紫錐菊根中菊苣酸提取工藝及對氧化應激腸道細胞的保護作用研究

李一鵬，張 虎，任 娟，任 欣，劉聚祥，王庚南

(河北農業大學動物醫學院，保定 071000)

目前，中藥免疫增強劑成為畜牧養殖業研究熱點，其不但能夠提高機體的免疫水平，還能夠避免長期使用化學藥物對動物機體產生的毒副作用以及藥物殘留等問題[1]。菊苣酸是一種可以從紫錐菊、菊苣等菊科植物中廣泛提取出來的咖啡酸衍生物，又名二咖啡酰酒石酸。研究顯示，菊苣酸作為一種中藥提取物具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、提高機體免疫力等藥理功效[2]。紫錐菊的地上部分及根中均含菊苣酸[3]，而根中菊苣酸含量最高。伏健[4]曾用乙醇回流法對紫錐菊頭狀花序進行提取試驗，優化提取工藝得到了菊苣酸含量為0.45%。孟創鴿[5]用超聲波提取法提取了紫錐菊莖部的菊苣酸，菊苣酸得率為1.51 mg/g。也有學者利用加熱回流[6]及超聲波協同方法[7]對紫錐菊根部進行了研究，但提取率相對較低。用更安全的提取溶劑更簡便的提取方法，更能迎合工業化生產的需求，所以本研究以紫錐菊根為原料，乙醇為溶劑，超聲提取為手段，優化菊苣酸的提取工藝。

氧化應激是指動物機體在代謝過程中產生大量的氧化自由基和活性氧，可能會造成機體抗氧化系統的失衡，造成一定程度的氧化損傷。在動物的集約化養殖過程中，氧化應激的危害已經十分明顯，如心臟病、乳房炎、腎病、消化道炎癥等疾病都可能通過氧化應激導致，很大程度上影響了畜牧養殖業的發展[8]。而造成動物氧化應激的原因多種多樣，如環境因素、自身狀態的改變、外源致病菌或病毒等[9]。在蛋雞的養殖中，氧化應激會對蛋雞產蛋后期繁殖性能造成影響[10]，Tarin[11]首次提出蛋雞卵巢老化是由于胞內活性氧的積聚和與衰老相關的細胞損傷造成的；仔豬的氧化應激會造成采食量和平均日增重的下降[12]；更有研究顯示，母牛在高產期由于體內大量的代謝活動，造成活性氧的聚積，從而產生氧化應激，對奶牛的產奶量和乳制品的質量有一定影響[13]。故抗氧化劑的研究和發展對畜牧養殖業的發展以及對提高畜牧養殖產品的質量有著重大意義。

研究表明，菊苣酸可以通過降低細胞內活性氧和脂質過氧化物丙二醛的積累、清除自由基、抑制氧化低密度脂蛋白等方式，發揮抗氧化損傷的藥理作用[14]。Liu等[15]通過體外抗氧化試驗證明菊苣酸清除DPPH·、·OH和ABTS·+自由基的能力很強，高于咖啡酸和酒石酸的抗氧化能力。常小文[16]以人肝癌細胞(Hep G2)細胞為研究對象，證明了菊苣酸體內甲基化代謝產物對該細胞氧化應激損傷有較強的抗氧化活性，且菊苣酸甲基化的程度越高，其抗氧化活性就越強。口服是最常用且是適應性最佳的給藥方式，但目前菊苣酸對腸道細胞的抗氧化應激損傷作用鮮有報道。本研究針對人結腸腺癌細胞(Caco-2)及豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)兩種腸道細胞，構建氧化應激模型，進一步證明菊苣酸在腸道細胞中的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和主要試劑 人結腸腺癌細胞(Caco-2細胞)購自協和細胞庫；豬小腸上皮細胞(IPEC-J2細胞)購自北納生物科技有限公司。紫錐菊根粉末(80目)由上海源葉生物科技有限公司提供；菊苣酸標準品由中國食品藥品檢定研究院提供；無水乙醇由天津北辰方正試劑廠生產；乙腈(色譜級)和甲醇(色譜級)均購自德國默克股份兩合公司；DMEM高糖培養基和HBSS溶液均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器 液相色譜儀(HPLC1525)產自Waters公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗儀產自昆山市超聲儀器有限公司；離心機產自上海安亭科學儀器廠；細胞培養箱購自賽默飛世爾科技有限公司；酶標儀購自伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 二元溶劑泵(Waters1525)，自動進樣器(Waters2487)，二極管陣列檢測器(PDA,Waters2998)，Waters Sunfire 反相C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為0.1%磷酸水溶液(A)和乙腈(B)，等度洗脫流動相比例A∶B為7∶3，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長327 nm，進樣量20 μL。

