厚游仆蟲(Euplotes crassus)對有毒赤潮藻的清除效應研究

閆昊, 林玉雲, 王路

厚游仆蟲()對有毒赤潮藻的清除效應研究

閆昊, 林玉雲, 王路*

閩江學院地理與海洋學院, 福州 350108

原生動物是水生食物網中主要的植食性生物, 在自然水體中能夠有效控制浮游植物的生物量, 具有預防及延緩赤潮發生的潛在應用價值。在福建沿岸分離篩選出一種常見的原生動物—厚游仆蟲(), 通過研究其對三種常見有毒赤潮藻類的毒素耐受性、抑藻率及自身在赤潮壓力下的生長速率, 評測厚游仆蟲對常見有毒赤潮藻類的抑制作用, 挖掘其作為控藻生物的應用潛力。將厚游仆蟲分別接種于不同濃度的劇毒卡爾藻()、赤潮異彎藻()及米氏凱倫藻()中, 在溫度20 ℃、光照度100 μmol·M–2·s–1和光暗比12 h: 12 h 的條件下進行共培養。結果顯示, 厚游仆蟲對劇毒卡爾藻和赤潮異彎藻具有明顯的抑制作用, 持續抑藻時間可達72 h以上, 且未見藻細胞數量的明顯反彈, 而對于米氏凱倫藻則沒有明顯的抑制能力。說明厚游仆蟲在一定條件下可作為一種有效可行的控藻生物, 但其對赤潮藻類的抑制作用具有一定的種類特異性。結果證明, 在赤潮形成初期厚游仆蟲對赤潮藻類的攝食壓力可能有助于抑制或延緩劇毒卡爾藻及赤潮異彎藻赤潮的發生與發展, 其在赤潮治理中的實際應用還需結合野外水體做進一步研究。

原生動物; 厚游仆蟲; 有害赤潮; 攝食; 抑制

0 前言

赤潮是一種嚴重的全球性海洋自然災害,已經引起世界各地的高度關注。近年來, 我國近海海域污染加劇, 局部海域富營養化問題突出, 赤潮爆發日益頻繁, 給近岸水域帶來了嚴重的生態、資源和環境問題, 并造成巨大的經濟損失, 是濱海生態安全和沿海經濟可持續發展的重大威脅。福建省由于其特殊的環境與氣候特征一直是全國赤潮災害多發省份之一[1], 其省會福州市更是赤潮災害高發區, 2011—2016年赤潮災害發生數累計達11起, 高居全省首位[2]。2019年5月下旬, 福建平潭養殖區爆發了以卡爾藻(sp)為優勢種的有毒有害赤潮, 密度約106個·L–1,并伴有東海原甲藻()、赤潮異彎藻()、米氏凱倫藻()、斯克里普藻(sp.)、血紅哈卡()等其他赤潮種類, 最大影響面積約3.5平方公里, 引發養殖區及周邊海域真鯛、花尾胡椒鯛等養殖魚類大量死亡, 造成極大經濟損失[3]。因此, 對赤潮藻類以及新型赤潮調控方法的研究在赤潮預警及治理等方面具有重要意義。

隨著世界沿海范圍內赤潮問題的日益嚴峻, 如何治理赤潮, 降低其對海洋環境、水產養殖業及人類健康的危害, 已成為人們普遍關注的一個大問題[2]。當前對于赤潮治理的方法主要分為物理法、化學法及生物法[4], 物理及化學方法無法從根本上治理赤潮, 且極有可能對其他生物造成負面影響, 對海洋環境也存在破壞作用[5]。在利用物理、化學方法不甚理想的情況下, 越來越多的研究者將目光投向了生物防治技術。生物法被認為是一種最有發展前途且對環境無二次污染的方法, 也是目前研究最為熱門的一種赤潮治理方法[6]。浮游動物對浮游植物的攝食是引起浮游植物生物量減少的主要原因之一[7-8], 自然水體中微型浮游動物相對于大型浮游動物的生物量更高, 且極高的生長速率伴隨著其對浮游植物的高消耗[9]。以往研究顯示, 赤潮期間原生動物能夠通過攝食來有效地控制赤潮藻類的生物量, 并保持最優的生長與繁殖速率[10-12]。例如, 某些纖毛蟲對不同赤潮藻類具有較強的攝食能力, 包括抑食金球藻()、亞歷山大藻(sp.)、微小原甲藻()等[13-15]。因此, 在自然海區中原生動物的存在能夠有效控制或延緩赤潮的發生[16],被認為是一種很有實用前景的控藻因子[17]。

