ZIF-8遞送生物大分子的研究進展

李亞紅，王 劍，羅 鋒

(四川大學華西口腔醫院，四川 成都610041)

1 前 言

金屬有機骨架材料(metal organic frameworks，MOFs)是由金屬離子(簇)和有機配體通過配位作用形成的，是具有無限網絡框架的晶體材料[1, 2]。類沸石咪唑酯骨架材料(zeolitic imidazolate frameworks，ZIFs)是MOFs的一個亞類，主要由鋅或鈷與咪唑配體反應形成。ZIFs具有較大的比表面積、高孔隙率、可調節的表面性質、優異的機械性能以及良好的化學和熱穩定性[3]，近來廣泛應用于氣體捕獲[4]、分離[5]、化學傳感器[6]、藥物輸送[7-9]和催化[10]領域。目前已報道了90余種ZIFs結構，ZIF-8是其中代表性結構之一。

2006年，Huang等[11]首次通過水熱法、利用Zn2+和2-甲基咪唑合成了具有類沸石拓撲結構的MOFs,并命名為ZIF-8。ZIF-8獨特的結構特點(類沸石結構)和優異的性能使其可作為運載體運輸各種客體物質，如抗腫瘤藥物和抗菌藥物[12]、蛋白質[13]、酶[14]、光敏劑[15]以及成像劑和光熱劑[16]。以往，主要將ZIF-8作為藥物載體構建載藥體系，近年來，將蛋白質、核酸等生物大分子封存在ZIF-8中用于生物催化和生物醫學工程引起了科研人員廣泛的興趣。本文綜述了ZIF-8負載生物大分子如蛋白質、酶、核酸等的優勢和應用研究，并對其在相關生物醫學領域的應用進行了展望。

2 ZIF-8的結構特點和合成方法

ZIFs是MOFs的一個子類，是一種新型的結晶型多孔材料，它結合了沸石和MOFs的優良性能，如高結晶度、高孔隙率、高比表面積以及優異的熱穩定性和化學穩定性。ZIFs化合物與沸石的骨架結構非常相似，沸石中的T-O-T橋(T=Si，Al，P)被M-Im-M橋(M=Zn，Co)所取代，且兩種結構的鍵角均為145°(圖1)[3]。ZIF-8的晶體結構模型如圖2所示[17]，為核殼結構，具有直徑為11.6 ?的大孔，大孔與周圍直徑為3.4 ?的小孔相通，并且ZIF-8屬于立方空間群，晶胞尺寸為16.32 ?[18]。

圖1 金屬咪唑(1)和沸石 (2) 的鍵角[3]Fig.1 Bonding angles in metal imidazoles (IMs)(1) and zeolites (2)[3]

圖2 ZIF-8的晶體結構(Zn用三棱錐多面體表示，N用球表示，C用線表示)[17]Fig.2 Crystal structure of ZIF-8(Zn is represented by polyhedrals, N is represented by spheres, and C is represented by lines)[17]

ZIFs的合成方法有很多，如一鍋法、膠體化學合成法、溶劑熱反應法、微波反應法、聲化學法、機械化學法、干膠法和微流體法等。其中，經典的合成方法是一鍋法，該方法是將六水硝酸鋅[Zn(NO3)2·6H2O]溶解在甲醇中形成鋅基溶液，然后將2-甲基咪唑和甲醇組成的溶液添加到鋅基溶液中，劇烈攪拌即可合成ZIF-8[19]。

3 ZIF-8負載生物大分子的機理

3.1 一鍋法(one-pot embedding)合成ZIF-8@生物大分子復合體

ZIF-8大孔直徑為11.6 ?，小孔直徑為3.4 ?，多數生物大分子體積較大，無法通過擴散進入ZIF-8的孔隙中。因此，常通過一鍋法合成ZIF-8@生物大分子復合體。一鍋法是將ZIF-8的前體(即2-甲基咪唑和Zn2+)和生物大分子，有時加入其他促進生物包埋過程的功能性添加劑(如聚乙烯吡咯烷酮，PVP)，混合在一起攪拌加熱，在該反應過程中，ZIF-8的結晶成核和對生物大分子固定是同步進行的，這也被稱為“原位包埋”策略，通常包括共沉淀和生物礦化2個過程[20]。生物大分子固定化可以發生在ZIF-8的內部和表面，通常伴隨著交聯。此合成方法多在溫和條件下發生，以保證被包埋大分子在固定化過程中保持良好的活性。

