米曲霉發酵提取甘薯中去氫表雄酮工藝優化

陳蓬鳳，鄒浩峰，蔡芳，隋勇，施建斌，蔡沙，熊添，陳學玲，黃師榮，梅新*

（1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064；2.湘潭大學化工學院，湖南 湘潭 411105）

甘薯（Ipomoea batats Lan.）屬于旋花科甘薯屬一年生草本，又名紅薯、番薯、地瓜等，我國是世界上最大的甘薯生產國和消費國，甘薯富含淀粉、蛋白質、膳食纖維、維生素和礦物質等多種營養成分[1]，還含有多酚、花青素、黏蛋白、去氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）等多種功效成分。DHEA是一種非共軛的△5，6-雙鍵及可酯化的3β-羥基甾體，不溶于水，溶于石油醚、苯、氯仿、甲醇等有機溶劑。DHEA是人體血液循環中最為豐富的甾體物質，不僅直接參與人體甾體激素的合成，還具有調節免疫力、抗腫瘤、減肥、改善卵巢功能等多種功效[2-7]。

目前DHEA主要依賴于化學合成，合成步驟復雜，中間產物較多，DHEA得率和純度不易控制[8-9]。相比之下，微生物法反應條件溫和，各種酶促反應可實現DHEA充分游離。周配[10]采用微生物發法，通過微生物代謝酶對甾醇側鏈進行專一性酶解，優化了以菜籽甾醇、谷甾醇等植物甾醇為底物高效制備DHEA的工藝。與黃姜等原料中薯蕷皂素的存在形式相似，甘薯中DHEA并不是以游離形式存在，而是與葡萄糖結合成皂甙存在于細胞內[3]。在相關研究中，甘薯中DHEA的提取工藝主要參考薯蕷皂素的提取方法[11-13]，包括預發酵、酸水解、索氏提取等步驟，而酸水解所使用的硫酸、鹽酸等強酸，易使皂甙裂解而破壞DHEA的結構，并同時產生大量酸性廢液難以處理，因此，亟需開發更為高效、環保的甘薯中DHEA提取方法。

米曲霉（Aspergillus oryzae）是食品工業中常用的微生物，含有淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等多種酶系，其中，纖維素酶系的重要組分β-葡萄糖苷酶可水解多種糖苷鍵。目前，已有采用米曲霉發酵制備薯蕷皂素的報道[14-15]，但尚未見米曲霉發酵制備DHEA相關研究。本文以甘薯生全粉為原料，在對米曲酶發酵提取物定性分析基礎上，采用單因素與響應面試驗優化米曲霉發酵提取甘薯中DHEA工藝，旨在為甘薯中功效成分高效提取及高附加值產品開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯生全粉：湖北根聚地農業發展股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；米曲霉孢子粉：沂水（山東臨沂）錦潤生物科技有限公司；蛋白胨：北京雙旋微生物培養基制品廠；石油醚、氫氧化鈉、氯化鈉、濃HCl、濃H2SO4（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；DHEA標準溶液（1 mg/mL，甲醇為溶劑）：Sigma-aidrich（上海）貿易有限公司；甲醇（色譜級）：Thermo Fisher科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters alliance e2695高效液相色譜儀：沃特世科技有限公司；UV-2800紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；BCM-1000型生物潔凈工作臺：蘇州鴻基潔凈科技股份有限公司；SHP-250生化培養箱、GZX-9240 MBE電熱鼓風干燥箱：上海精宏試驗設備有限公司；YM 75立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械公司；SB-5200D超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米曲霉孢子懸浮液制備

無菌條件下，取兩環米曲霉孢子粉接種于已滅菌的PDA斜面培養基上，于30℃下培養7 d，至斜面鋪滿綠色新生孢子，后用0.9%無菌生理鹽水將斜面新生孢子沖洗于無菌錐形瓶中，加入0.05%（體積比）吐溫20，于30℃，150 r/min下振蕩20 min混勻后經滅菌紗布過濾，收集濾液，用0.9%無菌生理鹽水沖洗濾渣2次～3次，合并收集濾液，用生理鹽水調整濾液中孢子濃度至1×107個/mL～3×107個/mL，即得米曲霉孢子懸浮液。

