酸菜中乳酸菌生長曲線、產酸性能及抑菌性能探究

袁先鈴，周鶯茹，鄭連強，雷鳴，王俊丁

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.四川省遠達集團富順縣美樂食品有限公司，四川 自貢 643200）

四川酸菜主要是以芥菜為加工原料，通過優勢菌群乳酸菌以厭氧為主發酵而成的一種發酵類食品[1]，是一種佐餐菜肴，也是一種輔料[2]。乳酸菌從來源上可分為動物源乳酸菌和植物源乳酸菌[3]，從發酵過程上可分為異型乳酸發酵菌和同型乳酸發酵菌[4]。乳酸菌能在酸性較強的條件下生長并能在鹽水濃度較高的環境中繁殖，但乳酸菌本身只有肽酶，合成氨基酸、核酸、維生素的能力極低，所以在乳酸菌的生長環境中需要加入氨基酸、維生素等生長因子[5]。楊靜等[6]研究得出植物乳桿菌在恒溫培養6 h～8 h后進入對數生長期，18 h后進入穩定期。類干酪乳桿菌在4 h進入對數期，發酵30 h后進入穩定期[7]。比較菌株的生長速率和產酸量可以反映乳酸菌的發酵性能[8]，羅強等[9]從自然發酵泡菜中篩選出9株產酸能力較強的菌株。乳酸菌可以分泌多種抑菌物質，主要包括有機酸、細菌素、過氧化氫等[10]。乳酸菌能夠產生有機酸，而有機酸的存在會導致環境pH值降低，進而抑制腐敗菌的生長[11]。郝湘妹[12]研究抑制霉菌乳酸菌的篩選、特性及應用時，發現pH值為中性的發酵上清液的抑菌活性顯著下降（p＜0.05）。

發酵菌株的產酸性能和抑菌性能對酸菜的風味有重要影響。從溫度和含鹽量兩個方面探究對菌株生長的影響，通過探究乳酸菌發酵液在32 h內的pH值變化規律篩選出產酸速率最快的菌株，采用牛津杯瓊脂擴散法對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌指示菌進行抑菌試驗，篩選出對不同指示菌抑制效果比較好的菌株，以期獲得理想的人工接種乳酸菌菌株，從而顯著縮短酸菜發酵周期，改善酸菜的品質[13-14]，為實現高品質規模化工業化發酵生產提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

目標菌（食品乳桿菌、植物乳桿菌、類干酪乳桿菌菌株）：從自然發酵酸菜中分離所得；指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）：北京保藏生物科技有限公司。

MRS液體培養基：蛋白胨1.0 g、酵母膏0.5 g、牛肉膏1.0 g、磷酸氫二鉀0.2 g、檸檬酸二銨0.2 g、乙酸鈉0.2g、葡萄糖2.0g、吐溫80 0.1mL、MnSO4·4H2O 0.025g、MgSO4·7H2O 0.058 g、蒸餾水 100 mL，pH6.2～6.4[5]。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂 15 g～25 g、水 1 000 mL、pH7.4～7.6。

LB固體培養基：胰化蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂粉 15 g、pH7.0。

1.2 儀器與設備

SHP-250E生化培養箱：上海培因試驗儀器有限公司；SW-CJ超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；Legend Micro17離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生長趨勢的測定

選擇3種目標菌分別在MRS液體培養基中進行擴增培養，并將2%的相應菌液接種到MRS液體培養基中。將菌液置于37℃恒溫生化培養箱中培養52 h，每隔4 h測定1次菌液在600 nm處的吸光度，平行測定3次。

1.3.2 培養溫度對菌株生長的影響

以2%的接種量將菌液接種于50 mL MRS液體培養基中，分別在 20、23、26、29、32、35、38 ℃培養 24 h，并在600 nm處測定吸光度，平行測定3次[15]。

1.3.3 含鹽量對菌株生長的影響

以2%的接種量將菌液接種于NaCl濃度分別為0%、2%、4%、6%、8%和10%的MRS液體培養基中，于35℃生化培養箱中培養24 h，并在600 nm處測定吸光度，平行測定3次[15]。