3.2 ZIF-8負載的客體分子入胞及釋放機制——內體逃逸機制

內吞途徑是生物制劑(如DNA、siRNA和蛋白質)主要的攝取機制。這些顆粒通過內吞作用入胞，胞膜包裹顆粒形成囊泡，囊泡在向溶酶體移動的過程中，依次形成早期內體(early endosome，pH為5.5～6.5)和晚期內體(late endosome，pH為4.5～5.5)，最終進入溶酶體，在溶酶體中發生活躍的酶降解過程[21]。在此過程中，這些粒子若實現內體逃逸，則可進入細胞質或者細胞核中發揮作用，反之，則被溶酶體的酶降解[22]，如圖3所示。因此，實現有效生物治療的重要步驟是促進內體逃逸和確保藥物的胞質輸送。

目前，主流的內體逃逸學說有質子化效應(proton sponge effect，也稱為pH緩沖效應)、內膜孔形成、內膜融合、內質體膜的光化學破壞[23]。ZIF-8中含有咪唑基，可以通過質子化效應介導內體逃逸。通常內體的酸性環境是由腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase，ATPase)介導的，該酶可將質子從細胞質中主動轉運到內體。ZIF-8中的咪唑基會緩沖內體的酸性，阻止其酸化，因此，ATPase將更多的質子輸送到內體以維持所需的pH值,這種質子的流入伴隨著大量氯離子的涌入。內體的高離子濃度最終會導致水從細胞質中進入，從而引起滲透性腫脹和內體破裂，從而將復合物釋放到細胞質中。

3.3 ZIF-8 pH敏感的原理

ZIF-8在中性條件下穩定，降解速率很低。有研究表明,將ZIF-8置于pH為7.4的中性磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)儲存11 d后，溶液中不存在Zn2+，其負載的客體大分子也不會被釋放出來。通過向該體系中添加稀釋的HCl，將PBS的pH值從7.4逐漸酸化至5.0，發現短時間內溶液中Zn2+濃度迅速增加(超過98%的Zn2+被釋放)，包裹的客體分子釋放，該過程模擬了從血液循環到內體和溶酶體部分的轉移過程[24]。ZIF-8 pH敏感的原理是，酸性環境破壞鋅和咪唑酸鹽之間的配位鍵，ZIF-8結構崩解，客體物質被釋放。

圖3 治療性藥物通過內吞入胞及后續的內體逃逸示意圖[22]：(i)早期內體由囊泡組成，囊泡中含有來自細胞表面的治療藥物；(ii)晚期內體接受從早期內體中內化的物質；(iii)在內吞途徑的最后一步，溶酶體含有水解酶，可消化晚期內體內的內容物，因此，在被溶酶體介導消化之前，治療藥物需要從內體中釋放出來Fig.3 An artistic representation depicting the internalization of therapeutics into the cell through endocytosis and subsequent endosomal escape[22]：(i)early endosomes consisted of vesicles containing therapeutics coming from cell surface；(ii)late endosomes which are thought to mediate a final set of sorting events prior to interaction with lysosomes, receive the internalized materials from early endosomes；(iii)lysosomes as the last part of the endocytic pathway contain hydrolytic enzymes which digest the contents of late endosomes, therefore, the endosomal release of the therapeutics is necessary before lysosome mediated digestion of the therapeutics

4 ZIF-8負載蛋白質保持蛋白質的生物學活性

蛋白質作為構成生物體至關重要的生物大分子，在生物體中發揮多種功能，如運動功能、運輸功能、機械支持和保護功能、免疫和防御功能等。然而，蛋白質結構靈活，對環境應激源敏感，在各種刺激因素作用下，構象易改變，不僅導致其生物活性降低，甚至可能引起不利的免疫反應[25]。因此，如何高效保存蛋白質的生物活性成為亟待解決的問題。近來研究表明，ZIF-8作為一種納米多孔MOFs，可負載多種蛋白質進而保持其生物學活性[26]。通常情況下，由于蛋白分子的尺寸較大，無法直接將其包裹在ZIF-8的小孔隙中，因此常通過原位合成(一鍋法)的方式，將蛋白質包裹在ZIF-8內部形成結晶中心，從而保護蛋白質免受各種刺激的干擾。

