基于氣相色譜-質譜聯用代謝組學技術研究保元湯對血虛證小鼠的影響

張藝帆， 繆瀟瑤， 肖炳坤， 楊建云， 董藝普， 黃榮清*

(1.軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所， 北京 100850； 2.廣東藥科大學中藥學院， 廣州 511436)

保元湯源自明代孫志宏所著《簡明醫彀》，全方組成為：人參一錢，黃芪二錢，甘草五分，肉桂二分，加生姜一片，水煎服。人參、黃芪大補元氣，扶助心氣；甘草炙用，甘溫益氣，通經利脈，行血氣；肉桂辛熱補陽，溫通血脈，全方以益氣、補虛、培元為主，主治元氣虛弱之證。《張氏醫通·祖劑》將此方列為補氣類諸方之首[1]，并被《古代經典名方目錄(第一批)》所收錄。研究表明，保元湯具有保護心血管系統的藥理活性，可用于治療冠心病[2]、心肌梗死[3]和慢性心衰[4]等心血管疾病，對心肌細胞具有一定保護作用[5-6]。同時該方可調節免疫功能[7]，抗缺氧[8]，臨床上常與他方合用治療氣虛血瘀引起的多種病癥[9-10]。

目前有關中藥復方的療效及優勢大多來源于臨床經驗的總結。代謝組學通過考察生物體受到外界刺激或擾動前后的變化，追溯至代謝通路和代謝網絡，進而闡明疾病的發生發展及藥物的作用機制[11]，強調系統的整體性和動態性。基于疾病和藥物干預下的代謝網絡的變化來評價中藥復方的整體效應[12]，其全景式、綜合性和整體互動性與中藥多組分、多靶點、整體調節的特點不謀而合。代謝組學已越來越多被應用到中藥配伍的藥效研究中[13]。

血虛證是指因血液虧虛，臟腑、經絡、組織失于濡養而表現出來的虛證，是中醫臨床常見證候之一[14]。目前僅依靠單一成分或生化指標難以全面解釋血虛證治療機制。研究表明，環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)通過殺傷免疫細胞(特別是白細胞)從而導致機體免疫功能低下[15]，注射CTX可顯著抑制動物胸腺、脾臟功能[16]，改變小鼠血清代謝輪廓[17]。現采取腹腔注射CTX建立免疫抑制模型，模擬中醫癥候血虛證的病理情況，選擇四物湯作為陽性對照藥[18]，運用基于氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)的代謝組學技術觀察造模后小鼠代謝輪廓的改變，對保元湯在血虛證小鼠模型中的干預作用以及相應的差異性代謝物進行研究。從分子水平分析代謝通路并闡述其作用機制，進而評價中藥復方保元湯治療血虛證的整體藥效，以期為古典名方的現代開發和應用提供一定的參考，在中醫治療血虛證及代謝通路的闡釋方面具備一定的新穎性和前瞻性。

1 儀器、試藥與實驗動物

1.1 儀器

GCMS-QP2010SE氣相色譜與質譜聯用儀(日本島津公司)，NV-15G 氮氣吹干儀(成都塞斯特儀器儀表有限公司)，LGJ-25C冷凍干燥機(四環科學儀器有限公司)，高速冷凍離心機(美國賽默飛科技有限公司)，BC-2600Vet獸用全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療國際股份有限公司)。

1.2 藥品與試劑

紅參、黃芪(廈門半山農網絡科技有限公司)，肉桂(亳州市永剛飲片廠有限公司，批號：200824)，炙甘草(安徽道源堂中藥飲片公司，批號：200501)，四物顆粒(四川吉泰安藥業有限公司，批號：1911043，規格：5 g/袋)。

注射用環磷酰胺(德國Baxter Oncology GmbH公司，批號：6C105A，規格：0.2 g/瓶)，庚烷、甲氧胺鹽酸鹽購自TCI上海化成工業發展有限公司，雙三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、甲醇、乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司，普通氮氣(純度≥99.2%)、高純氦(純度≥99.999%)購自北京環宇京輝京城氣體科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級昆明種(KM)小鼠48只，雄性，4～6周齡，體重18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。飼養溫度為23～25 ℃，飼養環境濕度為45%±10%。

