三種微藻的生物量與其細胞氮磷碳的相互關系

曹煜成, 孫志偉, 徐煜, 胡曉娟,2, 蘇浩昌,2, 徐武杰,2, 文國樑,*, 魯敏,余招龍

三種微藻的生物量與其細胞氮磷碳的相互關系

曹煜成1,2,3, 孫志偉1, 徐煜1,2,3, 胡曉娟1,2, 蘇浩昌1,2, 徐武杰1,2, 文國樑1,*, 魯敏1,余招龍3,4

1. 中國水產科學研究院南海水產研究所/農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室/廣東省漁業生態環境重點實驗室, 廣州 510300 2. 中國水產科學研究院南海水產研究所深圳試驗基地, 廣東 深圳 518121 3. 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心, 廣東 茂名 525400 4. 廣東冠利達海洋生物有限責任公司, 廣東 茂名 525400

為明確鈍頂螺旋藻 () 、綠色顫藻 ()、牟氏角毛藻 ()等三種池塘水體環境中常見優勢微藻的細胞數量與其所含總氮(total nitrogen, TN)、總磷(total phosphorus, TP)和總碳(total carbon, TC)質量之間的數量關系, 對以上微藻分別進行純培養, 在明確微藻細胞數量的條件下, 將藻細胞冷凍干燥制備為凍干粉, 準確測定其干重(cell dry weight, CDW), 以及所含TN、TP和TC的質量, 并就CDW與其所含TN、TP、TC質量間的數量關系, 以及細胞數量與CDW的相互關系等建立數學方程。以上三種微藻的CDW與其所含TN、TP、TC的質量間均存在顯著的線性正相關關系(<0.05), 其中在與TN、TP關系的數學回歸方程中線性擬合程度優于TC; 同時, 三種微藻的細胞數量與CDW之間同樣呈顯著的線性正相關關系(<0.05)。其中鈍頂螺旋藻細胞中的TN、TC、TP含量占其CDW的比值分別為29.3%、13.6%和4.4%, 均遠高于綠色顫藻和牟氏角毛藻。

鈍頂螺旋藻; 牟氏角毛藻; 綠色顫藻; 總氮; 總磷; 總碳

0 前言

微藻在水生態系統中扮演生產者的角色, 它對促進池塘水體環境中的物質循環, 通過光合作用為水體提供持續的溶解氧供給, 維系生態系統的健康運轉等具有極其重要的意義。有研究顯示, 顫藻、角毛藻、螺旋藻等多為水產養殖池塘常見的微藻優勢種群[1–2], 對水體微藻群落的組成及其生態功能具有重要影響。有學者指出在水體中培育以有益硅藻或綠藻為優勢的浮游微藻群落, 不僅有利于促進養殖對蝦的健康生長和獲得良好的生產效益, 還可有效降低水體中的氮磷營養鹽的含量, 避免氨氮、亞硝酸鹽等有毒有害物質對養殖動物的脅迫影響[3]。在水環境凈化工程技術領域, 螺旋藻和小球藻等有益微藻也常被用于水質的凈化處理, 均取得了良好的效果, 然而此前大多數的研究主要聚焦于微藻對水體中氮磷營養鹽的凈化效果分析[4], 而關于微藻對水中碳元素的作用效應研究則相對較少[5–6], 并且在評估微藻的氮磷凈化效果時, 大多數學者主要是通過測定水體中特定化學形式的氮磷營養鹽含量的變化量來評定其凈化效率[7–8], 而從微藻細胞組成成分的角度對其吸收氮、磷、碳的定量分析研究也相對少見。該研究選擇了三種池塘水體環境中常見的微藻優勢種群, 其中包括藍藻門(Cyanophyta)的鈍頂螺旋藻()SP1、綠色顫藻 () OC1, 硅藻門(Bacillariophyta)的牟氏角毛藻()CM1等, 收集它們的純培養藻液, 測定微藻細胞數量, 并將藻細胞冷凍干燥制備為凍干粉, 準確測定其干重(cell dry weight, CDW), 以及所含總氮(total nitrogen, TN)、總磷(total phosphorus, TP)和總碳(total organic carbon, TC)的質量。就藻細胞CDW值與其所含TN、TP、TC質量間的數量關系, 以及細胞數量與CDW值的相互關系等建立數學方程, 進而說明隨著藻細胞的增殖它們可從外界環境中吸收碳氮磷營養元素的絕對質量關系。通過構建“氮磷碳質量——藻細胞干重——活藻細胞數量”的關系方程, 還可為后續進一步研究測算將以上3種微藻規模化培養用以吸收利用環境碳氮磷營養的效果提供基礎參考。