4.1 ZIF-8負載治療蛋白

治療蛋白因其高度特異性在生物醫藥領域受到廣泛關注，在癌癥、代謝紊亂、自身免疫性疾病、心血管疾病防治領域應用廣泛，而且還可作為蛋白信號分子參與各種信號轉導和免疫應答[27]。研究證實，ZIF-8可用于負載各種難以處理、儲存、運輸的治療蛋白。例如，胰島素作為一種治療蛋白，臨床應用廣泛，但其儲存條件為2～8 ℃，這一要求限制了其在資源有限的環境中的應用。Wang等[26]通過將胰島素溶液與2-甲基咪唑和乙酸鋅的水溶液混合(圖4a)，在溫和的水熱條件下將胰島素封裝到ZIF-8晶體中(圖4b)，使胰島素可以免受高溫、有機溶劑和機械攪拌的影響(圖4c和4d)。體內實驗也證實，胰島素保持了良好的生物學活性。此外，也有學者證實，ZIF-8還可負載各種生物流體中的蛋白。例如，Wang等[28]使用尿液NGAL和血清/血漿CA-125作為模型蛋白質生物標志物，實驗表明ZIF-8可以在室溫下負載尿液、血清、血漿和血液中的蛋白質生物標志物，且具有與制冷方法(在-20 ℃下冷凍液體樣品)相當的保存效果。Peng等[13]開創性地將穩定性較差的血紅蛋白(Hb)包裹在ZIF-8中，與游離的血紅蛋白相比，ZIF-8包裹的血紅蛋白在堿性、氧化、高溫或酶環境中均表現出顯著的穩定性，可以更好地用于各種氧相關疾病的治療。

此外，ZIF-8具有pH響應性，酸性環境下其結構會崩解，負載的客體物質被釋放，這一性質與腫瘤的酸性微環境相匹配。近期研究表明，ZIF-8可負載各種蛋白協同抗癌治療。例如，溶細胞肽蜂毒素(MLT)是一種重要的抗癌藥物，然而，由于其溶血等非特異性毒性，臨床應用受到嚴重限制。Li團隊[29]構建了負載MLT的ZIF-8(MLT@ZIF-8)納米粒子，形成的MLT@ZIF-8納米粒子能有效抑制MLT的溶血生物活性。酸性條件下，MLT在腫瘤細胞中被釋放出來從而殺傷腫瘤。同時，也有研究證實，以抗癌藥物阿霉素(DOX)/牛血清白蛋白(BSA，可增強DOX和ZIF-8之間的親和力)納米顆粒作為核心，在其外表面上涂覆ZIF-8層形成DOX@BSA@ZIF-8復合體，該復合體與純DOX相比，可顯著提高抗腫瘤效果[30]。

圖4 使用ZIF-8封裝胰島素以抵抗各種環境應激源對胰島素結構和生物學活性的影響[26]：(a)將胰島素溶液與2-甲基咪唑和乙酸鋅的水溶液混合；(b)將胰島素包埋在ZIF-8中，形成懸浮液 ；(c)懸浮液經過高溫、攪拌或有機溶劑處理；(d)保存的胰島素可以在1 min內從ZIF-8晶體中釋放出來Fig.4 Schematic illustration depicting the use of ZIF-8 encapsulation for preserving insulin structure and bioactivity against various environmental stressors[26]:(a)mixing insulin solution with aqueous solutions of 2-methylimidazole and zinc acetate;(b)embedding insulin in ZIF-8;(c)the suspension of insulin-embedded ZIF-8 was subjected to elevated temperatures, agitation, and organic solvent；(d)the preserved insulin can be released from ZIF-8 crystals within 1 min