2 方法

2.1 保元湯方劑制備

參考《古代經典名方目錄(第一批)》中保元湯的配比(一劑中含人參3 g、黃芪9 g、炙甘草3 g、肉桂1.5 g, 共計16.5 g)。取紅參75 g、黃芪225 g、炙甘草75 g、肉桂37.5 g，加10倍水浸泡過夜，沸騰后改文火煎煮1 h，倒出藥液，第二次和第三次煎煮加8倍水，文火煎煮1 h，合并藥液，過濾、濃縮至每1 mL藥液含1 g生藥的保元湯樣品，冷卻分裝，4 ℃保存備用。

2.2 模型建立與給藥

雄性KM小鼠48只，采用隨機數字表法分為空白對照組(NC)、模型組(M)、陽性對照組(PC，2.0 g/kg)、保元湯低劑量組(BY-L，2.0 g/kg)、中劑量組(BY-M，6.0 g/kg)和高劑量組(BY-H，12.0 g/kg)，每組8只。適應性飼養3 d后，參照文獻[19]方法，采用腹腔注射CTX(80 mg/kg，連續3 d，1次/ d)的方法建立小鼠血虛證模型，空白對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

給藥組小鼠每天灌服對應藥物，空白對照組與模型組給予等量生理鹽水，灌胃量為0.1 mL/10 g，1次/d，從造模第一天起，連續給藥14 d，試驗期間自由飲水、攝食，每日記錄小鼠體重。

2.3 樣本采集與處理

末次給藥30 min后，尾靜脈采血20 μL進行血常規分析，摘眼球取全血。全血4 ℃靜置2 h后，12 000 r/min 離心15 min，移取血清置-80 ℃保存待分析。取胸腺和脾臟進行稱重, 分別計算胸腺及脾臟指數。100 μL血清樣本室溫解融后，加入1 200 μL甲醇，充分渦旋30 s，超聲10 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液200 μL至2 mL玻璃瓶中，氮氣吹干，加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，渦旋混勻，置70 ℃水浴鍋中加熱。1 h后取出，待冷卻至室溫，加入BSTFA+TMCS(99∶1)50 μL，渦旋30 s，再次于70 ℃水浴鍋中加熱1 h。冷卻后加入正庚烷100 μL，渦旋混勻，0.22 μm濾膜過濾，濾液置進樣瓶中待分析。

2.4 GC-MS分析參數

Rtx-5MS毛細管柱(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)進樣口溫度：280 ℃，分流比為10∶1，載氣：He(99.999%)，流速：1.0 mL/min；程序升溫：初始溫度80 ℃，保持5 min，然后以4 ℃/min的速度升溫至300 ℃，保持10 min；進樣量：1 μL。電子轟擊離子源溫度：230 ℃，轟擊能量：70 eV，倍增電壓：1.0 kV；四級桿溫度150 ℃；質譜掃描離子范圍：50～1 000m/z；溶劑切除時間：4 min。

2.5 數據處理

將GC-MS譜圖數據以“. cdf”格式輸出，在XCMS online數據平臺進行峰識別與對齊，譜圖濾噪，基線校正，保留時間校正等處理，獲取的數據矩陣導入SIMCA 14.1軟件，結合總離子流圖(total ionchromatograms, TIC)中峰信息，以主成分分析(principal components analysis, PCA)對變量進行降維并將其聚類，繪制主成分分類圖，采用偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)篩選變量投影重要度(variable important projection, VIP)>1.0的變量為可能的差異性代謝標志物。

2.6 差異性代謝物鑒定

結合質荷比(m/z)與色譜保留時間(RT)等參數，對比NIST17質譜數據庫、KEGG(https: //www. genome. jp/kegg/)、HMDB(https: //hmdb. ca/)和SMPDB(http://www.smpdb.ca/)等在線數據庫對可能的差異性代謝物進行確認，利用MetaboAnalyst 5.0(https: //www. metaboanalyst. ca)網站對鑒定出的差異代謝物進行代謝通路分析。