本研究在福建沿岸分離了不同種類的原生動物, 并篩選得到具有一定抑藻能力的原生動物—厚游仆蟲(), 研究其對不同有毒赤潮藻—劇毒卡爾藻()、赤潮異彎藻()和米氏凱倫藻()的毒素耐受性與攝食情況, 并比較不同藻細胞濃度下厚游仆蟲的生長速率和抑藻率, 旨在厘清厚游仆蟲對常見有毒赤潮藻類的抑制作用, 挖掘其作為控藻生物的應用潛力。

1 實驗材料與方法

1.1 藻類培養

實驗采用的藻類為常見有毒赤潮藻—劇毒卡爾藻()、赤潮異彎藻()和米氏凱倫藻(), 藻種由廈門大學海洋藻類保種中心提供。上述三種藻類均培養于人工海水中, 人工海水由紅海鹽(Red Sea, Israeli)和純水配制而成, 鹽度調至30 ppt, 經高壓滅菌后添加L1培養液培養, 培養溫度為20 ℃, 光照強度為100μmol·m–2·s–1, 光暗比12 h:12 h。

1.2 抑藻原生動物的篩選、鑒定與培養

在福建沿岸的福州、廈門、連江及平潭等地采集表層海水, 將海水中形態不同的單個原生動物個體放入24孔板中, 孔板中提前放入過濾后的滅菌海水及滅菌的大米或蝦飼料, 于20 ℃培養箱擴大培養后命名為不同的株系, 并進行分子鑒定以確定其物種。將培養后的不同種類原生動物放入劇毒卡爾藻液中進行20℃共培養, 3—4天后選取數量明顯增多的原生動物種類。將選取的抑藻效果最佳的原生動物進行純培養, 喂食一定大米或蝦飼料, 培養溫度為20 ℃, 光暗比12 h:12 h。

顯微鏡下挑取抑藻效果最佳的原生動物, 使用CTAB法進行DNA的提取與PCR擴增, 擴增產物為核糖體小亞基(SSU)全長片段。利用基因數據庫(NCBI GenBank)提供的BLAST分析, 將測序結果進行序列比對, 得到與已知rDNA相似性最高的基因序列編號為LT628500, 該序列對應的物種名稱為厚游仆蟲(), 序列相似度為99.94%。

1.3 熒光顯微鏡觀察

赤潮甲藻細胞內含有大量葉綠素, 在紫外光激發下可以發射出紅色熒光, 藻細胞被吞食進入食物泡后, 仍可以發出熒光。根據食物泡的大小和熒光強弱可以研究藻細胞物質在原生動物體內的消化情況。厚游仆蟲與不同種類的赤潮藻共培養24—48 h后, 將厚游仆蟲用甲醛固定, 固定后甲醛終濃度為2%, 在熒光顯微鏡(ZEISS Axioscope 5)下進行拍照記錄。