1 材料和方法

1.1 藻種與培養基

鈍頂螺旋藻SP1、綠色顫藻OC1、牟氏角毛藻CM1均分離自對蝦養殖池塘水體環境, 由中國水產科學研究院南海水產研究所農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室提供。鈍頂螺旋藻SP1參考Zarrouk培養基配方配制[9–11], 綠色顫藻OC1和牟氏角毛藻CM1分別采用BG11培養基[12]和f/2培養基[13]。

1.2 微藻的培養與收集處理

1.2.1 微藻的培養

鈍頂螺旋藻SP1、綠色顫藻OC1、牟氏角毛藻CM1分別以106個·mL-1、106個·mL-1、104個·mL-1的初始接種密度將藻種液接至容量為3L的錐形瓶中, 每組4個平行, 培養瓶置于恒溫光照培養箱(Mgc800H, 上海一恒)中進行培養, 培養液鹽度20, 培養溫度(25±1)℃, 光照強度2500—3000 lx, 光暗比12 h : 12 h, 每日搖動藻液培養瓶3次, 避免藻細胞貼壁生長[14]。

1.2.2 藻液的收集與處理

收集的鈍頂螺旋藻SP1和綠色顫藻OC1藻液, 取20 mL藻液用于藻細胞密度測定, 檢測前利用超聲波細胞粉碎機(JY92-IIDN, 寧波新芝)進行處理, 在不影響藻細胞形態完整的條件下將藍藻細胞團塊破碎為大量易于計數的短桿狀藻細胞群體, 角毛藻CM1藻液則無需超聲波處理。利用光學生物顯微鏡(BX43, Olympus)和血球計數板對不同藻液中的藻細胞進行準確計數。

根據不同微藻的細胞形態大小及藻液中細胞數量的具體狀況, 分別各取鈍頂螺旋藻SP1藻液80 mL、40 mL、20 mL和15 mL置于50 mL離心管, 綠色顫藻OC1和牟氏角毛藻CM1的藻液取樣量則設為800 mL、400 mL、200 mL和100 mL, 其余操作均與螺旋藻樣品相同。利用大容量冷凍離心機(J-26XP, Beckman coulter), 16128 g, 4℃離心10 min, 棄上清收集藻泥沉淀, 并反復3次對藻泥沉淀以無菌生理鹽水進行振蕩重懸、清洗、離心。最終獲得的藻泥沉淀置于-80 ℃冰箱預冷4 h, 用冷凍干燥機(Alpha 1-4, Christ)將藻泥沉淀凍干至粉末狀, 再以分析天平(BS224S, Sartorius)對微藻凍干粉樣品進行準確稱重。

1.3 微藻生物質氮磷碳的檢測

分別各稱取三種微藻的凍干粉10 mg, 以100 mL的容量瓶和無菌生理鹽水進行定容, 制備濃度為0.1 mg·mL-1的微藻干粉標準使用液。各取標準使用液0 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL, 再以100 mL的容量瓶進行定容, 獲得分別含有微藻凍干粉0 mg、0.1 mg、0.2 mg、0.4 mg、0.6 mg、0.8 mg的溶液樣品。參照GB/T 12763.4—2007方法測定樣品中的總氮和總磷, 參照GB 17378.4—2007方法測定總碳。

1.4 數據分析

采用Microsoft office excel 2016軟件對數據結果進行線性擬合分析, 以單因素方差分析法比較各組數據的差異顯著性, 顯著水平設定為< 0.05。定量分析三種微藻的細胞干重與其TN、TP、TC含量的相關性, 以及不同微藻的細胞數量與其干重的關系, 獲得三種微藻的細胞數量、細胞干重與其藻細胞中TN、TP、TC含量之間的數學方程。

