大劑量維生素C選擇性殺傷TSC2基因突變細胞抑制其增殖

夏盈峰，方明，劉夢玲，余雅婕，李敏

(三峽大學人民醫院.宜昌市第一人民醫院神經內科，湖北 宜昌 443000)

0 引言

結節性硬化癥(Tuberous sclerosis complex，TSC)為常染色體顯性遺傳多系統良性腫瘤綜合癥,患病率為1/6000-1/10000，全球有近100萬人罹患此病，而在中國約有20萬患者[1,2]。其典型的臨床特征包括心臟橫紋肌瘤，面部血管纖維瘤、大腦皮層結節、室管膜下巨細胞星形細胞瘤，腎臟血管肌脂瘤等，嚴重時引起腦積水、腎臟腫瘤破裂出血、腎功能衰竭或腎癌，呼吸衰竭，可危及病人生命[3,4]。因為受眾相對較少，與其它罕見病一樣，人們對結節性硬化癥缺乏重視，藥物鮮有開發，這使得探索新型藥物治療結節性硬化癥顯得尤為重要。

1978年Fryer等人首次發現并報道了1個與TSC發病相關的致病基因并命名為TSC1基因，隨后于1992年Kandt等人發現并報道了另一個與該病密切相關基因并命名為TSC2，研究發現，在大約80%的結節性硬化癥病人可以發現存在抑癌基因TSC1或TSC2的失活性突變[5,6]。生理狀態下TSC1和TSC2作為一蛋白質復合體，負性調節雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的功能。mTOR作為一個細胞內承上啟下的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶樞紐，主要通過整合生長因子和營養信號來調控細胞生長、增殖、分化和代謝等多種重要生物學過程[7]，然而TSC1和TSC2的突變導致mTOR通路的過度活化，引起細胞的異常增殖，引發TSC病變，臨床表現為心臟橫紋肌瘤，面部血管纖維瘤、大腦皮層結節、室管膜下巨細胞星形細胞瘤等[6-9]，已證實應用mTOR特異性抑制劑雷帕霉素(Rapamycin)及其衍生物拮抗過度活化的mTOR能顯著改善TSC患者的臨床癥狀[10-12]，但rapamycin及其衍生物只部分抑制細胞增長，停藥后TSC患者異常增殖的體細胞會恢復生長且目前相關藥物售價昂貴，另一方面約 10%-30% 的患者在使用 mTOR 抑制劑過程 中會出現不良反應，臨床上常見有 :上呼吸道感染、 口腔炎、痤瘡、關節痛、可逆性雙下肢水腫、腹瀉血液學檢查可能出現肝酶或堿性磷酸酶輕度升高， 血脂異常，白細胞、血紅蛋白及血小板減低，嚴重者可能還會出現心包炎或肺炎等情況等[12,13]。因此，深入了解結節性硬化癥發病機制和尋找更好的治療方法，是目前亟待解決的問題。

維生素 C又稱抗壞血酸(Ascorbic Acid)是生物體內不可缺少的必需營養素，細胞內外維生素 C轉運的形式為脫氧抗壞血酸(Dehydroascorbate，DHA)，同時依賴于細胞膜表面的葡萄糖轉運蛋白(Facilitative Glucose Transporters，GLUTs)和維生素 C鈉協同轉運蛋白(Sodium 維生素 C Cotransporters，SVCTs)，轉運入細胞內的DHA在谷光甘肽(GSH)、硫氧環蛋白及NADPH作用下還原為維生素 C，在該過程中可產生活性氧(ROS)[14-17]。有臨床研究表明，高劑量靜脈注射維生素C(在大多數試驗中，每周兩次或每周三次50-100 g)可作為治療各種癌癥的方法，包括膠質母細胞瘤，卵巢癌，前列腺癌，肺癌或直腸癌。與放射和/或標準化學療法聯用時，具有良好的耐受性，且毒性極小，改善了患者的生活質量，并具有協同治療作用，并減少了其副作用。然而，這些研究大多數都不是作為大規模的隨機臨床試驗而設計的，目前對維生素C的臨床療效的明確驗證相當有限[18,19]。2015年Yun J等人研究發現維生素 C可選擇性抑制KRAS和BRAF突變的結直腸癌細胞，其主要機制是因KRAS和BRAF突變能夠顯著增加結直腸癌細胞表面的葡萄糖轉運蛋白(GLUTs)，使進入細胞中DHA增多，增多的DHA在細胞內還原為維生素 C的過程中產生大量活性氧(ROS)，從而導致細胞死亡。而Zhang Hongbing等人的研究證實在TSC2缺失的小鼠成纖維細胞(MEFs)中活化的mTOR可增加細胞中GLUT1和GLUT3的表達水平[20]。因此我們猜測：維生素 C是否能夠通過GLUT1和GLUT3而選擇性抑制TSC突變所致的細胞異常增殖呢？通過研究我們在細胞水平證實了維生素 C可選擇性增加TSC突變細胞內活性氧(ROS)而導致細胞死亡，并初步揭示了維生素 C選擇性抑制TSC突變所致的細胞異常增殖的作用機制，這有望為結節性硬化癥及mTOR通路異常激活腫瘤的靶向治療提供新的方法及思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