1.4 生長與攝食實驗

將處于指數生長期的厚游仆蟲移至裝有無菌海水的培養皿中進行饑餓處理。24 h后在顯微鏡下置于24孔板中備用, 每孔放10只。將處于指數生長期的劇毒卡爾藻、赤潮異彎藻的初始濃度分別調至5000 個·mL–1、10000 個·mL–1、15000 個·mL–1, 米氏凱倫藻液初始濃度調至2000 個·mL–1、5000 個·mL–1、10000個·mL–1, 并將調整后不同濃度的劇毒卡爾藻、赤潮異彎藻和米氏凱倫藻液轉移至24孔培養板中, 與厚游仆蟲共培養, 每種濃度的處理組包含18個生物學重復, 另設僅含藻液和僅含厚游仆蟲的空白對照。將24孔板置于20 ℃光照培養箱中, 光照強度100μmol·m–2·s–1, 光暗周期12 h:12 h的條件下孵育72 h。每隔12 h在顯微鏡下對不同處理組的原生動物進行活體計數, 并取不同處理組的三個生物學重復進行藻細胞的固定與計數, 藻細胞計數后的生物學重復樣品廢棄。

2 結果與分析

2.1 厚游仆蟲對不同濃度劇毒卡爾藻的毒素耐受性

將濃度為5000 個·mL–1、10000 個·mL–1、15000 個·mL–1的劇毒卡爾藻, 分別與相同數量的厚游仆蟲(10 個·孔–1)進行共培養。設置空白對照, 對照組為相同數量的游仆蟲以及不含有藻液的滅菌人工海水。在12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h進行顯微鏡觀察, 對不同處理組中的生物學重復樣品進行原生動物及藻細胞計數。其結果見圖1和圖2。從圖1可知, 劇毒卡爾藻密度為5000 個·mL–1、10000 個·mL–1、15000 個·mL–1時, 厚游仆蟲個體數均明顯增加, 由原來的10 個·well–1長至約120 個·well–1, 增長倍數達10—12倍。說明厚游仆蟲對劇毒卡爾藻的毒素耐受性強, 當卡爾藻密度高達15000 個·mL–1時, 厚游仆蟲的個體數依然增加明顯。此外, 在不含有藻液的空白對照組中, 厚游仆蟲仍少量增加, 可能由于實驗過程中無法完全去除和隔離細菌, 使得殘余在水體中的微量細菌逐漸增多并成為厚游仆蟲的食物。

從圖2可知, 厚游仆蟲從24 h處開始出現明顯增長, 且在藻濃度10000 個·mL–1的條件下, 厚游仆蟲增長率最明顯。說明厚游仆蟲對劇毒卡爾藻的毒素耐受性強, 當卡爾藻密度高達10000 個·mL–1時, 在共培養48 h后, 厚游仆蟲的個體數依然增加明顯。培養時間高達72 h時, 厚游仆蟲在不同藻濃度下的個體數依然增加明顯, 而生長速率略微下降。

2.2 厚游仆蟲對不同濃度劇毒卡爾藻的抑制率

將濃度為5000 個·mL–1(圖3a)、10000 個·mL–1(圖3b)、15000 個·mL–1(圖3c)的劇毒卡爾藻, 分別與相同數量的厚游仆蟲(10 個·孔–1)進行共培養, 培養條件同上。在12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的不同時間段, 進行藻細胞計數, 并進一步計算藻細胞損失率, 其結果見圖3和圖4。從圖3可以看出, 與厚游仆蟲共培養后的藻細胞密度與對照組相比, 均出現了不同程度地降低。圖4顯示, 12h開始厚游仆蟲對不同濃度的藻細胞出現了明顯的抑制作用, 但抑制程度各不相同。在48 h之前, 厚游仆蟲對10000 個·mL–1濃度下的抑制效果較顯著; 在48 h之后, 厚游仆蟲對5000 個·mL–1濃度下的抑制效果較顯著。

2.3 厚游仆蟲體內被攝食的劇毒卡爾藻的自發熒光信號

將厚游仆蟲與劇毒卡爾藻以1:1500、1:3000、1:4500細胞個數比共培養, 20 ℃恒溫培養12—24 h后, 使用甲醛溶液對厚游仆蟲進行固定。使用熒光顯微鏡觀察厚游仆蟲體內的自發熒光, 熒光通道為PE通道。1:1500細胞個數比的結果見圖5, 分別顯示存在藻液(a和b)和不存在藻液(c和d)情況下, 厚游仆蟲體內的藻類自發熒光情況。

圖1 不同劇毒卡爾藻濃度下厚游仆蟲的數量變化

Figure 1 Changes in cell number ofunder different concentration of

圖2 不同劇毒卡爾藻濃度下厚游仆蟲的增長率

Figure 2 The growth rate ofincubated withat different concentrations

Figure 3 The effect ofonat different concentrations

圖4 厚游仆蟲對不同濃度劇毒卡爾藻的抑制率

Figure 4 The inhibition rate ofonat different concentrations.