1.2.2 溶液的配制及標準曲線的制作 標準品溶液：精密稱量1.0 mg菊苣酸標準品溶于流動相中，配制成1 mg/mL，再稀釋成500、200、100、50、20 μg/mL濃度的標準品溶液，按照1.2.1項下色譜條件進行檢測，記錄峰面積，以菊苣酸濃度(μg/mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 檢測限及定量限 配制一系列濃度的標準溶液進行色譜檢測，當信號和噪音的比值(S/N)為3時即為方法的檢測限，當S/N=10，且將此時的濃度帶入標準曲線中，實測濃度和規定濃度偏差在±20%以內時，所得濃度即為定量限。

1.2.4 超聲輔助提取單因素試驗 稱取10.0 g紫錐菊根粉末，放入250 mL圓底燒瓶中，以不同濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇作為提取劑，按照不同料液比(1∶12、1∶15、1∶18、1∶21)進行混勻后，在不同溫度(40、50、60、70、80 ℃)下進行最大功率的超聲提取(1、2、3次)，提取不同時間(1、2、3 h)，進行單因素試驗，每個因素所得提取液進行冷凍干燥，稱重，取一定量樣品溶解進行高效液相色譜(HPLC)檢測，每個因素進行3次平行試驗計算菊苣酸得率。

1.2.5 超聲輔助提取正交試驗 選取各個單因素最優條件以及最優條件相鄰的兩個條件，進行正交試驗設計，采用L9(34)正交試驗設計表，設置時間、溫度、料液比和乙醇濃度為影響因素，選取能夠提取出最高含量菊苣酸的提取工藝，各項參數如表1所示，進行3次平行試驗。

表1 因素水平表

1.2.6 菊苣酸細胞毒性試驗 取對數生長期的細胞，以5×104/孔接種到96孔板中，在細胞培養箱中培養24 h，將每孔中的培養基取出棄去，用PBS溶液沖洗3次，分別加入不同濃度的菊苣酸(100、200、400、600、1 000 μmol/L)，在細胞培養箱孵育24 h后，每孔中加入20 μL的MTT溶液，孵育4 h后棄去培養基，每孔中加入100 μL DMSO，避光震蕩10 min，用酶標儀測定570 nm波長下各孔的吸光度值(D570 nm)。并計算細胞存活率：細胞存活率(%)=(試驗組D570 nm/對照組D570 nm)×100%。

1.2.7 細胞氧化應激損傷模型的構建 將細胞接種到96孔板中，以H2O2為造模劑，加入不同濃度的H2O2(100、200、400、600、800、1 000 μmol/L)，培養4 h，用MTT法檢測各個孔的吸光度并計算各個濃度下細胞的存活率。當細胞存活率處在50%～70%[17]時，即構建氧化應激模型成功。

1.2.8 菊苣酸對細胞氧化損傷保護效果試驗 將細胞接種到96孔板中，加入不同濃度菊苣酸(100、200、400、600、800、1 000 μmol/L)，以抗壞血酸(200 μmol/L)為陽性對照，以等體積HBSS溶液為陰性對照，孵育24 h后除對照組外，其余組分別加入一定量的H2O2溶液(濃度通過1.2.7的結果確定)，孵育4 h后用MTT法檢測各個孔的吸光度并計算細胞存活率。以細胞存活率為縱坐標、藥物濃度的對數值為橫坐標，用GraphPad Prism 6.0軟件對數據進行擬合，求得半數抑制濃度(IC50)。

1.2.9 菊苣酸對氧化損傷應激細胞的緩解效果試驗 在構建的氧化損傷細胞中加入不同濃度的菊苣酸(濃度同1.2.8)，以抗壞血酸(200 μmol/L)為陽性對照，以等體積HBSS溶液為陰性對照，孵育24 h后，用MTT法檢測各個孔的吸光度(D570 nm)并計算細胞存活率。