3 結果與分析

3.1 一般行為學觀察

空白組小鼠行動敏捷，被毛有光澤，眼睛轉動靈活，鼻唇潔凈、濕潤，呈淡粉紅色。模型組小鼠均出現精神萎靡、行動遲緩，口唇顏色蒼白，飲水量增多，進食減少等癥狀。相比模型組，保元湯組小鼠相關癥狀有所緩解。

3.2 保元湯對小鼠體重的影響

分別計算各組小鼠體重變化率r，公式為

r=(W2-W1)/W1×100%

(1)

式(1)中：W2為實測體重；W1為起始體重。

如圖1所示，除空白組外，接受CTX注射的各組小鼠體重明顯呈下降趨勢，造模結束后隨給藥天數增加體重逐漸恢復上升趨勢，但始終低于空白組。其中保元湯中劑量組和陽性對照組與空白組最為接近。

圖1 小鼠體重14 d變化趨勢Fig.1 Body weight growth rate of mice during 14 days

3.3 血常規分析及臟器指數

如表1所示，模型組小鼠外周血中白細胞(WBC)數量與空白組相比顯著下降(P< 0.01)，單核細胞比例也明顯降低(P< 0.05)，中性粒細胞比例顯著上升(P< 0.01)，與模型組相比，各給藥組小鼠外周血白細胞數量與單核細胞比例均有不同程度的升高。如圖2所示，與空白組相比，模型組小鼠胸腺和脾臟均出現代償性增大，表明注射CTX對小鼠免疫器官產生了影響，對應的胸腺及脾臟指數明顯增加(P< 0.001，P< 0.05)，小鼠血虛證模型建立。陽性對照組、保元湯中劑量組和保元湯高劑量組胸腺及脾臟指數有所降低，其中以保元湯中、高劑量組較為明顯。以上結果提示保元湯可提高CTX造成的免疫抑制小鼠白細胞數目、單核細胞比例和中性粒細胞比例，緩解CTX所致的免疫器官受損。

表1 各組小鼠血常規指標對比

與NC組對比，*P<0.05, **P<0.01；與M組對比，#P<0.05, ##P<0.01；數據以平均值±標準差表示，每組小鼠樣品數量n=8圖2 各組小鼠臟器指數對比Fig.2 Comparison of spleen and thymus index

自上而下依次為空白組、模型組、陽性對照組和保元湯中劑量組圖3 各組血清樣品典型總離子流圖Fig.3 Typical total ion chromatograms of serum samples in different treated groups

3.4 差異性代謝物的篩選

圖4 多元統計分析結果Fig.4 Multivariate statistical analysis results

3.5 基于代謝組學分析保元湯對CTX誘導的血虛證小鼠的影響

為進一步評價保元湯對環磷酰胺所致免疫抑制型血虛證小鼠的治療作用，將歸一化處理后的各組GC-MS血清數據輸入MetaboAnalyst 5.0進行多元統計分析。如圖5所示，PLS-DA得分圖顯示各給藥組與模型組區分良好且遠離模型組，接近空白組，表明各給藥組對血虛證模型均具有一定的干預效果。其中保元湯中劑量組相比其他劑量給藥組更接近空白組且遠離模型組，結合血常規和臟器指數，表明保元湯中劑量組干預CTX所致血虛證效果較好，因此下一步以3.4節部分篩選出的差異性代謝物為指標，觀察保元湯中劑量各代謝物水平的變化，結果顯示，給予保元湯可以顯著上調機體內甘油、肌醇、硬脂醇、亞油酸、油酸水平，下調乳酸、草酸、2-酮丁酸、棕櫚酸、硬脂酸水平。

1為空白組；2為模型組；3為陽性對照組；4為保元湯低劑量組；5為保元湯中劑量組；6為保元湯高劑量組圖5 PLS-DA分析結果Fig.5 PLS-DA loading plot of different treated group