小鼠P53基因敲除成纖維細胞系、P53、TSC2敲除成纖維細胞系、TSC2基因缺失宮頸癌細胞系323V及敲入細胞系323T2細胞系均來源于中國醫學科學院基礎醫學研究所張宏冰教授實驗室；胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、PBS 緩沖液、青霉素和鏈霉素均購自美國Gibco公司， RNA 純化試劑盒和 qPCR 試劑盒均購 于 QIAGEN 公司， MTT 及、DMSO 試劑、雷帕霉素粉末均購于 Sigma公司，TRIzol RNA 提取試劑盒、Thermo 逆轉錄試劑盒購自 Thermo Fisher Scientific 公司。SYBRGreen試劑購買于Takara公司。

1.2 細胞培養與藥物處理

細胞培養P53基因敲除細胞及P53和TSC2基因敲除細胞分別置于補充有 10% 胎牛血清，100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 鏈霉素的DMEM培養基中，并在 37 °C 、5% CO2且飽和濕度的恒溫培養箱中培養。

1.3 MTT檢測細胞增殖

處于生長對數期P53基因敲除細胞及P54、TSC2基因敲除細胞接種于96孔板中，接種24小時后分別于培養基中加入不同濃度維生素C，終濃度為4uM 40uM 200uM、600uM、800uM及1mM，分別于12小時、24小時、36小時及48小時，吸凈上清，PBS洗一遍，加入 150 μL MTT 試劑，孵育4小時后加入DMSO，使用酶標儀在 570 nm 處測量光密度。計算細胞增殖抑制率。

處于生長對數期P53基因敲除細胞及P54、TSC2基因敲除細胞接種于96孔板中，接種12小時后于所有細胞中加入終濃度為10nMRapamycine或DMSO作用24小時后，加入終濃度為4uM 40uM 200uM、600uM、800uM及1mM維生素C，作用24小時后，洗凈上清，PBS洗一遍，加入 150 μL MTT 試劑。孵育4小時后加入DMSO，使用酶標儀在 570 nm 處測量光密度。計算細胞增殖抑制率。

1.4 細胞ROS檢測

細胞以每孔200000至300000個細胞的密度接種在含有10%FBS的DMEM培養基中的12孔培養板中。48小時后，移除培養基，用PBS清洗細胞，并在含有5 mM維生素C的培養基中培養(不含酚紅的DMEM培養基)。在37℃下培養30min后，將最終濃度為10μm的2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA，Sigma)添加到培養基中，并將細胞進一步培養30min。用胰蛋白酶消化細胞，用PBS重新懸浮，并用BC FACS Canto II流式細胞儀(BD Biosciences)獲取數據并用FlowJo分析軟件進行了分析。實驗重復三次。

1.5 實時熒光定量PCR

處于生長對數期P53基因敲除細胞及P54、TSC2基因敲除細胞接種于6孔板中，12小時后分別加入終濃度為10nM及20nMRapamycine繼續培養48小時后收集用胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞去除上清后加入TRIzol RNA 提取試劑盒提取RNA，Thermo 逆轉錄試劑盒反轉得到cDNA，使用TakaraSYBRGreen試劑盒實時定量PCR檢測，實驗重復三次。引物信息mouse Glut1 forward：CAGTTCGGCTATAACACTGGTG；Mouse Glut1 reverse：GCCCCCGACAGAGAAGATG；mouse Glut2 forward：TCAGAAGACAAGATCACCGGA；Mouse Glut2 reverse：GCTGGTGTGACTGTAAGTGGG；Mouse Glut3 forward：TGGTAGCTCAGATCTTTGGTTTGG；Mouse Glut3 reverse：GATCTCTGTAGCTTGGTCTTCCTC

1.6 裸鼠成瘤實驗

為了測試維生素C的效果，將200萬個p53和TSC2敲除細胞皮下注射到6至8周齡雌性裸鼠腋下皮膚。7-10天后，將腫瘤體積為40-60mm3的小鼠隨機分為兩組。一組接受新鮮制備的維生素C(400微升PBS中的抗壞血酸鈉，每千克體重4克)腹腔注射，每天1次。對照組小鼠用PBS代替維生素C，劑量表相同。用電子卡尺每4天測量腫瘤大小，并以非盲方式使用公式計算體積：(L×W2)×0.5，其中L為長度，W為寬度。連續注射16天后麻醉小鼠，取出皮下腫瘤組織。實驗重復了兩次。所有小鼠實驗均通過三峽大學醫學院倫理委員會審批并按照相關規定執行。