1.3.2 米曲霉發酵提取DHEA工藝

蛋白胨與甘薯生全粉按質量比4%混合，再按一定液固比加入去離子水，攪拌混勻后置于121℃下滅菌15 min得發酵培養基，按一定體積比于發酵培養基中接種米曲霉孢子懸浮液，發酵一段時間后高溫滅菌終止發酵，發酵后培養基冷卻后于4 000 r/min下離心15 min，收集沉淀于50℃下干燥并粉碎過60目篩得發酵產物。發酵產物按10∶1（mL/g）液固比與石油醚充分混勻后于500 W下超聲輔助提取3次，每次20 min，合并收集提取液，旋蒸去除石油醚，再用色譜級甲醇定容至5 mL，得DHEA提取物。

1.3.3 提取物中DHEA的定性定量分析

采用紫外-可見分光光度計對DHEA標準溶液與提取物進行紫外光譜掃描；在此基礎上，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）比對標準溶液與提取物中DHEA保留時間，從而對提取物中DHEA結構進行定性分析。在定性分析基礎上，采用HPLC對提取物中DHEA含量進行測定，根據DHEA標準溶液峰面積、DHEA提取物峰面積，計算DHEA得率。色譜條件：流動相為甲醇：水=80∶20（體積比）、流速 0.4 mL/min、柱溫 42 ℃、進樣量 10 μL，檢測波長200 nm。DHEA得率計算方法如下。

式中：X 為 DHEA 得率，μg/100 g；S1為 DHEA 提取物峰面積；S2為DHEA標準溶液峰面積；V為提取物定容體積，mL；C為標準溶液濃度，μg/mL；m為甘薯生全粉樣品質量，g。

1.3.4 單因素試驗

分別考察米曲霉孢子懸浮液的接種量（以下簡稱接種量）（4%、6%、8%、10%、12%）、發酵時間（36、48、60、72、84 h）、發酵溫度（26、28、30、32、34 ℃）、液固比[5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）]等因素對以甘薯生全粉為原料米曲酶發酵提取DHEA得率的影響。單因素試驗過程中，在探討其他單因素時，接種量、發酵溫度、發酵時間、液固比、分別設定為6%、30℃、72h和15∶1（mL/g）。

1.3.5 響應面及對比試驗

基于單因素試驗，根據Box-Behnken試驗設計原理，確定中心組合試驗因素與水平，以DHEA得率為響應值進行響應面試驗，優化以甘薯生全粉為原料米曲霉發酵提取DHEA的工藝條件，并與酶解法、預發酵-酸解法提取甘薯DHEA的得率進行對比。

預發酵-酸解法：參照楊紅花等[13]的方法。取一定量甘薯生全粉，按液固比15∶1（mL/g）與去離子水混合，攪拌制成勻漿，于60℃水浴自然發酵24 h后，加入2%（體積比）濃H2SO4加至發酵后勻漿中，混合均勻后，于90℃下水解36 h，水解液加堿中和至中性，脫水收集殘渣干燥。干燥殘渣按液固比10∶1（mL/g）與石油醚混合并密閉提取40 min，收集提取液，減壓濃縮至原來體積的1/3，旋蒸去石油醚，色譜級甲醇定容，得DHEA提取物，采用HPLC進行分析。

1.4 數據處理

所有試驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示；分別采用SPSS8.0分析處理數據、OriginPro 8.5繪圖、Design-Expert 10方差回歸分析。

2 結果與分析

2.1 提取物中DHEA定性分析

以DHEA標準溶液為對照，提取物中DHEA紫外掃描及色譜分析結果如圖1所示。

圖1 DHEA標準溶液與提取物紫外光譜及色譜圖Fig.1 UV spectra and chromatograms of DHEA standards and extractions