還有研究通過將葡萄糖氧化酶(GOx)和天然血紅蛋白包裹在ZIF-8中，實現了基于芬頓(Fenton)療法和饑餓療法的聯合腫瘤治療[31]。

4.2 ZIF-8負載蛋白信號分子參與免疫應答

ZIF-8除了可以負載一些治療蛋白外，還可以運載蛋白信號分子，參與免疫應答。CpG寡核苷酸(ODNs)是一種蛋白信號分子，通過刺激Toll樣受體9(TLR9)激活免疫系統，誘導Th1應答。因此，CpG ODNs已經成為治療包括癌癥、過敏和感染在內的各種疾病的免疫療法必須用藥物。然而，由于CpG ODNs容易被DNA酶降解，細胞攝取效率低下，其應用在很大程度上受到了限制。為了突破該限制，Zhang等[32]首次將CpG ODNs包裹到ZIF-8納米顆粒中，構建了一種新型CpG ODNs遞送系統。該遞送系統在生理環境下穩定，在酸性條件下CpG ODNs被有效釋放，與TLR9定位的內溶酶體相對應，激活免疫應答。

這里將以上提到的ZIF-8負載蛋白的應用總結在表1中。

表1 ZIF-8@蛋白質復合體的優異性能和應用

5 ZIF-8負載酶使其固定化，提高其催化性能

酶作為廣泛存在于動植物和微生物中的生物大分子催化劑，可促進生物物質在生命系統中的生物轉化[33]。酶的不穩定性導致其在高溫、機械應力、過度酸堿、不相容的有機溶劑、變性劑或表面活性劑等極端條件下失去催化性能[34, 35]。為了解決游離酶的上述缺點，固定化、人工修飾、蛋白質和酶工程、溶劑工程等方法被廣泛采用，其中酶固定化已被證明是一種簡單而有效的策略。酶固定化法是指將酶通過吸附、鍵合、交聯或包埋等方式定向固定或包埋在所選載體的特定區域，并保持其催化活性以進行有效催化[36]。研究表明，酶固定化可以提高酶的活性、穩定性和選擇性，從而實現酶在生化工業實踐中的成功應用。ZIF-8作為新型酶固定化載體，因其具有高孔隙率、高比表面積和孔體積、較高的化學/熱/機械穩定性等獨特性質而受到越來越多的關注。

5.1 原位合成ZIF-8@酶復合體

2014年，Lyu等首次利用原位合成法實現了細胞色素c(cytochrome c, Cytc)在ZIF-8中的固定化[14]。在經典合成過程中，將PVP修飾的Cytc的水溶液與含有六水硝酸鋅和2-甲基咪唑的甲醇溶液混合，然后探針超聲1 min，室溫孵育24 h(圖5a)。PVP作為功能性添加劑不僅可以促進Cytc在甲醇溶液中的懸浮和穩定，還有助于觸發Cytc@ZIF-8復合物的形成，控制其大小和形狀[37]。TEM結果表明，Zn2+和2-甲基咪唑前驅體首先形成絮體或棒狀(圖5b)，最后形成菱形十二面體晶體(圖5c)。這種原位組裝的Cytc@ZIF-8納米復合材料具有與原始ZIF-8相同的微觀形貌。蛋白質負載量計算結果表明，制備的納米復合材料中Cytc的質量分數約為8%，包封率為82.3%。煅燒實驗結合TEM和SEM圖像證實，大多數酶固定在ZIF-8底物的表面，而不是嵌入到內部。在相同的酶濃度下，原位固定化Cytc的比活力比游離的Cytc高10倍。

圖5 ZIF-8固定細胞色素c(cytochrome c, Cytc)的策略[14]：(a)Cytc@ZIF-8復合材料的合成示意圖；(b)反應5 min后得到的Cytc@ZIF-8復合材料的TEM照片,(c)反應24 h后得到的Cytc@ZIF-8復合材料的TEM照片Fig.5 Strategy for immobilization of Cytc by ZIF-8[14]:(a)a schematic showing the synthesis of Cytc@ZIF-8 composite; (b) TEM image of Cytc@ZIF-8 composite obtained after reaction for 5 min, (c) TEM image of Cytc@ZIF-8 composite obtained after reaction for 24 h

此外，ZIF-8具有酸性環境下pH響應性，該性能使其可負載一些對pH敏感的酶，在酸性環境下，ZIF-8崩解，里面負載的酶被釋放出來發揮作用。例如，Zhong等[38]合成了氧化鐵@ZIF-8@胰蛋白酶復合物，在pH為9.4的反應體系中，ZIF-8在氧化鐵周圍生長，與胰蛋白酶的固定化同時發生，被包埋胰蛋白酶的活性顯著提高。此外，氧化鐵@ZIF-8@胰蛋白酶可作為固定化酶微反應器快速高效地消化蛋白質和復雜的人血清樣品，在蛋白質組學分析中具有廣闊的應用前景。