1.7 統計方法

應用SPSS 18.0統計軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)分析。計量資料采用平均數±標準差(±s)表示。多因素比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 維生素C選擇性殺傷TSC2基因缺失細胞抑制其增殖

為研究維生素C對TSC基因敲除細胞是否具有選擇性抑制作用，我們使用C57小鼠獲得成纖維細胞(MEFs細胞)，通過基因敲除方法獲得P53基因敲除細胞(p53-/-)使之能夠無限增殖，實驗組則分別敲除p53基因和TSC2基因(p53-/-,TSC2-/-)。兩組細胞分別用不同濃度梯度維生素 C處理不同時間，通過MTT方法檢測細胞存活率，結果發現600uM和800uM濃度維生素 C在12-36小時均可顯著抑制p53-/-,TSC2-/-MEFs細胞的增殖，且呈時間依賴性，而上述濃度對p53-/-基因缺失MEF細胞無明顯抑制作用(圖1-A、B、C)。同時我們在另外一組TSC2基因缺失細胞及TSC2基因敲入細胞系(323T2及323V)中獲得相同實驗結果，323T2為對照組細胞，323V細胞為TSC2基因缺失細胞(見圖1-D)。以上結果說明維生素 C能夠選擇性抑制TSC2基因缺失細胞的增殖。

圖1 維生素 C選擇性抑制TSC2基因敲除細胞增殖

2.2 mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素能夠挽救維生素C選擇性抑制細胞增殖作用

生理狀態下TSC1和TSC2作為蛋白質復合體，負性調節雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的功能。mTOR作為一個細胞內承上啟下的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶樞紐，主要通過整合生長因子和營養信號來調控細胞生長、增殖、分化和代謝等多種重要生物學過程，然而TSC1和TSC2的突變導致mTOR通路的過度活化，引起細胞的異常增殖，引發TSC病變，現有研究已證實mTOR特異性抑制劑雷帕霉素(rapamycin)及其衍生物可拮抗過度活化的mTOR，現已在臨床及基礎實驗中廣泛被運用。為進一步研究維生素C選擇性抑制TSC2-/-基因敲除細胞是否通過調控mTOR信號通路來實現，我們進行了挽救實驗。首先我們在p53-/-及p53-/-,TSC2-/-細胞中用雷帕霉素(終濃度為10nmM)處理24小時后于兩組細胞中分別加入不同濃度維生素C(終濃度為200uM-1mM)處理24小時，而后通過MTT檢測細胞增殖情況，結果發現10nM雷帕霉素對無維生素C處理兩組細胞增殖無明顯作用，而對600uM、800uM及1mM作用TSC2敲除細胞有挽救作用(圖2)，因此說明維生素C的選擇性抑制細胞增殖作用依賴于mTOR信號通路。

圖2 mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素能夠挽救維生素C選擇性抑制細胞增殖作用

2.3 維生素C選擇性增加TSC2敲除細胞內活性氧(ROS)

最新研究發現維生素 C可選擇性抑制KRAS和BRAF突變的結直腸癌細胞，其主要機制是因KRAS和BRAF突變能夠顯著增加結直腸癌細胞表面的葡萄糖轉運蛋白(GLUTs)，使進入細胞中DHA增多，增多的DHA在細胞內還原為維生素 C的過程中產生大量活性氧(ROS)，從而導致細胞死亡，為進一步研究維生素 C選擇性抑制TSC2-/-細胞增殖機制，我們首先檢測了對照組細胞和TSC2-/-細胞中GLUTs的表達水平，結果發現細胞中TSC2基因缺失細胞中GLUT1轉錄水平明顯升高，而GLUT3轉錄水平無明顯區別。為進一步證實GLUT1轉錄水平升高是TSC2基因缺失導致mTOR細胞通路激活所致，我們使用雷帕霉素處理細胞后再次檢測GLUT1轉錄水平，發現雷帕霉素可抑制TSC2基因缺失所致GLUT1轉錄水平升高(圖3-A)。以上結果說明TSC2基因缺失導致mTOR通路激活可導致Glut1表達水平增高。已有研究表明Glut1水平增高，可導致維生素處理細胞內活性氧增加而導致細胞死亡，因此我們進一步通過DCFH-DA染色、流式細胞儀檢測方法測定維生素C處理細胞內ROS水平，結果發現維生素 C可顯著增加TSC2缺失細胞中ROS水平，而對無TSC2基因缺失細胞無明顯作用(圖3-B)，以上結果說明TSC2基因缺失導致mTOR信號通路激活，使得Glut1表達水平增加，進一步導致維生素處理后細胞內ROS增加而殺傷細胞。