從圖1中可以看出，標準溶液與提取物紫外光譜圖基本一致，紫外最大吸收波長分別為201 nm和199 nm；且色譜圖中二者保留時間基本吻合，可以確定提取物中含有DHEA，且結構與標準溶液中DHEA結構相同。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 不同接種量下DHEA得率

接種量對DHEA得率的影響如圖2所示。

圖2 接種量對DHEA得率的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the yield of DHEA

從圖2可看出，隨接種量升高，DHEA得率呈明顯先上升后下降變化趨勢。當接種量介于4%～10%之間時，接種量對以甘薯生全粉為原料米曲酶發酵提取DHEA得率有顯著（p＜0.05）影響；接種量超過10%時，繼續提升接種量，DHEA得率無顯著變化；接種量為6%時，DHEA得率最高，達61.32 μg/100 g。一定范圍內提高米曲酶孢子懸浮液接種量，可提升培養基中營養成分利用率，豐富發酵液中酶的種類，提高酶的濃度和含量，進而提高DHEA得率[14]；但接種量超過一定范圍后，因短時間內米曲酶菌絲體絕對數量急劇增加，引發培養基碳源氮源快速消耗，加之發酵液溶氧量不足，最終影響菌絲體生長及酶的合成[18]。

2.2.2 不同發酵時間下DHEA得率

發酵時間對DHEA得率的影響如圖3所示。

圖3 發酵時間對DHEA得率的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the yield of DHEA

從圖3可看出，隨發酵時間延長，DHEA得率呈顯著先上升后下降變化趨勢（p＜0.05）。發酵36 h時，DHEA得率最低，僅為 12.20 μg/100 g；發酵 72 h 時，DHEA 得率最高，為79.34μg/100g。研究表明，發酵48h～72 h是米曲霉生長繁殖的高峰期，發酵時間不足，發酵液中菌絲體絕對數量不高，產酶不足進而影響DHEA得率[19]；發酵時間太長，培養基中營養物質消耗過多，米曲酶生長減緩甚至衰亡，可水解糖苷鍵等酶的產量降低[20]，導致培養基中DHEA不能充分游離，最終其得率下降。

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2.2.3 不同發酵溫度下DHEA得率

發酵溫度對DHEA得率影響結果如圖4所示。

圖4 發酵溫度對DHEA得率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the yield of DHEA

由圖4可知，DHEA得率隨著發酵溫度升高呈顯著地（p＜0.05）先上升后下降變化趨勢，發酵溫度為26℃時，DHEA 得率最低，僅為 17.08 μg/100 g；發酵溫度為30℃時，DHEA得率最高，達96.57 μg/100 g，發酵溫度超過30℃時，菌絲體老化加速，其產酶能力及酶活下降[19]，導致DHEA得率降低。

2.2.4 不同液固比下DHEA得率

液固比對DHEA得率的影響如圖5所示。

圖5 液固比對DHEA得率的影響Fig.5 Effect of liquid-to-materials ratio on the yield of DHEA

從圖5可看出，隨液固比的升高，DHEA得率呈顯著（p＜0.05）地先上升后下降變化趨勢。液固比為25∶1（mL/g）時，DHEA得率最低，僅為19.34μg/100g；液固比為 15∶1（mL/g）時，DHEA 得率最高，達 73.56μg/100g。液固比高低直接影響米曲酶生長環境，如營養物質的濃度、培養液滲透壓以及黏度等，液固比過高或過低均不利于米曲酶生長繁殖，導致其產酶能力下降，最終影響DHEA得率[17]。

2.3 響應面法優化試驗設計及結果

2.3.1 回歸模型建立與方差分析

基于單因素試驗結果，依據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以接種量、發酵時間、發酵溫度、液固比為自變量，DHEA得率為響應值進行響應面試驗，優化以甘薯生全粉為原料米曲霉發酵提取DHEA工藝條件。選取3個中心點，進行四因素三水平試驗，響應面試驗設計及結果如表1所示。