5.2 ZIF-8包埋酶的優勢

5.2.1 增強催化活性

在過去幾年里，許多報道表明，在選定的條件下，ZIF-8固定化酶比游離狀態的酶表現出更好的催化活性，這通常表現為底物轉化率的提高[39]。在許多情況下，固定化酶可以在一定程度上避免酶聚集或構象變化。在相同的酶濃度下，如Lyu等所報道的，ZIF-8固定化Cytc的活性比溶液中的游離Cytc高10倍[14]，這可能是因為ZIF-8固定化Cytc對過氧化氫分子具有更好的底物親和力，而合適的微環境也可能有助于底物親和力的提高。此外，有研究表明，包埋方式會影響ZIF-8中酶的生物活性。Chen等[40]研究表明，當ZIF-8被酶觸發快速成核時，酶可以保持較高的活性；而當ZIF-8對酶的包埋是由緩慢的共沉淀驅動，且酶不參與ZIF-8的成核時，由于配體2-甲基咪唑在水中質子化，使環境呈強堿性，從而導致酶趨于失活。

5.2.2 增強穩定性和可回收性

ZIF-8@酶復合物穩定性依賴于ZIF-8載體的內在穩定性，包括化學穩定性、熱穩定性和機械穩定性[3]。金屬和有機連接物、配位鍵合強度、界面的親水性和疏水性、拓撲結構和表面結構、實際操作環境等多種因素都對ZIF-8的穩定性有重要影響。Liao等[41]將過氧化氫酶(CAT)包埋到ZIF-8中，然后將包埋的CAT和游離的CAT均暴露在變性劑(即尿素)和高溫(80 ℃)下，結果發現，包埋型CAT在尿素和80 ℃下仍能保持生物學功能，而游離CAT未檢測到活性。也有研究證實，ZIF-8負載GOx使酶活力保存率高達50%[42]。此外，與游離狀態相比，固定化酶更容易從底物或產物中分離出來，有利于回收操作。

5.2.3 增強底物選擇性

ZIF-8因具有特定的大小和孔結構，可以對底物產生尺寸選擇效應，能夠排斥大尺寸底物，從而提高固定化酶的底物專一性。Chen等[40]合成了ZIF-8@GOx，用于快速監測葡萄糖，他們發現，這個檢測系統對其他類似的單糖，如果糖、甘露糖和半乳糖無反應，表明在葡萄糖檢測中具有優越的選擇性。另外，對葡萄糖檢測可用GOx & HRP復合酶：葡萄糖氧化酶GOx將葡萄糖轉化為葡萄糖酸，并產生過氧化氫，過氧化氫作為辣根過氧化物酶HRP的底物，通過反應可生成一種可在415 nm波長光下檢測到的物質，GOx & HRP檢測體系對葡萄糖也表現出較高的選擇性[43]。

總之，通過原位合成的方法構建ZIF-8@酶復合體對酶進行固定化，可以提高酶的催化活性，增強其穩定性和可重復利用性，還可以提高其對底物的選擇性。而且，由于原位包埋對固定化酶的大小沒有限制，直徑大于ZIF-8孔徑的酶也可被封存，這大大擴大了固定化酶的選擇范圍。同時需要注意的是，在合成ZIF-8@酶復合體時，反應條件應較溫和以保持酶的結構和活性。這里將文中提到的ZIF-8負載酶的應用總結在表2中。

表2 ZIF-8@酶復合材料的優異性能和應用

6 ZIF-8負載核酸實現基因治療

基因治療是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償缺陷和異常基因的表達，從而達到治療各種遺傳病、惡性腫瘤和心血管疾病的目的[44]。常見的核酸藥物包括質粒DNA、小分子量干擾RNA(si-RNA)和反義寡核苷酸(ASOs)等。然而在生理條件下，細胞膜表面的磷脂雙分子層僅允許帶低電荷或者不帶電的疏水小分子通過，因此分子量巨大甚至帶有高電荷的核酸藥物在沒有其他條件協助下，很難通過細胞膜轉染進入細胞[45]。近來有研究表明，ZIF-8作為一種運載體，可負載核酸藥物轉染入胞并通過內體逃逸使基因得以表達[46]。