2 結 果

2.1 標準曲線的建立

根據HPLC的結果建立標準品的線性回歸方程為：Y=105.4X-47225，R2>0.999。

2.2 檢測限和最低定量限

以信噪比(S/N)=3為檢測限，S/N=10為定量限，經測定檢測限為50 ng/mL，最低定量限為100 ng/mL。

2.3 超聲輔助提取菊苣酸單因素試驗

2.3.1 提取時間對菊苣酸得率的影響 取紫錐菊根粉末按照1∶18料液比加入80%濃度乙醇，在60 ℃下分別超聲1、2、3 h，經HPLC檢測后結果見圖1A。由圖1A可知超聲2 h之內菊苣酸得率隨時間延長而逐漸增高，但在2 h之后，菊苣酸得率無明顯變化，提取時間選用2 h為佳。

2.3.2 乙醇濃度對菊苣酸得率的影響 取紫錐菊根粉末按照1∶18料液比加入30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，在60 ℃下超聲2 h，經HPLC檢測所得結果見圖1B。由圖1B可知，當乙醇濃度的小于40%時，隨著濃度的升高菊苣酸得率增大，到40%達到最大，但是繼續增大乙醇濃度其得率呈現逐漸減少的趨勢，因此選用40%濃度的乙醇溶液為正交試驗的中間濃度。

2.3.3 溫度對菊苣酸得率的影響 取紫錐菊根粉末按照1∶18料液比加入80%濃度乙醇，分別在50、60、70、80 ℃下超聲2 h，經HPLC檢測所得結果見圖1C。由圖1C可知，在60 ℃以下，隨著溫度的升高，菊苣酸得率逐漸升高，而60 ℃之后菊苣酸得率隨溫度的升高而呈現降低的趨勢，因此在60 ℃左右對紫錐菊根粉末提取能夠得到較多的菊苣酸。

2.3.4 料液比對菊苣酸得率的影響 取紫錐菊根粉末按照1∶12、1∶15、1∶18、1∶21料液比加入80%濃度乙醇，在60 ℃下超聲2 h，經HPLC檢測所得結果見圖1D。由圖1D可知，在15倍體積提取溶劑之前隨著料液比的增加提取率有所提高，但繼續增大溶劑量，菊苣酸的提取率逐漸變小，故選用料液比為1∶15為宜。

2.3.5 提取次數對菊苣酸得率的影響 取紫錐菊根粉末按照1∶18的料液比在60 ℃下進行超聲輔助提取2 h，取樣后進行抽濾，將殘渣收集再按照1∶18的料液比進行提取，總共提取3次，測得結果如圖1E。由圖1E可知，提取1次時紫錐菊根粉末中菊苣酸絕大部分被提出，只是剩余一小部分殘存，出于經濟、時間方面考慮，提取次數為1次。

圖1 超聲輔助提取菊苣酸單因素試驗結果

2.4 超聲輔助提取菊苣酸正交試驗

由表2可知，在所選擇的4個因素中溫度對菊苣酸提取率影響最大，溶劑濃度次之，料液比和時間對得率影響相對較小，主次順序為：溫度>溶劑濃度>料液比=時間，選擇最優水平溫度為70 ℃，料液比為1∶18，超聲時間為2 h，溶劑濃度選擇50%，按照最優組合，即50%乙醇濃度按照1∶18的料液比，在70 ℃下超聲2 h提取，菊苣酸提取得率為1.89 mg/g。

表2 正交試驗結果

2.5 菊苣酸的細胞毒性試驗

用不同濃度的菊苣酸孵育細胞24 h后，細胞存活率如圖2所示，菊苣酸濃度在100～1 000 μmol/L的范圍下，Caco-2和IPEC-J2細胞的存活率均在90%以上，故菊苣酸在100～1 000 μmol/L的濃度范圍內對Caco-2和IPEC-J2細胞均沒有毒性。

圖2 不同濃度的菊苣酸處理24 h對細胞存活率的影響

2.6 細胞氧化損傷應激模型建立最佳濃度

由圖3可知，當H2O2濃度為200 μmol/L時，Caco-2細胞存活率為62.43%，處在50%～70%之間，可以作為Caco-2細胞氧化損傷應激模型建立的最優濃度。當H2O2濃度為400 μmol/L時，IPEC-J2細胞存活率為62.06%，處在50%～70%之間，可以作為IPEC-J2細胞氧化損傷應激模型建立的最優濃度。

圖3 不同濃度H2O2處理4 h對細胞存活率的影響

2.7 菊苣酸對細胞氧化損傷的保護效果

如圖4所示，在用不同濃度菊苣酸處理細胞后，再用H2O2誘導細胞的氧化損傷，當菊苣酸濃度為800 μmol/L時，Caco-2細胞存活率最高，為74%，與陽性對照組相當；當菊苣酸濃度為100 μmol/L時，Caco-2細胞存活率為54.5%，與陰性對照組相當；經過計算，Caco-2細胞的IC50值為172.6 μmol/L。

