著（P＞0.05），由 F 值可知，3個因素對甲醇含量影響的大小順序為B>A>C。

A、B、C兩兩因素交互作用的響應面圖和等高線圖見圖2。

圖2 各因素交互作用的響應面圖和等高線圖（甲醇含量）Fig.2 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors（methanol content）

由圖2可知，AB交互作用的響應面坡度趨勢陡峭、等高線趨于橢圓形，表明AB交互作用對甲醇含量影響較大，AB交互作用顯著，與方差分析結果一致。

2.3 桑葚白蘭地原料酒發酵工藝驗證試驗

通過Design-Expert8.0.6軟件對響應試驗結果進行計算分析得到最優工藝參數：發酵溫度21.9℃，初始糖度28.7°Bé，酵母接種量0.2%，此時，酒精度為14.6%vol，甲醇含量為114.4 mg/L。根據最優工藝參數進行3次驗證試驗，實際測得酒精度為14.56%vol，甲醇含量為112.7 mg/L，與預測值接近，該參數準確可靠。

3 結論

本試驗是以干桑葚為原料，在桑葚白蘭地原料酒發酵單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken響應面試驗優化發酵工藝，得到最佳的發酵工藝參數為發酵溫度21.9℃，初始糖度28.7°Bé，酵母接種量0.2%，理論預測值為酒精度14.6%vol，甲醇含量114.4 mg/L。根據此發酵工藝參數進行驗證試驗，實際測得酒精度為14.56%vol，甲醇含量為112.7 mg/L，與預測值接近。