2 結果與分析

2.1 三種微藻的細胞干重與其TN含量的關系

檢測結果顯示鈍頂螺旋藻SP1、綠色顫藻OC1、牟氏角毛藻CM1的細胞干重與其TN的含量均呈顯著的線性正相關關系(<0.05), 它們的數學方程及其判定系數2值分別為= 0.2845+ 0.0044,2= 0.9919;= 0.1242+ 0.0009,2= 0.9912;= 0.1315- 0.0016,2= 0.9955; 其中表示藻細胞的TN含量,表示藻細胞的干重值(圖1和表1)。該結果表明, 隨著微藻細胞干重的增加其細胞中的TN含量也呈線性關系隨之不斷升高。經測定以上三種微藻的TN含量與其細胞干重的比值分別為29.3%、12.6%和12.8%。

2.2 三種微藻的細胞干重與其TP含量的關系

如圖2和表1所示, 鈍頂螺旋藻SP1、綠色顫藻OC1、牟氏角毛藻CM1的細胞干重與其TP的含量均呈顯著的線性正相關關系(<0.05), 它們的數學方程及其判定系數2值分別為= 0.045- 0.0004,2= 0.9988;= 0.00475– 0.00002,2= 0.9941;= 0.0081- 0.0003,2= 0.9911; 其中表示藻細胞的TP含量,表示藻細胞的干重值。這表明隨著微藻細胞干重的增加其細胞中的TP含量也呈線性關系隨之不斷升高。經測定以上三種微藻的TP含量與其細胞干重的比值分別為4.4%、0.5%和0.8%。干重,表示藻細胞數量的log對數值。這表明隨著微藻細胞數量的增長其細胞干重也呈線性關系隨之不斷增加

表1 微藻數量、細胞干重和細胞氮磷碳質量的線性關系方程

圖1 微藻細胞干重與其TN含量的關系

Figure 1 Relationship between dry weight of microalgal cell with their TN content

圖2 微藻細胞干重與其TP含量的關系

Figure 2 Relationship between dry weight of microalgal cell with their TP content

2.3 三種微藻的細胞干重與其TC含量的關系

鈍頂螺旋藻SP1、綠色顫藻OC1、牟氏角毛藻CM1的細胞干重與其TC的含量均呈線性正相關關系(<0.05), 它們的數學方程及其判定系數2值分別為= 0.0526+ 0.0416,2= 0.9398;= 0.0534+ 0.0281,2= 0.9746;= 0.0379+ 0.0134,2= 0.9301; 其中表示藻細胞的TC含量,表示藻細胞的干重值(圖3和表1)。可見, 隨著微藻細胞干重的增加其細胞中的TC含量也隨之不斷升高。經測定以上三種微藻的TC含量與其細胞干重的比值分別為13.6%、11.0%和6.5%。

2.4 三種微藻的細胞數量與其干重的關系

如圖4和表1所示, 鈍頂螺旋藻SP1、綠色顫藻OC1、牟氏角毛藻CM1的細胞數量與其干重之間均呈顯著的線性正相關關系(<0.05), 它們的數學方程及其判定系數2值分別為y = 425.24- 3716.2,2= 0.9938;= 153.16- 1486.8,2= 0.9967;= 50.327- 385.19,2= 0.9981; 其中表示藻細胞的。

圖3 微藻細胞干重與其TC含量的關系

Figure 3 Relationship between dry weight of microalgal cell with their TC content