圖5 厚游仆蟲對劇毒卡爾藻的攝食

Figure 5 Ingestion ofby

由圖5可知, 置于人工海水中的厚游仆蟲體內, 未顯示藻類自發熒光信號(圖5b), 而置于藻液中的厚游仆蟲體內, 顯示較強的藻類自發熒光信號(圖5d), 說明厚游仆蟲能夠攝食劇毒卡爾藻并進行消化。

2.4 厚游仆蟲對其他常見赤潮藻的抑制作用

將厚游仆蟲(10 個·孔–1)分別接種于對數生長期的赤潮異彎藻液(3 mL)中, 藻濃度分別為5000 個·mL–1、10000 個·mL–1、15000 個·mL–1, 在12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的不同時間段, 對厚游仆蟲進行活體計數。結果如圖6所示, 不同赤潮異彎藻濃度下, 厚游仆蟲個體數與對照組相比均出現了明顯增加。由此可見, 厚游仆蟲對另一種常見赤潮藻--赤潮異彎藻具有一定的抑制作用。

將厚游仆蟲(10 個·孔–1)分別接種于對數生長期的米氏凱倫藻藻液中, 藻濃度分別為2000 個·mL–1、5000 個·mL–1、10000 個·mL–1, 在不同時間段對厚游仆蟲進行細胞計數。結果如圖7所示, 不同米氏凱倫藻濃度下, 厚游仆蟲個體數與對照組相比均明顯減少。由此可見, 厚游仆蟲對有毒赤潮藻—米氏凱倫藻無明顯的抑制作用。

3 討論

在研究自然水體原生動物的食藻過程中, 有很多關于原生動物大量繁殖導致赤潮消退的報道[18-19], 但人為利用原生動物成功控制赤潮的研究大都處在嘗試階段[20-21]。本文對分離獲得的原生動物—厚游仆蟲進行了一系列的控藻實驗。結果發現, 厚游仆蟲具有較強的毒素耐受性, 在實驗室條件下能夠攝食劇毒卡爾藻和赤潮異彎藻, 對這兩種藻類均具有明顯的抑制作用, 而對于米氏凱倫藻則沒有抑制能力。說明厚游仆蟲對赤潮藻類的抑制作用具有一定的種類特異性, 可能由于不同藻種的毒性、適口性、營養含量有所差異, 捕食者對不同藻類的濾食率也參差不齊[22]。但此種特異性在赤潮期間可能會改變藻類的種群結構及群落的演替方向[23]。

圖6 不同赤潮異灣藻濃度下厚游仆蟲的數量變化

Figure 6 Changes in cell number of, incubated withat different concentrations

圖7 不同米氏凱倫藻濃度下厚游仆蟲的數量變化

Figure 7 Changes in cell number of, incubated withat different concentrations

本研究中的厚游仆蟲具有生長速率快、適應性強、捕食量大等特點, 在短時間內可以大量攝取不同的赤潮藻類, 說明其具有預防及控制赤潮發生的潛在應用價值, 可能成為一種新型高效環保的控藻生物。然而, 盡管浮游動物攝食在赤潮生消過程中起相當重要的作用, 但環境水體的多變性、攝食過程的復雜性和生物物種與個體行為存在的多樣性, 使得這一赤潮調控方法在野外環境中的應用具有相當難度[16]。例如, 天然水體環境和實驗室培養條件之間的差異, 使得原生動物的數量相對藻類生物量無法達到一定優勢, 會嚴重影響實際的控藻效果[24], 此外, 野外環境水體中常伴隨混合種赤潮或種群演替現象, 針對于某種赤潮藻類的調控方法無法抑制赤潮期的總生物量。因此, 若投入實際應用還需結合野外水體做進一步研究, 不僅要通過篩選、訓化與改造來提高原生動物的攝食、消化和生長速率, 還要考慮投放時間、投放量等問題。綜上所述, 利用原生動物控制赤潮是一種全新的思路, 但目前有很多實際應用問題亟待進一步解決。

