8 種香辛料抑菌效果比較及丁香抑菌機理分析

米 婷 馮 艷 苑本玲 王 婷 李雪莉 張曉娟，2*

（1.成都師范學院化學與生命科學學院，四川 成都 611130；2.成都師范學院食品發酵研究所，四川 成都 611130）

食品防腐劑主要通過對微生物細胞亞結構產生不利影響來達到抑制其生長的目的，可被分為化學合成防腐劑與天然防腐劑，前者作用效果佳 ，但大多具有富集作用以及潛在的致畸致癌性。天然香辛料是一類芳香植物的根、莖、葉、果實或花蕾等，不僅具有提香、賦味、增進食欲的功能，且在食品抑菌防腐方面，具低毒副作用、抗菌譜廣、易獲取、無污染、不易產生耐藥性等優點。

本文選用8 種食用香辛料，對抑菌活性進行比較，并進行抑菌機理分析，為天然香辛料在食品防腐保鮮中的開發利用提供理論支持。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

香辛料：大蒜、丁香、花椒、肉桂均購于四川省成都市溫江區紅旗連鎖超市；白芍購于四川省成都市箐山地道無硫食材店；千佛竹根姜購于四川省閬中市菜市場。

主要培養基：牛肉膏蛋白胨培養基、LB 培養基。

實驗試劑：堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

旋轉蒸發器RE-52 上海亞榮生化儀器廠；循環水式多用真空泵SHB-III 型 蘇州江東精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香辛料提取物的制備

香辛料提取物制備流程如下：

粉碎→浸泡→超聲波提取→離心→真空抽濾→旋轉蒸發濃縮→原液

減壓抽濾后用旋轉蒸發儀進行濃縮，密封后保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 香辛料的抑菌活性比較

將已活化的菌種用生理鹽水稀釋制成 1×106 CFU/mL 菌懸液。牛津杯內加入200 μL 不同香辛料提取物，放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，以無菌水作陰性對照，以30%H2O2作陽性對照。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定

以大腸桿菌為指示菌，按文獻方法進行MIC 的測定。

1.2.4 丁香提取物對大腸桿菌細胞膜通透性的影響

1.2.4.1 丁香提取物對大腸桿菌培養液總漏出率的影響

將大腸桿菌懸浮于 5 %葡萄糖溶液中，取 8.44 mL，加入丁香提取原液1.56mL，置于恒溫搖床中培養7.5 h，每隔1.5 h，取菌懸液，3000 r/min 下離心8 min，用紫外分光光度計在600 nm 波長下測上清液的吸光值，試驗重復3 次。對照組不加丁香提取液。

1.2.4.2 丁香提取物對大腸桿菌細胞膜的損害程度

取 大 腸 桿 菌 LB 培 養 液20 ml，4800 rpm 下 離 心10 min，棄去LB 培養基，用磷酸鹽緩沖液洗滌一次，再懸浮于0.02 mol/L、pH 6.6 磷酸鹽緩沖液中，使重懸液在600 nm 下吸光度約為0.65。丁香提取液加入大腸桿菌重懸液中，使丁香提取物的終濃度為5 MIC。置于37℃搖床中培養，間隔45 min 取菌懸液測定260 nm處的吸光度。陰性對照為不添加丁香提取物的磷酸緩沖重懸液，試驗重復3次。

式中:為含有丁香提取液的試驗組在各取樣時間點的OD 值;為含有丁香提取液的試驗組在0 h 時的OD 值;為陰性對照組在各取樣時間點的OD 值。

1.2.5 丁香提取物對大腸桿菌細胞壁的影響

每隔1.5 h，4800 r/min 離心10 min 收集上清液。 根據堿性磷酸酶(AKP) 測定試劑盒的方法步驟測定胞外AKP活性。

2.結果與分析

2.1 8 種香辛料的抑菌效果比較

由表1 所示，大蒜、丁香、白芍、肉桂的抑菌效果較優：丁香對大腸桿菌的抑制作用最強，DIZ 達23.33±0.29 mm；白胡椒、竹根姜、花椒和辣椒的抑菌強度相對較弱。