2019年，Poddar等[46]首次把整個質粒DNA(6.5 kb堿基對)成功封裝在ZIF-8中,該質粒攜帶編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因,可用于后續檢測。實驗證實，ZIF-8作為載體可成功攜帶質粒DNA穿過細胞膜，在核攝取之前完成內體逃逸以表達基因。也有其他學者證實，通過仿生礦化和共沉淀法，將質粒DNA包埋到ZIF-8和ZIF-8聚合物載體中，可實現質粒DNA高效率的基因表達[47]。

此外，ZIF-8還可用于酶和RNA的共傳遞。CRISPR/Cas9作為基因組編輯平臺，包括兩個功能性生物大分子，一個是Cas9重組酶，另一個是示蹤劑/單引導RNA(sgRNA)。自2012年CRISPR/Cas9基因組編輯平臺在實驗室出現以來，如何將CRISPR組件輸送到生物體內成為了首要問題。2018年，Alsaiari團隊[48]首次合成了由ZIF-8包裹的CRISPR/Cas9(ZIF-8@CRISPR/Cas9，簡稱CC-ZIFs)，其可以控制完整的Cas9蛋白和sgRNA的共傳遞(圖6)。2020年，該團隊[50]在原有基礎上，用人乳腺癌細胞膜包封ZIF-8@CRISPR/Cas體系，使之可以只被特定癌細胞攝取，而健康細胞的攝取忽略不計，實現了細胞特異性靶向遞送。此外，也有研究表明，ZIF-8還可有效負載si-RNA使其成功轉染入胞，并保護siRNA免受核酸酶的降解[50]。上述研究為ZIFs負載核酸提供了參考。總之，ZIF-8作為運載體，可包封DNA、RNA等核酸大分子，轉染入細胞后并通過內體逃逸釋放至胞漿或者進入細胞核內發揮作用。現將文中提到的ZIF-8負載核酸的應用總結在表3中。

7 結 語

ZIF-8作為MOFs的一個子類，具有孔徑大、穩定性好、比表面積大等優點，有作為運載體的潛力，能夠裝載蛋白質、酶、核酸等生物大分子，一般通過一鍋法(原位合成)將生物大分子包埋到ZIF-8中。本文綜述了ZIF-8負載、遞送生物大分子的應用研究，如ZIF-8封裝蛋白質并在體內完成釋放，使其發揮生物學功能；封裝酶使其能夠抵抗強酸、強堿、高溫等惡劣條件的影響，增強其催化活性、穩定性、選擇性和可回收性；封裝核酸使其能夠轉染入細胞，并在核攝取之前實現內體逃逸以表達基因。

圖6 ZIF-8@CRISPR/Cas9(CC-ZIF)的制備、胞溶遞送和基因編輯[48]：(a)將帶負電的Cas9/sgRNA包裹在帶正電的ZIF-8中，形成CC-ZIFs，(b)CC-ZIFs的內體逃逸，(c)CC-ZIFs處理前后細胞的共聚焦激光掃描顯微(confocal laser scanning microscopy，CLSM)照片Fig.6 Preparation, cytosolyic delivery and gene editing of ZIF-8@CRISPR/Cas9[48]: (a) encapsulating the negatively charged Cas9/sgRNA within positively charged ZIF-8 to form CC-ZIFs, (b) endosomal escape of CC-ZIFs, (c) CLSM images of cells before and after treatment with CC-ZIFs

表3 ZIF-8 @核酸復合體的優異性能和應用

盡管ZIF-8在負載生物大分子領域有顯著的優勢，但這一新興領域仍處于發展不成熟階段，還存在許多問題需要研究和解決，例如ZIF-8的生物相容性較差，需通過多種途徑對其進行改進；對ZIF-8與生物大分子之間確切的相互作用機理的認識局限阻礙了ZIF-8@生物大分子的合理設計。但不可否認的是，ZIF-8及其復合物作為新型運載遞送系統，已表現出良好的應用前景。在未來的研究中，可更多地探索ZIF-8運載不同類型的蛋白質、酶和核酸藥物，并使其在生物體內發揮功能，實現在醫藥領域的應用。