1.3.4 乳酸菌的產酸性能測定

以2%的接種量將3株菌株接入到裝有2 mL MRS液體培養基的離心管中 37 ℃培養 0、8、16、24、32 h，分別測發酵液pH值，每株菌平行測定3次，結果取平均值[16]。

1.3.5 乳酸菌的抑菌性能研究

指示菌以金黃色葡萄球菌為例，大腸桿菌和沙門氏菌試驗方法參照金黃色葡萄球菌。配制固體金黃色葡萄球菌培養基，121℃滅菌15 min后取出倒平板，待凝固后于4℃保存備用。

金黃色葡萄球菌菌懸液的配制：將金黃色葡萄球菌接種于滅菌后的LB液體培養基中，放置在37℃恒溫培養24 h后取出放入4℃冰箱備用。

將2%的食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌3株菌的發酵液接種培養24 h后于4℃，12 000 r/min離心10 min，取發酵上清液4℃保存備用。取200 μL稀釋后的指示菌液于相應的指示菌培養基上并均勻涂布在平板表面，輕輕放上牛津杯（牛津杯既不能集中放，也不能放在平板的邊緣，均勻放置）；用移液槍向牛津杯中加入100 μL發酵上清液，對照用不加菌株的空白發酵液。放置在37℃恒溫培養箱中培養18 h后觀察抑菌圈大小，用游標卡尺測量抑菌圈大小，每株菌平行測定3次，結果取平均值，比較3株菌的抑菌圈大小。

2 結果與分析

2.1 生長曲線的繪制

2.1.1 菌株生長曲線

食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌菌株生長曲線如圖1所示。

圖1 菌株生長曲線Fig.1 Growth curves of strains

由圖1可知，食品乳桿菌在12 h后進入對數期，在24 h后進入穩定期，在36 h后進入衰亡期；植物乳桿菌在8 h后進入對數期，20 h后進入穩定期，在44 h后進入衰亡期；類干酪乳桿菌在8 h后進入對數期，24 h后進入穩定期，在40 h后進入衰亡期。由此可見，植物乳桿菌和類干酪乳桿菌的對數期比食品乳桿菌的對數期及穩定期更長，更適合作為酸菜添加菌株。

2.1.2 培養溫度對菌株生長的影響

培養溫度對食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌菌株生長的影響如圖2所示。

圖2 培養溫度對菌株生長的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the growth of strain

溫度通過影響乳酸菌細胞中酶的活性，從而影響乳酸菌菌株的生長。由圖2可知，隨著培養溫度的升高，乳酸菌生長得越好，均在35℃時生長狀態最佳；但當培養溫度超過35℃時，3株菌的生長均受到了抑制。Dong等[17]對乳酸菌株篩選研究表明溫度越高，乳酸菌細胞數量和乳酸產量越大，但在32℃～35℃時生長最好，乳酸產量最高，并且隨著溫度繼續升高，生長繁殖受到抑制，乳酸產量下降。

2.1.3 菌株耐鹽試驗

食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌菌株耐鹽試驗結果如圖3所示。

圖3 菌株耐鹽試驗Fig.3 Salt tolerance test of strain

由圖3可知，隨著含鹽量的增加，3株菌的生長繁殖均受到了抑制，在低濃度時，抑制作用不明顯，而在高濃度時幾乎不生長，綜合發酵酸菜需要一定含鹽量的情況，含鹽量控制在0%～8%時，乳酸菌的活性最好。黃海欽等[18]發明一種老壇酸菜的加工工藝方法，其酸菜含鹽量為7%～9%時比自然發酵工藝腌制出來的酸菜酸度更為明顯，風味更佳，食用口感更好。

2.2 乳酸菌的產酸性能

食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌菌株的發酵液在0～32 h內的pH值變化如圖4所示。