表1 8種香辛料對E．coli的抑菌圈（DIZ）大小

2.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定

選取抑菌效果較好的丁香、肉桂、大蒜、白芍進行MIC 的測定。由圖1 可得，4 種供試香辛料中，丁香對大腸桿菌的抑制效果最好，MIC 為3.125 mg/ml。

圖1 香辛料對大腸桿菌的最小抑制濃度

2.3 丁香提取物對大腸桿菌細胞膜通透性的影響

2.3.1 丁香提取物對大腸桿菌培養液總漏出率的影響

如圖2 所示，對照組大腸桿菌總漏出率隨時間延長有增加趨勢，但幅度較小；而丁香提取物處理的對照組，大腸桿菌總漏出率與時間呈正相關，且增幅較對照組顯著，丁香醇提物可破壞細胞膜的通透性，表現為胞內在600 nm 有特征吸收的小分子物質外漏。

圖2 丁香提取物對E．coli總漏出率的影響

2.3.2 丁香提取物對大腸桿菌細胞膜的損害程度

胞內的核酸物質在260 nm 下有特征吸收，通過測定上清液在260 nm 下的吸光度，運用式ξ 計算得到的比值越大，表明核酸物質泄漏量越大，即細胞膜的損傷程度越大。由圖3 可得，丁香提取物對大腸桿菌細胞膜有一定程度的損害，且其損害程度隨時間延長而增加，但總體而言，損害性較輕微。

圖3 丁香提取物對E．coli細胞膜的損害程度

如表2 所示，經丁香提取液處理7.5h 后，大腸桿菌總漏出率與對照組的差異顯著，其為對照組的5.54 倍；經丁香提取液處理3h 后， 大腸桿菌核酸大分子溶出量是對照組的1.27倍，對照組與處理組之間具有差異的顯著性。

表2 丁香提取液處理后對大腸桿菌胞內物的影響

丁香提取物處理后，大腸桿菌菌體細胞膜受到了一定程度的破壞，細胞膜通透性增加，進而導致部分內含物流出、菌體細胞的生長代謝紊亂，最終抑制細胞生長。

2.4 丁香提取物對大腸桿菌細胞壁的影響

從表3 可得，經丁香提取液處理7.5 h 后，胞外AKP活力是對照組的8.11 倍，具差異的顯著性；如圖4 所示，試驗組的胞外AKP 活力與時間正相關，伴隨時間的延長，AKP 活力增強；未經過丁香提取物處理的對照組，其上清液AKP 活性較低且趨于穩定。由此推之，丁香提取物處理后，大腸桿菌的細胞壁受到了破壞。

圖4 E．coli胞外AKP酶活力的變化

表3 丁香提取液處理后對E．coli 胞外AKP活力的影響

3.結論

8 種四川香辛料對大腸桿菌均有不同程度抑制活性，其中大蒜、丁香、白芍、肉桂的抑菌效果更明顯：丁香對E.coli 的抑制作用最強，DIZ 達23.33±0.29 mm；肉桂和大蒜次之，其DIZ 分別達21.67±0.29 mm、21.33±0.29 mm；白芍對大腸桿菌的DIZ 為15.73±0.25 mm。白胡椒、竹根姜、花椒和辣椒的抑菌強度相對較弱，抑菌直徑為9.17±0.17 ～13.17±0.29 mm。

經5 MIC丁香提取液處理7.5 h后，大腸桿菌總漏出率、胞外AKP 活力與對照組相比均有顯著差異，分別增加了5.54 倍、8.11 倍；經5 MIC 丁香提取液處理3 h 后， 大腸桿菌核酸大分子溶出量是對照組的1.27 倍，對照組與處理組之間具有差異的顯著性，丁香提取物能破壞大腸桿菌細胞膜。