圖3 維生素C選擇性增加TSC2敲除細胞內活性氧(ROS)

2.4 維生素 C無法抑制TSC2基因缺失細胞在體內的生長

為進一步在體外水平研究維生素 C對腫瘤生長的影響，我們將TSC2基因敲除細胞種植于裸鼠皮下，待腫瘤形成后測量腫瘤體積，隨機分為實驗組和對照組，實驗組腹腔注射大劑量維生素C(4g/kg/day)，對照組注射等量生理鹽水，每天測量腫瘤體積并記錄(圖4-A)，連續注射16天后處死小鼠，獲得腫瘤標本稱重比較(圖4-B、C)，結果發現大劑量維生素C未能抑制腫瘤生長，腫瘤體積及重量與對照組細胞相比差異無統計學意義。

圖4 維生素 C無法抑制TSC2基因缺失細胞在體內的生長

3 討論

結節性硬化癥是一種TSC基因突變導致、多系統累積的臨床綜合癥，目前主要治療方法為使用mTOR通路抑制劑及對癥支持治療，但mTOR通路抑制劑價格昂貴、需要終身治療，因其僅能抑制細胞增殖而不能殺傷細胞，因此一旦停藥相關因細胞增殖引起的臨床綜合癥會復發，且存在免疫抑制相關副作用[3]，我們的體外研究發現維生素C能夠選擇性殺傷TSC2基因缺失細胞，抑制其增殖，更重要的是維生素C獲取途徑簡單、價格低廉，這一發現有望為結節性硬化的治療提供新的思路。

2015年Yun J 等人研究發現大劑量維生素C能夠選擇性抑制KRAS和BRAF突變的結直腸癌細胞，其主要機制是因KRAS和BRAF突變能夠顯著增加結直腸癌細胞表面的葡萄糖轉運蛋白(GLUTs)，使進入細胞中DHA增多，增多的DHA在細胞內還原為維生素 C的過程中產生大量活性氧(ROS)，從而導致細胞死亡[20]。同時有研究表明，TSC2基因缺失導致的mTOR通路激活可促進Gluts的表達[21]，因此在上述研究基礎上，我們進一步通過細胞實驗驗證了mTOR通路激活可導致Glut1轉路增加，且使用mTOR通路抑制劑Rapamycin可抑制TSC2缺失導致的Glut1表達增加，這一結果說明Glut1激活表達依賴于mTOR通路的激活，有研究表明mTOR通路激活可通過IKK/NFκB信號通路激活Gluts的表達[21]，因多種腫瘤中均可見mTOR通路的異常激活，因此這一現象已在乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤中被證實[22,23]。為進一步證明維生素C是通過激活的mTOR信號通路而發揮選擇性殺傷作用，我們使用mTOR通路抑制劑Rapamycine預先處理TSC2缺失細胞24小時，而后再次給予不同濃度維生素C發現，維生素C選擇性殺傷作用消失，這更進一步說明維生素C的選擇性殺傷作用依賴于mTOR通路的激活，同時這也提示使用mTOR抑制劑聯合維生素C治療可能不是一個合理的選擇。為進一步探討其選擇性殺傷TSC基因缺失細胞機制，我們結合Yun J等人的研究，運用熒光標記及流式細胞檢測方法測定了實驗組細胞與對照組維生素C處理細胞中活性氧，發現維生素C處理TSC2基因缺失細胞中ROS增加，而對照組細胞中無明顯改變，這一結果與Yun J研究結果一致[20]，因此我們推測維生素C也可能通過高表達的葡萄糖轉運蛋白進入細胞而殺傷TSC突變細胞，其具體調控機制有待進一步研究。為研究其在體治療作用，我們通過裸鼠成瘤實驗發現大劑量維生素C連續皮下注射2周與對照組細胞相比，TSC2基因缺失細胞腫瘤生長有抑制作用，但統計學無差異。分析可能存在以下原因，一是使用樣本量較小，雖然有抑制趨勢，但較難獲得統計學差異；二是維生素C使用劑量不足，維生素C半衰期為2小時[16,17]，我們采用每日1次腹腔注射方法可能無法達到抑制腫瘤生長效果。后期可增加樣本量，測定小鼠維生素C代謝時間重新確定注射劑量。如有條件可使用TSC2缺失轉基因小鼠進一步驗證上述結果。

3 結論

大劑量維生素C可選擇性殺傷TSC2基因突變細胞、抑制其增殖，其可能通過TSC2突變細胞高表達的Gluts進入細胞而導致ROS增多而殺傷細胞，這一發現有可能為結節性硬化癥及mTOR通路激活腫瘤的治療提供新的思路及方法。