應用MALDI-TOF MS 分析黃連素作用前后耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌質譜峰圖的改變

許敏靜 林少華 干鐵兒

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是社區獲得感染、醫院內獲得感染的重要病原菌之一，且耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的感染呈逐年上升[1]，給臨床診治帶來了極大挑戰。研究發現，黃連素能較好地抑制CRKP 的生長，并且有逆轉CRKP 耐藥性的作用[2]。基于此，本研究擬采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）對黃連素作用前后CRKP 進行分析，評估黃連素作用后細菌蛋白質峰譜的改變。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集浙江中醫藥大學附屬第一醫院門診及住院患者的產CRKP 菌20 株（去除來自同一患者的重復菌株），所有菌株均經質譜鑒定和耐藥基因確認。

1.2 試劑和儀器 哥倫比亞血瓊脂培養基（溫州康泰生物技術有限公司），營養肉湯培養基（杭州濱和微生物試劑有限公司,批號200217），黃連素（浙江省杭州市華東大藥房，批號16110312），0.45% NaCL樣本稀釋液（法國生物梅里埃公司，批號C0550），三氟乙酸（批號202010022）、乙腈（批號202010081）、甲酸（批號202010031）（成都艾科達化學試劑有限公司），α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA，批號0000370825）（布魯克·道爾頓公司），Densichek Plus比濁儀（法國生物梅里埃公司），96 孔加樣板，基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜儀（德國Bruker 公司）。

1.3 質量控制 基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜儀自動分類程序由BTS（布魯克·道爾頓公司）作為校準品進行自動驗證，質控菌株大腸埃希菌ATCC25922（購自國家衛生健康委臨檢中心）。

1.4 方 法

1.4.1 營養肉湯 取22g 營養肉湯培養基加1000 mL蒸餾水，加熱溶解，121 ℃高壓滅菌，4 ℃冰箱保存備用（不超過2 周）。

1.4.2 黃連素原液 將黃連素溶解于無菌生理鹽水中，加熱溶解，用營養肉湯稀釋成終濃度為256 μg/mL的溶液，置4 ℃冰箱保存備用（不超過1 周）。

1.4.3 菌懸液制備 取哥倫比亞血瓊脂培養基培養過夜的產CRKP 菌新鮮菌落于NaCl 濃度為0.45%樣本稀釋液中，配制成相當于0.5 麥氏單位的菌懸液（1.5×108cfu/mL 菌懸液），再用0.45%生理鹽水稀釋100 倍至1.5×106cfu/mL 備用。

1.4.4 菌株培養 取1 μL 菌懸液接種于含黃連素的營養肉湯中，并以空白營養肉湯作對照組，于35 ℃振蕩培養5 d，孵育結束后用接種環轉種至哥倫比亞血平板，35 ℃孵育18～24 h，得到第2 代菌株；同樣方法對2 代菌株進行培養得到第3 代菌株。

1.4.5 菌株鑒定 將上述菌株用MALDI-TOF MS進行鑒定，具體操作方法參照文獻[3]。將所得的質譜峰圖與MALDI Biotype 3.0 軟件（德國Bruker 公司）中的數據庫進行比較，并用匹配分值來給結果定級。分值為2.300～3.000 可以準確的鑒定到種水平；分值為2.000～2.299 可以準確的鑒定到屬。

1.5 統計學方法 應用ClinProTools 3.0 軟件對各菌株質譜峰圖譜進行分組分析。具體步驟參照儀器自帶的ClinProTools 3.0 軟件介紹與操作指南。基本參數維持不變，將所有菌株分成三組（原始菌株、2 代菌株和3 代菌株），然后分別將原始菌株和2 代菌株、原始菌株和3 代菌株進行分析，分別選擇遺傳算法（GA）、快速分類算法（QC）、監督式神經網絡算法（SNN）對數據進行分析并建立相應的模型。每一模型中的識別能力（recognition capability）和交叉驗證（cross validation）分別體現了該模型的靈敏性和特異性。