圖4 乳酸菌發酵液pH值變化Fig.4 pH levels of fermentation broth of lactic acid bacteria

由圖4可以得出，3株菌株發酵液的pH值整體變化呈下降趨勢。在0～8 h之間pH值下降速度最快，此時3株菌在對數生長期代謝旺盛，產酸速率最快，8 h～24 h之間pH值下降速度減緩，此時部分乳酸菌菌株已進入穩定期，營養物質變少，24 h～32 h之間pH值下降更慢，這是因為大部分乳酸菌已進入穩定期，營養物質基本消耗殆盡，酸類等代謝產物大量累積，這在一定程度上又抑制了酸的形成。0～24 h之間pH值下降速率最快的菌株是植物乳桿菌，其中植物乳桿菌和類干酪乳桿菌發酵液24 h后的pH值最低，分別為3.23和3.24，pH值下降速率最快。因此植物乳桿菌和類干酪乳桿菌的產酸能力最強。菌株的產酸能力越強，加入到酸菜進行發酵，發酵時間越短。綜上，選擇植物乳桿菌和類干酪乳桿菌作為添加菌株。

2.3 乳酸菌的抑菌性能結果

食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌菌株對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌3種指示菌的抑菌效果如圖5所示。

圖5 乳酸菌對指示菌抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of lactic acid bacteria on indicator bacteria

如圖5所示，3株乳酸菌抑制大腸桿菌效果大小順序：植物乳桿菌＞類干酪乳桿菌＞食品乳桿菌，抑菌圈直徑分別為16、15、12 mm；對金黃色葡萄球菌抑菌效果大小順序：植物乳桿菌＞類干酪乳桿菌＞食品乳桿菌，抑菌圈直徑為17、14、13 mm。對沙門氏菌抑菌效果大小順序：類干酪乳桿菌＞植物乳桿菌＞食品乳桿菌，抑菌圈直徑為20、18、14 mm。從數據分析得出同一指示菌對不同乳酸菌的抑制效果不相同，這和趙媛媛[16]研究乳酸菌對不同指示菌的抑制的結果相符。其次，植物乳桿菌對大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，抑菌圈直徑幾乎都在16 mm～18 mm；從這一數據可以得出：同一菌株對不同指示菌的抑制效果不同[19]。指示菌有陽性菌和陰性菌，而3株乳酸菌株都是陽性菌株，一般來說，大多數乳酸菌僅僅抑制親緣關系相近的菌種或多數革蘭氏陽性細菌[20]，也有研究表明，陽性菌株對陽性指示菌的抑制作用大于對陰性指示菌的抑制作用。所以植物乳桿菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果好于對沙門氏菌。

植物乳桿菌具有較強的抑菌作用，如陸春波等[21]確定了植物乳桿菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌具有較強的抑制作用；Dong等[17]研究發現植物乳桿菌能產生抑菌物質乙酸、乳酸和丙酸等有機酸。植物乳桿菌能產生植物乳桿菌素，該細菌素在pH值較低的酸性環境中有較強的抑菌活性，高壓處理其發酵上清液后仍保持良好的抑菌活性[12]。植物乳桿菌具有抑菌作用，酸菜中添加植物乳桿菌就能增加酸菜中抑菌物質含量，而酸菜中含有的乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸有助于酸菜的抑菌性能。

綜上所述，對3種指示菌抑制效果均比較好的菌株是植物乳桿菌和類干酪乳桿菌。這兩株乳酸菌對3種指示菌都具有良好的抑菌能力，同時這兩株菌能有效改善酸菜的腐敗，對酸菜的風味物質的形成具有重要意義。由此，選擇植物乳桿菌和類干酪乳桿菌作為發酵酸菜的優良菌株。

3 結論

對食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌這3株乳酸菌，進行生長繁殖的測定試驗，結果發現3株菌的pH值均呈下降趨勢，但植物乳桿菌和類干酪乳桿菌的pH值較食品乳桿菌低，所以選擇植物乳桿菌和類干酪乳桿菌作為pH值下降快、產酸速率高的菌株。通過抑菌特性試驗，發現植物乳桿菌和類干酪乳桿菌對3種指示菌的抑菌圈直徑均大于食品乳桿菌，認為這兩株菌抑菌能力較好。綜合產酸特性和抑菌特性，篩選植物乳桿菌和類干酪乳桿菌兩株菌作為人工添加菌株，可進行深入研究。但本研究針對的是常見3種腐敗菌和致病菌，下一步可以增加指示菌的種類，對乳酸菌抑制腐敗菌和致病菌的物質和原理進行深入探究。