表1 響應面試驗設計及結果Table 1 Test design and results of response surface experiment

采用Box-Behnken方法對試驗結果進行多元回歸擬合，得到DHEA得率對試驗自變量的二次多項回歸方程：Y=96.64+7.4A+0.1B-2.43C-0.33D-5.48AB+1.75AC-0.89AD+10.82BC+1.43BD-1.02CD-34.55A2-34.82B2-43.79C2-50.21D2。

回歸模型及方差分析見表2。

表2 回歸模型及方差分析Table 2 Regression model and analysis of variance

由表2可知，回歸模型極顯著（p＜0.01），且失擬項不顯著（p＞0.05），說明殘差是由隨機誤差引起。計算結果顯示，模型校正決定系數（Radj2）為0.923 5，證明該模型可解釋92.35%的響應值變化；模型相關系數（R2）為0.961 7，表明該回歸方程擬合度高，能用來預測以甘薯生全粉為原料米曲酶發酵提取DHEA的發酵工藝。表2還反映了4個自變量對響應值DHEA得率的影響程度，各因素對DHEA得率影響大小順序：接種量＞發酵溫度＞液固比＞發酵時間。其中，因素A和BC的交互作用對DHEA得率有顯著影響（p＜0.05）。

2.3.2 響應面分析與優化

等高線圖能直觀展現各因素對響應值的影響程度，以及各參數之間的相互作用，圓形表明兩因素間相互作用對DHEA得率的影響不顯著。接種量、發酵時間、發酵溫度、液固比之間交互作用對DHEA得率的影響如圖6所示。

圖6 各因素之間的交互作用對DHEA得率影響的等高線圖Fig.6 Contour map of the influence of the interaction between various factors on the yield of DHEA

從圖6的等高線圖可以看出，以DHEA得率為響應值，AB、AC、AD、BD、CD 的交互作用等高線均呈圓形，說明這些因素對DHEA得率無交互影響；而BC交互作用等高線呈橢圓形，結合表2的回歸模型系數顯著性檢驗結果，表明BC間交互作用對DHEA得率有顯著影響，即發酵溫度與發酵時間的交互作用對DHEA得率有顯著影響。響應面試驗優化得到以甘薯生全粉為原料米曲霉發酵提取DHEA的最佳工藝：米曲酶孢子懸浮液接種量6.21%，發酵溫度29.95℃，發酵時間71.86 h，甘薯生全粉與蛋白胨混合物與去離子水的液固比 14.98∶1（mL/g），此工藝下 DHEA 理論得率為 97.07 μg/100 g。

2.4 驗證與對比試驗

基于實際操作可行性，開展米曲酶發酵提取甘薯生全粉中DHEA工藝預測模型準確性的驗證試驗，選取接種量6%，發酵時間72 h，發酵溫度30℃，液固比15∶1（mL/g）等工藝參數，DHEA 得率 94.70 μg/100 g，與理論值97.07 μg/100 g基本吻合。說明響應面分析方法對米曲霉發酵提取甘薯生全粉中DHEA的發酵條件優化是可行的。

米曲霉發酵提取甘薯生全粉中DHEA得率與其他方法比較結果如表3所示。

表3 不同制備方法的DHEA得率對比Table 3 Comparison of DHEA yields of different extraction methods

從表3中可看出，米曲霉發酵提取DHEA得率顯著（p＜0.05）高于現有的預發酵-酸解法、酶解法。

3 結論

去氫表雄酮是甘薯中一種功能性成分，目前米曲霉發酵提取甘薯中DHEA的相關研究較少。本文探討優化以甘薯生全粉為原料米曲霉發酵提取DHEA工藝，基于單因素試驗結果，進行響應面試驗優化并驗證得到米曲霉發酵提取甘薯生全粉中DHEA最佳工藝條件為：接種量6%，發酵溫度30℃，發酵時間72 h，液固比 15∶1（mL/g），此條件下 DHEA 得率為 94.70 μg/100 g，且得率顯著（p＜0.05）高于現有的酶解法、預發酵-酸解法等方法。米曲霉發酵提取甘薯DHEA可為甘薯中功效成分深度發掘利用以及甘薯高附加值產品開發提供依據和技術支持。