圖4 不同濃度的菊苣酸對細胞氧化損傷的保護效果

當菊苣酸濃度為600 μmol/L時，IPEC-J2細胞的存活率最高，為67.53%；當菊苣酸濃度為100 μmol/L時，IPEC-J2細胞的存活率為51.8%，與陰性對照組相當。經過計算，IPEC-J2細胞的IC50值為133.1 μmol/L。

2.8 菊苣酸對細胞氧化損傷的緩解效果

由圖5可知，當菊苣酸濃度為400 μmol/L時，Caco-2細胞的存活率最高，為70.2%；當菊苣酸濃度為100 μmol/L時，Caco-2細胞的存活率最低，為52.8%。經過計算，其IC50值為207.5 μmol/L。

圖5 不同濃度的菊苣酸對細胞氧化損傷的緩解效果

當菊苣酸濃度為100 μmol/L時，IPEC-J2細胞的存活率最高，為75.92%；當菊苣酸濃度為1 000 μmol/L時，IPEC-J2細胞的存活率為57.33%，與陰性對照組相當。經過計算，IPEC-J2細胞的IC50值為196.5 μmol/L。

3 討 論

菊苣酸的獲取途徑包括用化學方法合成[18]以及從植物體內提取純化。但由于用化學合成法容易產生較多的副產物，造成一定程度的環境污染，且長期服用容易產生耐藥性或造成肝腎損傷。所以天然植物中的菊苣酸提取工藝的優化是重中之重。在有關菊苣酸提取的相關文獻中，多以紫錐菊全草或是地上部分為原料，而在相關研究中菊苣酸在紫錐菊的花和根中含量豐富，分別為1.2%～3.1%和0.6%～2.1%[19]，且根部含量最高，所以本研究選用紫錐菊根粉作為原材料。而較短的提取時間，較少的提取次數，簡單的提取方法，安全的提取溶劑更能適應工業化生產，對比相關文獻的回流提取[20]及超聲輔助提取法[5]，本提取工藝更加便捷，省時，且得率較高。

對于氧化應激損傷細胞模型的建立，應激源的選擇多種多樣，前人通過很多試驗證明了很多應激源均可以成功構建氧化應激細胞模型。除H2O2[21]、MPP+[22]、6-OHDA[23]等化學類應激源外，還包括一些物理類應激源與生物類應激源[24]。本試驗選用H2O2為應激源進行細胞氧化損傷應激模型的建立，其優點在于H2O2性質穩定，易于獲得、成本較低且效果明顯。此外在建立細胞氧化損傷應激模型的過程中發現，IPEC-J2與Caco-2細胞所需的H2O2溶液的濃度并不一致，說明不同的細胞系對H2O2溶液的氧化應激效果有所差異。

天然酚酸及多糖類藥物均有良好的抗氧化效果，而菊苣酸是從紫錐菊等菊科植物中提取出來的天然酚酸類化合物。在本研究中菊苣酸作用于兩種腸道細胞的氧化應激保護和緩解作用的IC50值在133.1～207.5 μmol/L之間，均遠小于文獻中用DPPH法測定的茶多酚的抗氧化IC50值(0.143 mg/mL)，與三七多糖的抗氧化IC50值(0.055 mg/mL)相接近[25]，同時在選定濃度下最強的抗氧化效果與所選定的陽性藥物抗壞血酸相當，且保護效果的IC50值小于緩解效果的IC50值，顯示菊苣酸在這兩種腸道細胞中具有很好的氧化損傷保護和緩解效果，且對氧化損傷的保護效果明顯優于其緩解效果，在一定程度上證明了菊苣酸具有成為腸道細胞的天然抗氧劑的潛力。

4 結 論

本研究設計了4個因素3個水平正交試驗，對提取方案進行優化，最終得到了菊苣酸提取率最高的優化方案為：50%乙醇濃度按照1∶18的料液比，在70 ℃下超聲2 h提取，最終菊苣酸提取得率為1.89 mg/g。并發現菊苣酸對Caco-2和IPEC-J2兩種腸道細胞均有很強的保護和緩解氧化損傷的效果，其保護作用的IC50值分別為172.6和133.1 μmol/L，緩解作用的IC50值分別為207.5和196.5 μmol/L。