圖4 微藻細胞數量與其干重的關系

Figure 4 Relationship between microalgal cell quantities with their dry weight

3 討論

微藻可高效消減水體中的氮磷營養鹽含量, 常被用于各種養殖尾水或工業廢水的凈化。有學者報道螺旋藻可使水產養殖尾水中的硝酸鹽氮(NO3--N)、總無機氮(TIN)和磷酸鹽(PO43--P)從初始濃度130.04 mg·L-1、130.85 mg·L-1、10.23 mg·L-1降低至26.53 mg·L-1、70.58 mg·L-1和0.15 mg·L-1, 其最大去除率分別達到79.6%、46.1%和98.5%[14]; 使生豬養殖原廢水中氨氮(NH3-N)、TIN和PO43--P從初始濃度164.11 mg·L-1、184.68 mg·L-1、33.85 mg·L-1降低至83.76 mg·L-1、93.89 mg·L-1、19.83 mg·L-1, 去除率為49.0%、49.2%、41.4%[5]; 使啤酒釀制廢水中的總氮(TN)、總磷(TP)、化學耗氧量(COD)從初始濃度31.13 mg·L-1、2.08 mg·L-1、700 mg·L-1降低至1.70 mg·L-1、0.80 mg·L-1、102 mg·L-1, 去除率為94.54%、61.54%、85.43%[4]; 使乳品廠廢水的TN、TP、COD從初始濃度13.7 mg·L-1、0.376 mg·L-1、110.7 mg·L-1降低至3.2 mg·L-1、0.09 mg·L-1和50.0 mg·L-1, 去除率為76.4%、76.1%和54.8%[6]。可見, 螺旋藻對水體中氮磷凈化效果極為明顯, 具有廣泛的應用前景。

顫藻對尾水的凈化效果同樣顯著, 它可將尾水中的NO3--N、TIN、PO43--P濃度由初始的136.77 mg·L-1、124.32 mg·L-1、11.07 mg·L-1分別降至54.85 mg·L-1、60.12mg·L-1、0.60 mg·L-1[14]。但是絕大部分顫藻會分泌微囊藻毒素, 對養殖生物和人體健康產生嚴重影響[15-16], 存在較大的安全隱患, 因此即使它作為池塘水體中常見的微藻優勢種能對水質起到良好的凈化效果, 還是必須對其加以嚴格防控。角毛藻對水體氮磷的去除效果相對差于螺旋藻和顫藻, 有研究顯示牟氏角毛藻可將集約化對蝦養殖尾水中的NO3--N、TIN和PO43--P從初始濃度9.35 mg·L-1、10.2mg·L-1和1.18 mg·L-1降至0 mg·L-1、0.44 mg·L-1和0.05 mg·L-1; 其去除率為100%、95.7%和95.8%[14]; 葉志娟等的研究結果顯示[7], 用牟氏角毛藻凈化海水魚養殖尾水, 尾水的TN、PO43--P和COD的初始濃度2.212 mg·L-1、0.232 mg·L-1、約35 mg·L-1, 處理后水體的無機氮去除率為90-95%, 磷酸鹽為90%, COD含量基本沒變化。雖然角毛藻對水體中氮磷營養鹽的去除率能達到90%以上, 但它對氮磷去除的絕對數量仍遠不及螺旋藻和顫藻。這可能與不同微藻細胞的生理特征、微藻對水環境的適應性[17-19]及其對光照、溫度等氣候因子的選擇性有關[20-21]。

還有不少學者更為關注微藻的營養組分研究與利用。劉如冰等研究認為螺旋藻的蛋白質含量為42.8%—67.4%[6]; 還有學者認為螺旋藻的蛋白質含量為48.1%—69.3%、糖類為5.4%—10.4%、脂肪為4.4%—5.4%、灰分6.2%—7.4%、粗纖維4.2%, 并且螺旋藻所含氨基酸的種類齊全, 總量可達309.94—505.95 mg·g-1[22-24]。所以, 螺旋藻常被用于開發保健食品和養殖動物的飼料蛋白源替代物[25-26]。雖然角毛藻細胞的蛋白質遠低于螺旋藻, 但其脂肪含量則遠高于后者, 角毛藻的蛋白質含量為11.0%—18.7%, 總脂肪為36.0%—57.1%[27], 所以許多學者將角毛藻作為生物石油的研究對象[28]。總體而言, 對于螺旋藻、顫藻、角毛藻細胞中的氮、磷、碳元素的相關分析則鮮見報道。