2 結果

2.1 鑒定結果 20 株試驗菌株經MALDI-TOF MS鑒定結果全部為肺炎克雷伯菌，其分值均＞2.300，可以準確鑒定到種水平。

2.2 ClinProTools 軟件分析結果

2.2.1 算法統計 進行峰統計之后，ClinProTools 將原始菌株組和3 代菌株組細菌較清晰地劃分成兩個區域，大部分菌株準確落在相應的分組中，只有1 個3 代菌株落在原始菌株組種（見圖1）。通過GA、QC和SNN 三種方法得出的結果基本相似，其靈敏度均大于95.00%，其中SNN 算法得出的靈敏度最高（100.00%），其次GA、QC 算法的靈敏度均為97.50%；GA、SNN 和QC算法的特異性分別為89.90%、92.36%、88.86%（見表1）。

圖1 原始菌株與3 代菌株的二維分析圖

表1 應用ClinProTools 3.0 軟件得到的各個算法模型的靈敏度與特異性

2.2.2 特征性峰數據統計 采用ClinProTools 對質譜峰統計結果顯示，峰169、158、174、168 為區分的最為主要的特征峰，這4 個特征性峰的Anderson-Darling 檢驗的P 值（PAD）均接近0（見表2），因這些峰呈非正態性分布，而秩和檢驗的P 值（PWKW）值均＜0.05，說明兩組菌株之間的這4 個峰的差異有統計學意義。

表2 區分原始菌株和三代菌株的特征性峰的峰值統計數據

3 討論

近年來，MALDI-TOF MS 為一種快速鑒定病原性細菌種屬的新技術，是利用微生物之間擁有的自身獨特的蛋白質組成原理，分析檢測蛋白質指紋圖譜,經過軟件分析處理，再與數據庫比對，通過分析病原菌菌株間蛋白豐度的細小差異[4]，能在幾分鐘之內完成對微生物種或屬水平的鑒定。在臨床中，MALDI-TOF MS 技術的應用不僅限于菌種或屬的快速鑒定[5-6]，同時已涉及多個領域，如流行病學、細菌快速分型、耐藥分析和毒力檢測等[7]，尤其是目前耐藥菌感染的嚴峻形勢，學者們加快了對快速檢測細菌耐藥性及其變遷方法的探索,應用MALDI-TOF MS尋找特異質譜峰是分析耐藥性及其變遷的關鍵。

Gaibani 等[8-9]評估了實時單峰法檢測CRKP 的性能，結果顯示，準確率為98%、陽性預測值為98%、陰性預測值為97%。該方法的高預測值表明MALDI-TOF MS 可作為篩選CRKP 的一線工具。本研究應用MALDI-TOF MS 比較陰性對照（原始菌株）和待測菌株（黃連素感觸后）所記錄的峰值數量和強度，當細菌耐藥性變化越大時,峰譜圖發生變化越大，對20 株CRKP 菌株圖譜建立模型，得到二維圖顯示作用前菌株和第3 代菌株大部分落在相應的分組中，說明菌株的蛋白質結構發生變化，且兩者間存在較大的差異。三種算法靈敏度均大于95%，特異性大于88%；峰169、158、174、168 是用于區分的最為主要的特征性峰，可能原因是黃連素改變了CRKP 蛋白或者多肽的表達，導致形成的峰譜圖出現差異。但也存在少量 菌株模棱兩可的情況，無法清晰地分入組中，可能存在一些可影響因素，比如細菌培養基的選擇、細菌的培養條件、樣品處理以及基質結晶等可能會影響質譜的峰圖[10]，因此實驗還需要進一步完善。

綜上所述，使用MALDI-TOF MS 技術對黃連素作用前后的產CRKP 菌進行蛋白質峰譜分析，結果顯示黃連素作用后其蛋白質譜峰有顯著差異，可能黃連素改變了CRKP 菌某些基因序列，從而改變了蛋白質或多肽的表達，改變的結構與其耐藥性可能存在相關性，但對使用黃連素后改變的蛋白所對應基因尚未有明確，有待于進一步研究，這也為后續的進一步研究提供思路。同時應用MALDI-TOF MS 分析質譜圖的峰值變化可提示某些耐藥類型，對于已有MALDI-TOF MS 設備作為常規細菌種或屬鑒定的臨床實驗室，對細菌耐藥性相關質譜峰分析只需增加數據分析步驟，成本低廉，也避免工作人員復雜的操作培訓，具有遠大的應用前景。