[1] 李雪丁. 福建沿海近10a赤潮基本特征分析[J]. 環境科學, 2012, 33(7): 2210–2216.

[2] 謝欣, 陶愛峰, 張堯, 等.福建省典型海洋災害時空分布特性研究[J]. 海洋湖沼通報, 2018, (4): 21–30.

[3] 福建省海洋與漁業局. 福建省赤潮災害信息(2019年第023期)[EB/OL]. 2019-05-29. http://hyyyj.fujian.gov.cn/ xxgk/tzgg/201905/t20190529_4888810.htm.

[4] GALLARDORODRIGUEZ J J, ASTUYAVILLALON A, LLANOSRIVERA A, et al. A critical review on control methods for harmful algal blooms[J]. Reviews in Aquaculture, 2019, 11(3): 661–684.

[5] 孫曉霞, 張波, 俞志明. 赤潮防治劑對中國對蝦的毒性研究[J]. 海洋環境科學, 2000, 19(4): 6–8.

[6] 伍嘉慧. 深圳海域赤潮水樣溶藻菌的分離鑒定及Arenibacter sp.6A1溶藻活性物質的研究[D]. 深圳大學, 2018.

[7] MCMANUS G B, EDERINGTONCANTRELL M C. Phytoplankton pigments and growth rates, and microzooplankton grazing in a large temperate estuary[J]. Marine Ecology Progress Series, 1992, 87(1): 77–85.

[8] BRETELER W C, SCHOGT N, BAAS M, et al. Trophic upgrading of food quality by protozoans enhancing copepod growth: role of essential lipids[J]. Marine Biology, 1999, 135(1): 191–198.

[9] STROM S L, MORELLO T A. Comparative growth rates and yields of ciliates and heterotrophic dinoflagellates[J]. Journal of Plankton Research, 1998, 20(3): 571–584.

[10] JEONG H J, LATZ M I. Growth and grazing rates of the heterotrophic dinoflagellatesspp. on red tide dinoflagellates[J]. Marine Ecology Progress Series, 1994,106(1-2) : 173–185.

[11] KAMIYAMA T. Growth and grazing responses of tintinnid ciliates feeding on the toxic dinoflagellate[J]. Marine Biology, 1997, 128(3): 509–515.

[12] JEONG H J, SHIM J H, LEE C W, et al. Growth and Grazing Rates of the Marine Planktonic Ciliatesp. on Red-Tide and Toxic Dinoflagellates[J]. Journal of Eukaryotic Microbiology, 1999, 46(1): 69–76.

[13] 陳瑤, 楊茜露, 何學佳. 三種常見原生動物對褐潮藻種抑食金球藻()的攝食[J]. 熱帶海洋學報, 2018, 37(6): 120–132.

[14] COLIN S P, DAM H G. Latitudinal differentiation in the effects of the toxic dinoflagellatespp. on the feeding and reproduction of populations of the copepod Acartia hudsonica[J]. Harmful Algae, 2002, 1(1): 113–125.

[15] KAZMI S S U H,Xu Guangjian, Tang Xuexi, et al. Insights into identifying the effect of harmful algae on ecological quality status using periphytic ciliates in marine ecosystems[J]. Ecological Indicators, 2020, 117, doi:10.1016/j.ecolind.2020.106581.

[16] 孫軍, 劉東艷, 王宗靈, 等. 浮游動物攝食在赤潮生消過程中的作用[J]. 生態學報, 2004, 24(7): 1514–1522.