由上可見, 目前在微藻與環境營養相關作用方面的研究一方面主要關注于微藻對水體中氮磷營養鹽的凈化效果分析, 通過測定水體中NO3--N、NO2--N、NH3-N、TIN和PO43--P等特定化學形式的氮磷營養鹽含量的變化量來評定其凈化效率; 另一方面則聚焦于通過不同種類營養因子或培養條件的優化控制提高微藻細胞中蛋白質、總脂肪、氨基酸、糖類等營養物質的轉化與積累效率。然而關于微藻細胞中氮、磷、碳元素與其細胞數量的相關性研究卻少見報道。其實, 水體環境中氮、磷、碳元素的化學存在形式具有多樣化特征, 例如NO3--N、NO2--N、NH3-N、TIN、PO43--P、H2PO4-、HPO42-、HCO3-、CO32-等的化學形式在水體中均較為常見, 而且它們之間還會隨各種環境因子的變動而發生頻繁的相互轉化[29]。因此, 在利用微藻吸收環境營養的過程中應基于藻細胞數量的增長狀況探討其所含總氮、總磷、總有機碳的數量變化, 這才能準確評測微藻從環境中究竟獲取了多少數量的營養物質用于其絕對生物量的增長, 對水環境的絕對凈化效應如何, 從而有效避免水環境中元素化學存在形式變動、營養鹽的吸附與沉降、水生生物的呼吸與新陳代謝等眾多背景干擾因子的影響。雖然鈍頂螺旋藻、綠色顫藻、牟氏角毛藻等3種微藻均可通過光合作用途徑, 吸收二氧化碳或碳酸氫根合成有機質, 以供其生長所需。而螺旋藻和顫藻作為藍藻種類, 有研究表明在自然的開放水域環境中藍藻能通過固氮效應, 從空氣中攝取氣態氮進行固氮營養[30]; 微生物學領域則將藍藻定義為藍細菌, 認為它們不僅可營光能自養生活還可在一定條件下營異養生活從環境中吸收溶解態有機營養[31]。但無論以上3種微藻通過何種營養方式進行生長, 它們的增殖終歸需要從外界環境中攝取碳氮磷營養元素。基于此, 該研究的焦點是探討在適宜的恒溫光照純培養條件下, 以上3種微藻細胞中所含氮、磷、碳的含量狀況, 通過建立細胞干重與其碳、氮、磷含量的線性關系方程, 說明隨著藻細胞的增殖它們可從外界環境中吸收碳氮磷營養元素的絕對質量關系。其次, 通過逐步分析構建“藻細胞氮磷碳質量——藻細胞干重——活藻細胞數量”的關系方程, 還可為后續進一步研究測算將以上3種微藻進行規模化培養用以吸收環境中碳氮磷營養的效果提供基礎參考。

該研究結果顯示, 鈍頂螺旋藻、綠色顫藻、牟氏角毛藻的細胞干重CDW值與其所含TN、TP、TC的質量間均存在顯著的線性正相關關系(<0.05), 而且細胞數量與CDW之間也同樣呈顯著的線性正相關關系(<0.05), 由此可用其數學回歸方程推算隨著以上三種微藻細胞數量的增長, 它們從水體環境所吸收氮、磷、碳的絕對數量。此外, 該研究還顯示鈍頂螺旋藻細胞中的TN、TC、TP含量占其CDW的比值分別為29.3%、13.6%和4.4%, 均遠高于牟氏角毛藻, 這也與上述學者報道螺旋藻的高蛋白質含量特征相吻合。由此推算, 每獲得干重1 g的鈍頂螺旋藻SP1, 它可從環境中吸收氮元素293 mg, 碳元素136 mg、磷元素44 mg; 換而言之, 若以1000 m3的零換水集約化養殖池系統為例, 在其水體中按103個·mL-1濃度接種鈍頂螺旋藻SP1, 培養10天左右當它的藻細胞密度增長至108個·mL-1數量水平時, 可獲得干重約11.1kg的螺旋藻, 進而從環境中吸收氮元素3.3 kg、碳元素1.5 kg和磷元素0.5 kg用于微藻細胞的生長增殖; 按對蝦養殖周期90天計算, 對所培養的螺旋藻進行實時采收并進行利用[32], 那么一個養殖季即可通過螺旋藻的培養獲得干重約99.9 kg的螺旋藻, 并從環境中吸收氮元素29.7 kg、碳元素13.5 kg和磷元素4.5 kg。可見, 選擇螺旋藻用于水產養殖水體環境的凈化, 可實現水中氮、碳、磷等營養元素的高效吸收, 或將之與有機質降解菌、硝化功能菌等進行科學配伍, 應該能有效解決水環境中微生物對水質凈化不充分的難題[33]。