3.6 代謝通路分析

利用MetaboAnalyst 5.0對表2中的10個潛在差異性代謝物進行代謝通路的富集分析，得到14條代謝通路，通路分析影響值如圖6所示。以影響值(impact)>0.1為判定標準，其中3條受到較大擾動，如表3所示。綜合上述研究結果并對相關文獻進行分析，推測保元湯干預小鼠血虛證模型較為密切的3條代謝通路為亞油酸代謝、甘油酯類代謝和磷酸肌醇代謝。

a為亞油酸代謝；b為甘油酯類代謝；c為磷酸肌醇代謝圖6 代謝分析影響值Fig.6 Metabolic analysis impact value

表3 血虛證小鼠受擾動的代謝通路

4 討論與結論

采用腹腔注射CTX復制以白細胞減少為標志的小鼠血虛證模型，考察了低、中、高3個劑量的保元湯對血虛證小鼠的治療作用，并以免疫細胞數、免疫器官臟器指數等指標初步評價保元湯的藥效。胸腺和脾臟是機體主要的兩個免疫器官，其臟器指數能反映機體免疫功能[20]。保元湯可使血虛小鼠臟器指數下降，緩解CTX所致的胸腺及脾臟受損。保元湯中、高劑量組小鼠血清中白細胞數、單核細胞數等顯著回升，表明保元湯可改善CTX誘導的血虛證，恢復機體免疫功能。

表2 潛在差異性代謝標志物及其相對峰強度變化

代謝組學研究結果顯示，血虛證小鼠體內受較大擾動的代謝通路有亞油酸代謝、甘油酯代謝和磷酸肌醇代謝，涉及的差異性代謝物為亞油酸、甘油和肌醇。與正常組相比，模型組中乳酸、草酸、2-酮丁酸、棕櫚酸、硬脂酸的含量顯著升高，乳酸、草酸、2-酮丁酸、棕櫚酸、硬脂酸的含量顯著下降，上述10個化合物可能是與血虛證相關的潛在差異性代謝物。

亞油酸是一種不飽和脂肪酸，是生長發育的必需脂肪酸，參與構建細胞膜，對細胞信號傳導、基因表達調節等有著重要的影響，有助于降低血清膽固醇和抑制動脈血栓的形成，作用機制與花生四烯酸類似[21]，其含量降低可能與造血干細胞的壞死和凋亡有一定的關系[22-23]。GC-MS血清代謝組學研究發現，模型組小鼠血清中亞油酸和油酸含量下降。保元湯給藥組通過上調亞油酸減輕氧化應激反應，緩解血虛癥狀。

甘油酯是甘油和脂肪酸經酯化所生成的酯，在機體內負責貯存能量與輸送。甘油作為重要小分子物質，是甘油三酯的前體，參與多條代謝通路如甘油酯類代謝、甘油磷脂類代謝等。代謝組學結果表明，模型組小鼠血清中甘油含量顯著下降，游離脂肪酸如硬脂酸、棕櫚酸等含量上升，推測血虛證可能干擾機體甘油酯類合成，保元湯給藥組對應物質含量恢復正常水平。

肌醇可降低膽固醇含量，并參與磷酸肌醇代謝，生成肌醇三磷酸和二酰基甘油，后者通過升高細胞內鈣和激活蛋白激酶而發生一系列生理生化反應[24]。作為許多二級信使的前體分子，肌醇由葡萄糖合成，是磷脂酰肌醇的組成部分，廣泛分布在動植物和微生物體內。肌醇代謝的穩定對于維持機體正常生理功能至關重要。模型組小鼠的肌醇顯著下降，保元湯可提高血虛模型小鼠的肌醇含量趨于正常。

綜上，首次從代謝組學角度探討了中藥復方保元湯對血虛證的影響并對相關的代謝通路進行了分析，一定程度上可反映血虛證小鼠代謝水平的變化。鑒定出的差異性代謝物以脂肪酸類物質為主，發現保元湯對血虛證小鼠體內3條紊亂的代謝通路均有較好的調節作用。中醫理論認為，氣能生血、行血，血能養氣、載氣，兩者互為陰陽，故氣虛一般均會導致血虛。CTX可使脾氣虧虛，無力生化血液，進而表現出血虛的一系列癥狀。保元湯善補元氣，補氣的同時亦能補血。采用中醫證候動物模型與代謝組學相結合的研究方法，借助生化指標評價其藥效，有助于系統了解機體的病理生理過程，較好地契合了中醫學“整體觀念，辨證論治”的理論。并為進一步研究中醫“血虛證”的本質提供參考和借鑒。