[17] 黃姿, 朱白婢, 孫建波, 等. 赤潮的生物防治及其研究進展[J]. 安徽農學通報, 2008, 14(15): 82–84

[18] TURNER J T, ANDERSON D M. Zooplankton grazing during dinoflagellate blooms in a Cape Cod embayment with observations of predation upon tintinnids by copepods[J]. Marine Ecology,1983, 4(4): 359–374.

[19] CANTER H M, HEANEY S I, LUND J W, et al. The Ecological Significance of Grazing on Planktonic Populations of Cyanobacteria by the Ciliate Nassula[J]. New Phytologist, 1990,114(2): 247–263.

[20] 劉光濤. 銅綠微囊藻群體誘導研究[D]. 南京: 南京大學, 2012.

[21] 黃東旭, 張永康, 王潔煒. 噬藻原生動物的分離及噬藻性能的研究[J]. 遼寧化工, 2019, 48(7): 628–631.

[22] 姜小玉, 楊佩昀, 王潔玉, 等. 大型溞和金魚藻對三種微藻增殖的影響[J]. 淡水漁業, 2018, 48(4): 106–112.

[23] 陳莉婷, 左俊, 陶思依, 等. 利用微生物控制藍藻研究進展[J]. 武漢大學學報(理學版), 2019, 65(4): 401–410.

[24] 劉新堯, 石苗, 廖永紅, 等. 食藻原生動物及其在治理藍藻水華中的應用前景[J]. 水生生物學報, 2005(4): 456– 461.

The effect ofon the removal of toxic red tide algae

YAN Hao, LIN Yuyun, WANG Lu

Oceanography Institute of Minjiang University, Fuzhou350108, China

Protozoa are considered as major herbivores in marine food webs, which can effectively control the biomass of phytoplankton and have the potential application for controlling harmful algal blooms. A common protozoan,, was collected from the coast of Fujian province. The toxin tolerance, growth rate and the algal inhibition ofto three toxic harmful algae were studied. We evaluated the inhibitory effect ofon common harmful algae and explored its possibility as an algae control organism. In short-term experiments,was incubated with,andat different concentrations, under 25 ℃, illumination of 100 μmol·M–2·s–1and light dark ratio of 12 h:12 h. The results showed thathad a significant inhibitory effect onand. The duration of the growth inhibition could exceed 72 hours, and there was no significant recovery in the number of algae cells. However, its inhibitory effect onwas not obvious. The study results indicated thatcan be an effective algae suppressor under certain conditions, but its inhibitory effect on harmful algae showed species specificity. The feeding pressure of themay help to inhibit or delay the occurrence and development of harmful algae blooms, especially in the early stage ofandblooms. The practical application of red tide control by protozoa needs to be further studied in field water.

Protozoa;; Harmful algal blooms; grazing; suppression

10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.04.011

P76

A

1008-8873(2022)04-084-08

2020-08-11;

2020-09-24

福建省中青年教師教育科研項目(JT180386); 中國大洋協會“深海生物資源計劃”項目“深海大洋原生生物種質資源庫構建及應用潛力評價”(DY135-B2-13)；自然資源部東南生態脆弱區監測修復工程技術創新中心自主研究課題(KY-090000-04-2021-002)

閆昊(1999—), 男, 河南許昌人, 本科生在讀, 主要從事環境資源多樣性, E-mail: yanhao@stu.mju.edu.cn

通信作者:王路, 女, 博士, 副教授, 主要從事浮游植物分子生態學, E-mail: 607wanglu@mju.edu.cn

閆昊, 林玉雲, 王路. 厚游仆蟲()對有毒赤潮藻的清除效應研究[J]. 生態科學, 2022, 41(4): 84–91.

YAN Hao, LIN Yuyun, WANG Lu. The effect ofon the removal of toxic red tide algae[J]. Ecological Science, 2022, 41(4): 84–91.