4 結論

鈍頂螺旋藻SP1、綠色顫藻OC1、牟氏角毛藻CM1等三種微藻的細胞CDW與其所含TN、TP、TC的質量間均存在顯著的線性正相關關系(<0.05), 其中在與TN、TP關系的數學回歸方程中線性擬合程度優于TC; 同時, 三種微藻的細胞數量與CDW之間亦呈顯著的線性正相關關系(<0.05)。鈍頂螺旋藻細胞中的TN、TC、TP含量占其CDW的比值分別為29.3%、13.6%和4.4%, 均遠高于綠色顫藻和牟氏角毛藻(<0.05)。

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Relationship between cell quantity of three microalgae with their carbon, nitrogen and phosphorus

CAO Yucheng1,2,3, SUN Zhiwei1, XU Yu1,2,3, HU Xiaojuan1,2, SU Haochang1,2, XU Wujie1,2, WEN Guoliang1*, LU Min1, YU Zhaolong3,4

1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment, Guangzhou 510300, China 2. Shenzhen Base South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shenzhen 518121, China 3. Maoming Branch of Guandong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture, Maoming525400, China 4. Guangdong Guanlida Marine Biology Co., Ltd., Maoming 525400, China

In order to evaluate the relationship between the cell quantity and the contents of total nitrogen (TN), total phosphorus (TP) and total carbon (TC) in,and, which were dominant microalgal species in aquaculture pond, the microalgae were pure cultured in biological incubator with constant temperature and illumination respectively, and cell quantity were determined continuously. Microalgal cells were collected by centrifugation and freeze-dried to prepare dry powder, the cells dry weight (CDW) and the contents of TN, TPandTCalso were accurately measured. Based on the measured data, the mathematical equations were established on quantitative relationship between CDW and the contents of TN, TP and TC, as well as the relationship between microalgal cell quantity and CDW. There was significant linear positive correlation between CDW of the three microalgae with their contents of TN, TP and TC (< 0.05); the linear fit degree in the mathematical regression equation of TN and TP was better than that of TC; meanwhile, the cell quantity of three microalgae also was linear positive correlation with CDW significantly (< 0.05). The ratio of TN, TC and TP to CDW incells was 29.3%, 13.6% and 4.4% respectively, which were much higher than those ofand.

;;; total nitrogen; total phosphorus; total carbon

10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.04.024

X703.1

A

1008-8873(2022)04-204-08

2021-10-28;

2021-12-09

國家重點研發計劃(2020YFD0900401); 中國水產科學研究院基本科研業務費專項資金(2020TD54); 財政部和農業農村部: 國家現代農業產業技術體系(CARS-48); 廣東省現代農業產業技術體系創新團隊建設專項資金(2019KJ149); 中國水產科學研究院南海水產研究所中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目(2021SD08)

曹煜成(1979—), 男, 浙江東陽人, 博士, 研究員, 主要從事水產健康養殖和養殖生態環境調控研究, E-mail: cyc_715@163.com

通信作者:文國樑, 男, 研究員, 主要從事水產健康養殖研究, E-mail: guowen66@163.com。

曹煜成, 孫志偉, 徐煜, 等. 三種微藻的生物量與其細胞氮磷碳的相互關系[J]. 生態科學, 2022, 41(4): 204–211.

CAO Yucheng, SUN Zhiwei, XU Yu, et al. Relationship between cell quantity of three microalgae with their carbon, nitrogen and phosphorus[J]. Ecological Science, 2022, 41(4): 204–211.